文摘

沙眼衣原体性传播感染的主要原因是在世界范围内,负责各种免疫病理变化与生殖健康相关。推迟了促炎趋化因子的分泌白介素8 (IL)是衣原体感染的一个特征,依赖于衣原体增长。我们检查了铁螯合剂的作用引发生产229年海拉(子宫颈epitheloid细胞,CCL2)细胞感染c . trachomatis。引发生产引起的铁螯合剂柴油和Mimosine,然而,协同与衣原体感染得到了柴油。时间的表达促炎细胞因子分泌IL-1beta, tnf,引发不显示同步沙眼衣原体受感染的细胞。从海拉细胞分泌引发感染c . trachomatis不依赖于il - 1β和肿瘤坏死因子-α诱导。这些结果表明对铁参与衣原体诱导引发生产。

1。介绍

沙眼衣原体是最常见的女性性传播病原体导致严重的后遗症包括盆腔炎、异位妊娠、不孕症(1- - - - - -4]。c . trachomatis能够广泛的真核细胞内感染和繁殖,包括巨噬细胞、平滑肌、上皮和内皮细胞5]。衣原体感染粘膜表面的上皮细胞产生促炎的因素如白介素(IL) 1、il - 6、引发IL-11, GRO -和集落刺激因子(6- - - - - -8),从而导致由中性粒细胞浸润为特征的一种急性炎症反应的主要网站感染,后跟一个牙龈感染单核白细胞在慢性阶段积累(9- - - - - -11]。这些细胞反应促进细胞增殖和组织损伤的影响器官(12]。大部分的入侵细菌病原体往往诱发快速但瞬态响应(13]。与此形成鲜明对比的是c . trachomatis感染诱发延迟促炎反应尤其引发生产上皮细胞和依赖于细菌复制(7,14,15]。除了肿瘤坏死因子-α(TNF -)和IL-1beta (il - 1)已报告是最强大的诱导引发多种细胞系,细胞内病原体的主要贡献者在清关过程中(16,17]。

细菌铁螯合剂(desferal去铁胺甲磺酸)触发炎症信号,包括生产的科学家在人类肠道上皮细胞趋化因子引发(iec)通过激活ERK1/2和p38激酶通路(18]。衣原体进入持久性阶段iron-chelating药物(Desferal)的存在,从而显示其依赖铁完成发育周期(19]。持久性也可以诱导抗菌和色氨酸饥饿青霉素G和干扰素引起的分别为(20.- - - - - -22]。早期的模型c .肺炎持久性干扰素-后显示和青霉素治疗chlamydia-induced引发表达被抑制,虽然熬夜的监管iron-depletion [23]。为了发展适当的治疗方案,有必要定义激活途径,铁螯合控制引发感应衣原体感染。

因此,本研究旨在揭示(i)的参与细胞内铁衣原体诱导促炎细胞因子引发的生产从229年海拉细胞和(2)自分泌TNF -的影响和il - 1在生产中引发的c . trachomatis在铁剥夺条件下感染细胞。

2。材料和方法

2.1。材料

所有的生化产品从Sigma-Aldrich购买(美国圣路易斯)除非另有提到:(i)去铁胺甲磺酸(柴油)上的铁螯合剂;(2)Mimosine-a植物性铁螯合剂;(3)枸橼酸铁铵(FAC)铁源;(iv)葡萄糖氧化酶(去)氧化剂;氧化(v) DETA-NANOate-nitric生产商;二硫代氨基甲酸(vi) Pyrrolidin (PDTC)氧化氮抑制剂;(七)Ebselen-antioxidant。

2.2。传播的沙眼衣原体

海拉229子宫颈epitheloid细胞(CCL2)中维护EMEM包含10g / mL庆大霉素和补充10%胎牛血清。进一步的海拉细胞保持50厘米²培养瓶被感染c . trachomatis型D传播。60小时后postinfection感染细胞刮,用(30周期的0.6/0.4秒)释放基本身体(EBs)其次是离心3000 xg去除细胞碎片。上层清液含EBs是纯化的不连续梯度Renograffin(施贵宝制药、加拿大蒙特利尔)如前所述[24]。纯化基本身体(EBs)在等张resuspended sucrose-phosphate-glutamate (SPG)缓冲区和存储。纯化EBs的传染性是滴定计算衣原体包涵形成单位(IFUs) 229年海拉的单层细胞生长在一个96孔板。

