文摘

克罗恩病(CD)是一种多因子的原因不明的慢性炎症性肠病。本研究的目的是探索如果mRNA表达SSTR5 CCR7在CD患者可能与各自的蛋白表达。相比健康的捐赠者,SSTR5是417年过度71次CD外周血单核细胞(PBMCs)。流式细胞仪实验mRNA和蛋白表达之间无相关性SSTR5 PBMCs。为了找到一个如此高的mRNA表达的原因,SSTR5出现在CD PBMCs进行了测试,发现在健康细胞生物活性。肠道组织切片的CD, SSTR5没有过度,但CCR7 PBMCs不变,vegf在10固有层的3倍。共焦显微镜显示CCR7 mRNA和蛋白表达的相关性CD肠活检。强调我们的数据流和图像血细胞计数作为补充无法规避分子生物学以避免错误解读受体表达。一旦确认进一步的大规模研究,我们初步结果显示角色SSTR5 CCR7在CD发病机理。

1。介绍

试图将蛋白质丰度与mRNA表达水平有变量成功。已经提出三个主要理由为穷人mRNA和蛋白水平之间的相关性一般文献中报道(1]。首先,有许多转录后的mRNA转化成蛋白质的机制:转录和翻译之间的一系列复杂的步骤。其次,蛋白质可能在体内半衰期上有本质上的区别:退化或合成的细胞可以控制利率对于一个给定的蛋白质,甚至有显著的异质性在蛋白质也有类似的功能。第三,有大量的错误和背景噪音在蛋白质和mRNA实验,限制我们的能力得到一个清晰的画面。最合理的方式遵循蛋白表达是使用标记抗体能够具体所需的epitop。这是一般应用在免疫印迹,但可以更迅速地揭示了血细胞计数(图片或流)。测试共焦显微镜和流式细胞术的针对性,我们使用这两种技巧来确定蛋白质丰富的生长激素抑制素受体5 (SSTR5)和趋化因子受体CCR7、两个受体,我们发现显著增加在克罗恩病(CD)患者外周血单核细胞(PBMCs)和肠黏膜发炎,分别(正在进行的工作,完整的数据没有公布)。克罗恩病是一种慢性炎症性肠病,这可能影响整个肠道,但往往是位于小肠远端部分(回肠)和/或冒号。当前致病假说表明CD的结果从一个异常的免疫反应对(a)肠道菌群的细菌(s),在遗传上易感宿主2,3]。然而,尽管许多工作检查特定的潜在致病通路或分析pan-genome CD已进行修改,结果往往令人失望,有时相互矛盾的或无法复制的从一个到另一个地方学习。这可能取决于患者群体的异质性和可变性,以及使用的方法和技术方法。因此,确定最可靠的生化和/或生物技术研究的基本特性CD似乎是一个杰出的重要性的初步工作。

本研究的目的是探索如果SSTR5的微分mRNA表达,我们观察到在PBMCs从CD患者,CCR7在CD患者的活检,可以相关蛋白表达进行血细胞计数流或图像。

2。材料和方法

2.1。克罗恩病的病人

十个病人28岁(中值、范围20-42;6女人,4人)呈现结肠()或ileocolonic (参与这项研究)疾病。当时组织样本(血液或肠道黏膜)收集他们的疾病是不活跃(由哈维·布拉德肖指数评估;所有患者4)超过3个月(中位数8、范围3-27)。没有病人表现出临床症状的感染和c反应蛋白浓度测量通常是正常的(在所有病人中5 mg / L)。最后,凳子文化,执行系统,为整个组是负面的。两个病人长期由英夫利昔单抗治疗,3例通过咪唑硫嘌呤,对稳定剂量甲氨蝶呤,所有超过3个月。4名患者没有药物。搭配健康的年龄和sex-matched捐助者被选作比较。这个工作是伦理委员会批准(拉西德保护des人西北二世,亚眠,法国),根据国家指导方针和实施。

2.2。隔离PBMCs和组织收集

外周血单核细胞是通过venopuncture,早上,一夜之间从禁食患者或健康志愿者无偿控制。细胞使用1.077 Ficoll-Histopaque密度梯度离心法分离(如前所述)(4]。他们被激活或不是由脂多糖流产沙门氏菌等(有限合伙人1克/毫升无菌水;0128年σ化学100毫克,沙门氏菌血清型B12) 2小时30分钟。然后,PBMCs离心机,颗粒在液态氮冷冻,保存在。细胞培养上清液冻结了细胞因子的决心。

结肠镜病人健康控制粘膜活检获得的结直肠癌筛查(结直肠癌家族史;无临床症状或生物异常)显示正常的结肠镜检查。在CD患者中,活检获得在结肠镜检查来评估疾病程度严重和/或进展。

