文摘

il - 4是一种抗炎细胞因子,抑制发病和严重程度在不同的实验性关节炎模型。B组链球菌(GBS)被认为是一个日益增长的原因严重侵袭性感染妊娠的成年人。感染性关节炎的临床表现是GBS的感染。探讨il - 4实验GBS感染的作用,il - 4不足或主管给老鼠注射 GBS /鼠标。死亡率,关节炎,GBS器官的增长,地方和系统性的细胞因子和趋化因子的生产检查。il - 4 - / -小鼠显示较低的死亡率,但增加严重的关节炎和表现出较低的微生物负载在血液、肾脏、和关节比wt老鼠。增加当地的il - 1的含量 、il - 6、TNF - ,MIP-1 ,MIP-2陪同在il - 4 - / -小鼠更严重的关节炎。我们的研究结果表明il - 4的有害作用GBS败血症,而它对GBS-induced关节炎起到有益的作用。

1。介绍

B组链球菌(GBS)长期以来一直被称为的一个主要原因危及生命的感染新生儿,婴幼儿和孕妇(1- - - - - -3]。最近这些微生物被认为是一个日益增长的原因严重侵袭性感染妊娠的成年人(4- - - - - -6]。GBS负责广泛的临床表现5- - - - - -9]。最常见的实体包括主要菌血症、皮肤和软组织感染、尿路感染、肺炎。其他相关条件心内膜炎、血管内设备感染、脑膜炎、腹膜炎、endoophthalmitis osteoarticular感染。细菌性关节炎是一种快速进步和人类高度破坏性的关节疾病发病率从0.034%到0.13%不等(10]。这种疾病的典型特点是高烧和红,温暖,和关节肿胀,在80%到90%的情况下显示关节的模式。主要或次要免疫缺陷患者以及那些通过人工关节手术显示增强的易感性脓毒性关节炎(10- - - - - -12]。脓毒性关节炎格林-巴利综合征(GBS)患者妊娠的成人被认为是极其罕见的(13,14),直到1980年代早期,当两个独立的研究强调,其发病率似乎增加(15,16]。这种趋势已经被最近的研究证实在GBS占所有确诊病例的7%到10%的细菌关节炎(17,18]。有趣的是,GBS通常是与多个关节参与糖尿病或癌症患者(17]。

我们以前描述的实验小鼠模型IV型GBS感染临床特征相似感染人类[19,20.]。老鼠给单一静脉注射剂量的GBS开发临床48小时内关节炎的迹象。GBS关节炎的外观和严重性的副产品是多因子的过程。生存能力和数量的微生物和细菌因素(即注入。,presence and amount of capsule, amount of sialic acid in the capsular polysaccharide, and 溶血素生产)已被证明影响关节病变的发展(21,22]。然而,GBS关节炎发病机理的一个至关重要的角色是由炎症细胞(粒细胞和单核细胞)及关节(23,24)和促炎细胞因子的生产,包括白细胞介素- 6 (il - 6) il - 1 和肿瘤坏死因子- (肿瘤坏死因子- )(25]。

抗炎细胞因子il - 4等调节炎症。许多针对调节巨噬细胞il - 4的监管效果的活动。il - 4抑制促炎细胞因子(TNF - il - 1 和il - 12) (26,27和趋化因子(干扰素- 诱导蛋白10和巨噬细胞迁移抑制因子)(28,29日]。体内il - 4的抗炎症活动评估在几个型号的关节炎。它已经表明,il - 4的系统性管理有效地抑制proteoglycan-induced关节炎疾病(PGIA)和胶原诱导的关节炎(CIA) [30.,31日]。治疗与il - 4或当地表达il - 4的情报局阻止软骨和骨破坏32,33]。

我们的研究的目的是评估il - 4的角色在我们的脓毒性关节炎模型,对关节炎的发展过程和主机对细菌的敏感性。为了这个目的,我们使用Balb / c野生型小鼠和Balb / c小鼠il - 4基因中断。

2。材料和方法

2.1。老鼠

Homozygotous il - 4 老鼠,生成所述其他地方(34),请提供了教授Luigina罗姆人,佩鲁贾,意大利佩鲁贾大学。控制wt Balb / c小鼠购自查尔斯河实验室繁殖(Calco、意大利)。还有八到十周大的老鼠被用于实验程序。动物被维护和使用严格的伦理条件下根据欧盟指令的建议没有。86/609 / EEC。