2.3。感染

Subconfluent单层的海拉细胞12孔板接种EBs在多样性的感染(moi) 2。2小时的盘子被震撼同质感染后细菌细胞外被洗涤了磷酸缓冲盐(PBS)。随后在媒体Delbecco最低基本细胞培养(美国圣路易斯σ)含10%胎牛血清(PAA实验室GmbH,派斯克,奥地利),10μg / mL庆大霉素(美国圣路易斯σ),g / mL两性霉素B(美国圣路易斯σ)和孵化在5%的公司₂环境。感染后2小时,细胞治疗与0.5毫米去铁胺(柴油),1毫米mimosine, 0.5毫米枸橼酸铁铵(FAC)最终浓度在不同井与各自的控制。进一步DETA-NANOate(1毫米)和葡萄糖氧化酶(10 U /毫升)与柴油相结合,增加了Mimosine和前沿空中管制官。抗氧化剂ebselen(2.5毫米)和PDTC(1毫米)添加相应井及其控制和分析与48上层清液的快乐指数。上层清液的模拟和CT感染细胞收集在6日12日,24日,30日,48岁,72,和96居民,离心机(轮值表4 r-b / F, Plastocraft,孟买,印度)在12000 xg(10分钟,),储存在直到细胞因子测定。

2.4。细胞因子检测使用ELISA

分泌细胞因子的水平(引发,TNF -α和il - 1)在文化上清液测定使用酶联免疫试剂盒(美国罗克福德皮尔斯生物技术公司和(美国圣地亚哥eBiosciences))的检出限2 pg / mL, 4 pg / mL,和8个pg / mL。所有的分析都是在重复执行根据制造商的指示。

2.5。统计分析

使用GraphPad棱镜进行统计分析软件(版本5.0)。统计学意义的差异进行双向重复测量的方差分析(方差分析)其次是Bonferroni期末测验。每个实验做两次,一式三份。

3所示。结果

3.1。外生引发的高水平c . trachomatis海拉229人感染细胞

引发水平显著增加在文化的上层清液c . trachomatis感染细胞相比,模拟感染细胞。进一步观察引发水平的显著增加c . trachomatis感染细胞除了铁螯合剂去铁胺(柴油)。与时间有关的研究水平的显著升高引发12 hpi分泌物检测,在c . trachomatis感染细胞相比,控制(模拟海拉细胞感染)。进一步控制细胞两座山峰被认为在24和72居民在30 hpi代表两相的曲线,而在c . trachomatis感染细胞分泌引发水平代表一个单相曲线显示持续显著增加水平从12到72年hpi的快乐指数(图1)。

3.2。引发独立于外源性il - 1的分泌β和肿瘤坏死因子-α在衣原体感染的细胞

时间的表达il - 1和肿瘤坏死因子-评估确定引发诱导这些细胞因子的参与。有显著增加在分泌TNF水平在文化上清液在早期(6、12和18 hpi)和后期阶段(72年和96年hpi)(图2),而il - 1水平升高30(图的快乐指数3)。然而,midphase的c . trachomatis增长,分泌TNF水平拒绝,而il - 1β水平没有任何偏离基准面(数字2和3)和肿瘤坏死因子-的分泌物,il - 1,引发不显示协同作用在不同的时间点。

3.3。引发表达式与铁螯合剂柴油Mimosinec . trachomatis受感染的海拉细胞

Mimosine,基于植物的铁螯合剂,显示感应6 hpi的引发c . trachomatis海拉细胞被感染而出现柴油有延迟(12 hpi)诱导和时间间隔(图是相一致的4)。逐步增加引发表达检测,最高30 hpi随后拒绝在48(图的快乐指数4)。

3.4。衣原体诱导引发生产是由活性氮物种在铁限制条件(评估48 hpi)