2.2。微生物

IV型GBS,写明ATCC参考应变GBS 3139 (CNCTC 1/82),由j . Jelinkova(布拉格,捷克共和国)中使用。实验感染的微生物在一夜之间长大 C Todd-Hewitt肉汤(Oxoid有限公司,贝辛斯托克,英国汉普郡)然后洗稀释RPMI 1640中(GIBCO,生活技术,意大利米兰)。培养液大小估计turbidimetrically和可行性方面进行镀在胰蛋白酶的大豆琼脂 5%的羊血琼脂(血琼脂),一夜之间在厌氧条件下孵化 c一个细菌悬液制备RPMI 1640中。小鼠静脉注射通过尾静脉注射1 107GBS的体积0.5毫升。控制老鼠注入同样的路线与0.5毫升的RPMI 1640中。

2.3。关节炎的临床评价和死亡率

GBS-infected老鼠评价关节炎的迹象和死亡率。每隔24小时死亡率记录30天。挑战后,老鼠每天检查两个独立观察员(l . T。,M. P.) for 30 days to evaluate the presence of joint inflammation, and scores for arthritis severity (macroscopic score) were given as previously described [26,35]。关节炎被定义为可见的红斑和/或肿胀的至少一个关节。关节炎的临床严重程度分级在0 - 3的规模对于每个爪子,根据红斑和水肿的变化(0 =没有变化;1点=轻度肿胀和/或红斑;2分=中度水肿和红斑;3分=明显肿胀、红斑、和/或关节僵硬)。因此,鼠标可以有一个最大的12分。关节炎指数(的意思 SD)是由分总分(累计值的爪子),各组实验中使用的动物数量。

2.4。组织学评估

GBS-infected小鼠感染后10天检查关节炎的组织病理学特征。每鼠关节炎后爪子(1)被无菌,浸泡在福尔马林溶液10% v / v 24小时然后在三氯乙酸脱钙5% v / v为7天,脱水,把嵌入在石蜡,将在3 - 4 m,与苏木精和伊红染色。盲法条件下样本检查。Tibia-tarseal、tarsus-metatarseal metatarsus-phalangeal关节进行检测时,发现和组织学得分被分配到每一个联合基于渗透的程度(存在炎症细胞在皮下和/或periarticular组织),渗出物(炎症细胞在关节腔的存在),软骨损伤,骨质侵蚀,以及联合建筑的损失。关节炎严重程度被归类为负(没有渗透),轻度(最小渗透),中等(存在渗透、最小的渗出物和完整性的联合体系结构),和严重的(存在大量渗透/渗出物、软骨和骨骼侵蚀,和中断联合架构)。

2.5。GBS增长血液、肾脏、和关节

血液、肾脏和联合GBS-infected老鼠细菌负荷是由菌落接种后(CFU)评估在不同的时间。血样retroorbital窦出血之前获得的老鼠被杀死。RPMI 1640也准备了10倍稀释介质,和0.1毫升的每个稀释血琼脂镀是一式三份,在厌氧条件下培养24小时。菌落的数量决定,结果被表示为菌落的数量每毫升血液中。肾脏是无菌移除和均质3毫升无菌RPMI 1640。所有的手腕和脚踝关节从每个鼠标被移除,称重,在托托在无菌均质RPMI 1640中(1毫升/ 100毫克的联合重量)。均质化后,所有组织样本稀释和镀在血琼脂一式三份,结果被表示为菌落的数量/每毫升的整个器官或联合匀浆。

2.6。为细胞因子评估样品制备

血液样本的不同实验小组通过retroorbital窦出血感染后不同时期之前,老鼠被杀死。血清是储存在 C直到分析。联合组织了如前所述[25]。从每个鼠标简单地说,所有的手腕和脚踝关节被移除,然后均质托托在1毫升/ 100毫克联合的重量溶解介质(RPMI 1640包含2毫米phenylmethylsulfonyl氟化物和1 g / mL最终抑肽酶的浓度、亮抑酶肽和抑肽素A)。均质组织然后在10分钟2000克、离心机和浮在表面的消毒使用微孔过滤器(0.45 米)和存储 C直到分析。

2.7。细胞因子检测

il - 6、il - 1 肿瘤坏死因子- 巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 1 ,MIP-2浓度在生物样品测定与商业ELISA试剂盒购自研发系统(研发系统公司,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国)根据制造商的建议。结果表示为皮克每毫升的血清或上层清液联合匀浆。检测化验的限制1.6 pg / mL il - 6、il - 1 3 pg / mLβ,为MIP-1 1.5 pg / mL ,MIP-2 1.5 pg / mL, TNF - 5.1 pg / mL 。

2.8。统计分析

关节炎指数的差异,菌落的数量,和细胞因子浓度之间的由学生组老鼠进行了分析 以及。kaplan meier生存率较用于数据分析的生存曲线。关节炎的发病率和组织学数据被确切概率法分析。每个实验重复3次。P值小于0。被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。il - 4缺增加死亡率,但减少的严重程度GBS-Induced关节炎