引发产量显著增加在c . trachomatis海拉细胞感染与DETA-NANOate刺激后(图5)。进一步显著增加(,图5)是引发生产模拟和CT感染细胞中观察到在co-stimulation柴油和没有。然而柴油添加剂效果和NANOate显著更高在CT感染的细胞(图5)。此外葡萄糖氧化酶诱导引发生产无论CT感染或模拟(,图5)。Ebselen, PDTC减少引发的生产条件和更高的抑制(,图5)观察PDTC(图5)。

4所示。讨论

衣原体感染等性传播或呼吸道疾病频繁发生;然而,这些疾病往往是温和的。因此,他们经常通过认可和未经处理的。这些主要是轻度急性感染可以作为起点的其他慢性疾病,如与不孕输卵管炎症,或反应性关节炎c . trachomatis(25- - - - - -27]。衣原体感染疾病的结果主要是由炎症介质和引发领好战。引发的高水平取决于衣原体增长(7),据报道,去铁胺诱导的持久性,引发仍然高水平(23]。这些观察提出问题如果衣原体直接参与引发感应或者细胞内铁水平也是一个贡献者?

在我们的研究中观察到c . trachomatis海拉229人感染细胞,分泌引发显著增加(现病史)现病史在12到72相比,模拟感染细胞显示从而可能参与早期阶段的衣原体分化和代谢活动负责感应和引发的分泌。这是按照之前的研究(28]中显示c . trachomatis和c . psittaci调节mRNA的表达和分泌的促炎细胞因子如引发,GRO、gm - csf和il - 6的分泌。进一步引发生产229年海拉细胞感染c . trachomatis明显延迟(从24 hpi),与大多数入侵微生物,促进快速但短暂的炎症反应(7]。引发的高水平可能有助于在粘膜上皮细胞表面免疫细胞与专业沟通针对致病的侮辱。

进一步观察,引发感应独立于TNF -α和il - 1β在c . trachomatis海拉229人感染细胞。之前的研究也表明TNF -α和il - 1作为引发costimulatory信号感应NF -B依赖途径(29日]。衣原体包含一个尾巴丝氨酸蛋白酶(Tsp),选择性地劈开p65 / RelA NF -亚基B可能干扰宿主炎性反应(30.]。在最近的一项研究中肿瘤坏死因子受体1的低水平观察细胞表面的衣原体感染细胞,抑制TNF介导的信号(31日)从而吸引TNF -的可能性和摘要意思β独立引发的表情c . trachomatis海拉229人感染细胞。

我们还表明,衣原体感染与柴油协同行为激活引发分泌。细胞内的可用铁可以调节炎症介质在几个细胞类型和调节炎症过程。两个重要信号通路由p38和ERK1/2所需DFO-induced引发分泌(18,32- - - - - -34]。引发的c . trachomatis已被证明是依赖p38和小君氨基端MAPK的ERK和独立35从而显示衣原体感染和柴油为引发激活遵循相同的课程。然而,进一步的研究涉及p38的转录后的柴油机制诱导引发或ERK是十分必要的。

在我们的研究中DFO-induced引发增加了DETA-NANOate和H₂O₂尽管刺激程度小于在海拉细胞感染的c . trachomatis。据报道,没有是初始因子介导的信号级联引发基因转录活化柴油。NF -B也引发生产的一个重要转录因子在癌症细胞。PDTC, NF -最有效的抑制剂之一B,抑制一氧化氮诱导引发基因(36]。它可能阐明,没有引发感应中扮演重要的角色c . trachomatis感染细胞处理柴油。

在c . trachomatis感染细胞,Mimosine治疗显示逐步增加和随后的减少引发的表情。相反,延误引发的感应和一致的表达表达与柴油观察。只观察协同柴油有细菌来源,表明细胞内铁水平中发挥着重要作用诱导的炎性反应。进一步它可能表明对铁封存的参与机制不稳定的衣原体起源和收购铁铁池。本研究的结果表明细胞内铁参与激活引发229年衣原体感染的海拉细胞。

确认

作者要感谢印度医学研究理事会(),印度的金融援助的Vardhan奖学金的形式和印度大学拨款委员会(UGC),提供奖学金Rishein古普塔Hemchandra Jha和Apurb Rashmi Bhengraj。这项研究是由印度医学研究理事会资助。