Balb / c小鼠缺陷(il - 4 )或完好无损(wt)对il - 4基因输液注射1 107GBS和临床病程后30天。疾病的严重程度进行评估的存活率和关节炎的临床评分。如图1(一)统计上显著 差异在两个实验小组之间的死亡率。事实上,感染107GBS每鼠il - 4 10%的死亡率 老鼠,而40%的wt老鼠死在观察期间的结束。关节肿胀的临床症状观察早在24小时后注射1 107CFU GBS的两组老鼠。尽管类似频率的关节病变观察il - 4 和wt老鼠(图1 (b)不足),il - 4组有更严重的影响临床关节炎关节,与对照组相比,导致更高的关节炎指数(图1 (c))。整个观测期间显著差异很明显,与最大值达到3.2的感染后10天 0.5 il - 4 老鼠和2.0 0.3 wt动物。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图1
死亡率、发病率和严重的关节炎。IL-4-deficient和wt老鼠感染107GBS /鼠标。发病率死亡率(a)、(b)和(c)的关节炎严重程度评估详细在材料和方法部分2)。十个老鼠用于每个实验组。(一)数据的累积结果三个独立的实验。(b)和(c)数据代表的意思 SD的三个独立的实验。统计实验群体之间的差异都标有星号 。
3.2。组织病理学研究

关节炎的爪子被移除的组织学检查感染1后第十天 107GBS每检查鼠标和关节炎的组织病理学特征。il - 4 5关节炎的爪子 老鼠和BAlb / c小鼠,为每个爪子和3关节组织病理学评分进行评估。两个独立的实验和结果是累积的。如图2,所有的关节控制动物可以分为严重影响。在这一组中,39%的关节被归类为轻度影响,32%,中度影响,29%的人没有任何关节炎的迹象。相比之下,在IL4 老鼠只有5%的关节都是负面的,而大多数的人归类为中等(49%)或严重(31%)的影响。


图2
组织病理学结果。在il - 4 Histophatolgical关节炎严重程度进行评估 老鼠或控制感染后10天。关节炎定义消极、轻度中度或严重的详细在材料和方法部分2)。累积的结果表示两个独立的实验。对于每一个实验组,5关节炎il - 4的爪子 老鼠或控制老鼠被移除,3为每个爪子关节组织病理学评分进行评估。
3.3。降低il - 4的细菌生长 老鼠

体内GBS增长评估2、5、10天后GBS bactaeremia的定量监测和感染细菌生长在肾脏和il - 4的关节 或wt老鼠。如图3,逐步清除血液中的细菌观察wt以及il - 4 动物。然而,值得注意的是 低数量的GBS是il - 4的恢复在血液中 老鼠相比,控制,一旦感染后两天。这样的一个显著差异仍是明显的在接下来的几天。链球菌生长较低也观察il - 4的肾脏 老鼠对控制。十倍的数量差异GBS恢复被发现在所有时间点(图评估5)。最后,正如已经评估肾脏和血液中,细菌il - 4关节的负担 老鼠明显低于控制,一旦感染后2天。累进细菌生长当时观察到关节的实验小组,虽然大大降低细菌负荷仍出现在il - 4 老鼠。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图3
细菌生长在血液、肾脏和关节。IL-4-deficient wt老鼠感染1 107年6GBS /鼠标,血液和器官被移除和加工详细在材料和方法部分2)。的值代表的意思 SD三个独立实验的每个组成20每个实验组小鼠。每组三个老鼠在每个时间点牺牲。结果表示为CFU每毫升血液中,每毫升每整个器官,或联合匀浆。统计实验群体之间的差异都标有星号 。
3.4。局部细胞因子il - 4的缺乏产生Upregulation和Monokine生产

细胞因子所扮演的角色和monokines GBS脓毒症和关节炎的发病机制是明确的24,25]。因此,地方和系统性的il - 6水平,摘要意思 肿瘤坏死因子- ,MIP-1 ,MIP-2 il - 4之间的比较 和控制老鼠2、5、感染后10天。如图4更高水平的促炎细胞因子(il - 6,摘要意思 和肿瘤坏死因子- )检测il - 4的关节 老鼠比控制。在感染后的第二天显著高于只有对TNF -水平明显 生产,但在其他时间点评估成为统计上显著的差异也对il - 6和il - 1 生产。相反,血清促炎细胞因子水平在两组相似,除了TNF - 生产更高的il - 4 老鼠对控件(52 10和11 血清5 pg / mL)在感染后的第二天。也显示出了类似的趋势MIP-2 MIP-1生产两组的老鼠,在第五天值达到峰值后感染。再次,更高水平的il - 4的趋化因子被发现在关节 老鼠比wt动物在所有时间点评估。不同于关节,没有观察到显著差异之间的两个实验小组对系统性MIP-1的生产 和MIP-2(数据未显示)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图4
细胞因子在关节,生产和血清。IL-4-deficient或wt小鼠感染1 107GBS /鼠标。上层清液从联合匀浆,或血液样本收集在指定的时间后感染和肿瘤坏死因子-化验 、il - 6和il - 1 通过ELISA详细在材料和方法部分2)。值的平均 SD三个独立实验的每个组成20每个实验组小鼠。每组三个老鼠在每个时间点牺牲。统计实验群体之间的差异都标有星号 。

图5
趋化因子生产关节。IL-4-deficient或wt小鼠感染1 107GBS /鼠标。上层清液从联合匀浆收集在指定的时间后感染和Mip-1化验 并通过ELISA MIP-2详细在材料和方法部分2)。值的平均 SD三个独立实验的每个组成20每个实验组小鼠。每组三个老鼠在每个时间点牺牲。统计实验群体之间的差异都标有星号 。

4所示。讨论

GBS感染的小鼠模型已经被证明是有利于阐明细菌和宿主因素负责GBS关节炎(19- - - - - -25]。我们先前的研究指出了重要作用等促炎细胞因子il - 6、il - 1 地震,TNF - 在GBS关节炎的发病机制25,36]。在这项研究中,通过使用有缺陷的老鼠,我们发现抗炎细胞因子il - 4相关影响GBS-induced脓毒症和脓毒性关节炎。第一il - 4的缺席对GBS的感染死亡率的降低。这个结果符合论文通过Hultgren et al .,描述了一个有益的影响il - 4的缺乏在实验小鼠模型金黄色葡萄球菌感染(37]。摘要降低死亡率观察il - 4 老鼠增加系统性细菌间隙有关,归因于一个增强吞噬细胞所介导的细胞内杀死能力。已经表明,il - 4的抑制作用于吞噬细胞氧化破裂和胞内杀害利什曼虫(38),抑制腹膜和脾巨噬细胞的死亡白色念珠菌(39]。实际上,在我们的实验模型较低数量的GBS是il - 4的恢复血液和肾脏 老鼠相比,控制,从而表明il - 4对吞噬细胞的抑制作用也在GBS杀死。

il - 4的缺乏也导致关节病变的恶化。这显然是与较低的细菌负荷中il - 4的关节 老鼠对控制。然而,它必须考虑GBS关节炎的严重程度并不完全与关节细菌的数量,但也是由其他参数,包括生产促炎细胞因子和炎性浸润的程度/关节组织渗出液。招聘和激活炎症细胞在感染的网站是一个复杂的动态过程,涉及的协调表达支持和抗炎介质。事实上,尽管炎症反应是至关重要的清除病原体的感染,长期炎症反应可能导致有害的结果(35]。在这方面,有益的影响il - 4已经证明在许多实验模型的关节炎。外源性il - 4管理导致抑制CIA (30.),同时,在相同的实验模型,管理anti-IL4单克隆抗体增强两关节炎的发病率和严重程度40]。日常报道il - 4减少治疗所有疾病参数在链球菌细胞壁(标准铜线)大鼠关节炎模型(41]。PGIA模型、关节炎被阻止il - 4的治疗(31日在il - 4)和加剧 老鼠(27]。在这些老鼠,快速诱导关节炎相似体内促炎细胞因子和趋化因子的分泌增加。众所周知,促炎细胞因子和趋化因子关节炎的发病机制中发挥重要作用。居民滑膜巨噬细胞和成纤维细胞以及渗透细胞产生proiflammatory细胞因子,如肿瘤坏死因子- 、il - 1、il - 6、IL-15 IL-17驱动疾病发病机理(42,43]。这些细胞因子启动一连串的事件,从而诱导cartilage-degrading酶,如metalloproteases和刺激osteoclastogenesis和血管生成44- - - - - -46]。招聘滑膜细胞的组织包括趋化因子,如MIP-1 ,负责招聘的单核细胞和MIP-2作用于中性粒细胞。这些炎症细胞导致关节损伤的细胞因子和蛋白水解酶的生产11]。在我们的模型中,尽管降低il - 4的GBS关节数 老鼠,所有其他参数导致关节病变表现的恶化。事实上,关节疾病与恶化显著增加当地的促炎细胞因子(il - 6、il - 1 和肿瘤坏死因子- )负责关节损伤,加上持续的水平monokines并随之增强炎性细胞涌入。

总之,我们建议il - 4扮演双重角色的GBS感染的免疫反应。一方,通过抑制细胞内吞噬细胞,il - 4可能会导致更严重的全身感染,因此,更高的死亡率。另一边,当地水平的促炎细胞因子和趋化因子表达下调,它似乎对GBS关节炎的发展产生积极影响。

确认

作者要感谢斯特凡诺Temperoni和亚历山德罗Braganti优秀的组织学处理和动物保健技术援助。这项工作是支持的Ministero戴尔'Universita e德拉Ricerca Scientifica 2007 - 2008,普罗特。2007 xyb9t9_002,意大利。