一个示例使用每个组织标本的组织病理学研究和样品相同的结肠区域被冻结在D解决方案(5)和存储。在CD患者中,活检一直在粘膜发炎。

2.3。RNA提取

组织在冰解冻15分钟(5]。细胞破碎的无菌活塞在苯酚饱和2 M (pH值4.0)和氯仿乙酸钠/ isoamylic酒精()。涡流后,溶解产物孵化15分钟在冰然后离心20分钟12000 g ()。水相含有RNA是保存和RNA由异丙醇沉淀为一个小时。RNA提取时离心20分钟12000克(与500年),洗70年在12000 g(乙醇,然后离心5分钟与75年)再洗乙醇。RNA提取干在速度休假和resuspended无菌水。

三试剂(分子研究中心,Inc .,辛辛那提,俄亥俄州,美国)被用来隔离从PBMCs RNA (根据制造商的指示细胞)。总信使RNA检查完整性和通过RNA浓度6000 LabChip工具包在安捷伦2100生物分析仪28 s RNA / 18 s RNA的比率必须高于1.6验证样本。纯度是通过阅读获得的260和280海里的吸光度比值(A260 / A280)在1.8和2.0之间来验证样本。RNA完整RNA (RIN)分配完整性值数量测量,评估了每个样本根据施罗德et al。6]。

2.4。实时rt - PCR和聚合酶链反应

五总RNA的反向转录单链cDNA使用高容量cDNA档案箱。RNA是preincubated10分钟,其次是2小时根据制造商的建议(应用生物系统公司,培育城市,加利福尼亚,美国)。随后,cDNA一直在直到使用。在96年的一次井板(微安光学96 -反应,应用生物系统公司),一个整除的cDNA (100 ng /L)在TaqMan普遍PCR反应混合液混合仔细,DEPC水(Euromedex, Souffelweyersheim,法国)和TaqMan Predeveloped测定试剂(美国加州福斯特城PDAR应用生物系统公司,)然后短暂旋转(15秒,2000克)。96井盘子立即用光学胶盖,密封和离心两次σ离心机1分钟2000 g。实时rt - pcr已使用ABI棱镜执行7000(应用生物系统公司,培育城市,加利福尼亚,美国)。热循环进行了2分钟(激活Uralic-DNA糖基化酶),10分钟(灭活Uralic-DNA糖基化酶和激活DNA聚合酶AmpliTaq黄金),40 15秒的周期,然后1分钟。每个反应包含cDNA来自约1.5 ng的总RNA。引物序列和探针从人类GPCR TaqMan面板从应用生物系统公司(P / N 4367785)目录。分别Hs00265647_s1 SSTR5和Hs00171054_m1 CCR7。

2.5。DNA测序

信使rna提取后,100 pg的信使rna被添加到10毫米核苷酸,2 pmoles /毫升的引物RT1也和RT2(操纵子,科隆,德国)和无菌水。混合物被孵化5分钟,不停地在冰上。管被短暂离心收集的内容(1000克)。5 x第一缓冲区,德勤0.1米,重组酶核糖核酸酶抑制剂和上标三世RT (Vitrogen工具包,Cergy Pontoise,法国)然后补充道。管是孵化5分钟,60分钟,15分钟(ptc - 100可编程温度控制器,乔丹研究公司,珀尔帖效应自行车、美国)。

一个PCR反应管,10 x PCR缓冲(200毫米Tris-HCl pH值8.4,500毫米氯化钾),MgCl₂50 mM核苷酸混合10毫米,扩增引物PCR1 PCR2 10毫米(操纵子,科隆,德国),Taq DNA聚合酶5 U /毫升(Finnzymes Phusion高保真DNA聚合酶,埃斯波,芬兰),从第一链反应和蒸馏水混合互补。管已经放入孵化的反应30秒的变性,在30 10秒的周期,20秒,1分钟,并完成项目在10分钟。DNA和SmartLadder (Eurogentec、血清、比利时)被罢免的琼脂糖凝胶1% TAE 0.5 x。

总cDNA检查完整性和集中使用DNA 7500 LabChip工具包安捷伦2100生物分析仪。也检查纯度在260和280海里通过阅读吸光度:比率A260 / A280总是在1.8和2.0之间。

2.6。组织石蜡切片免疫荧光染色

组织石蜡切片放在在15分钟和deparaffinised协议之前所描述的Kumada et al。7]。一夜之间,人体组织部分被染色CCR7与主兔单克隆抗体(Abcam、巴黎、法国)或SSTR5兔多克隆(Ozyme圣昆廷雷诺,法国)在孵化缓冲区(0.5% BSA-TBS pH值9.0)。后三个段落(10分钟)洗涤缓冲(0.1% BSA-TBS pH值9.0),部分被孵化了两个小时的二次山羊anti-rabbit Alexa萤石647抗体(在Vitrogen Cergy Pontoise,法国)在孵化缓冲区。最后,他们在洗涤缓冲洗10分钟,然后在TBS三次pH值9.0,6次在自来水。

2.7。采集和图像分析

使用共焦显微镜图像采集了徕卡SP5(徕卡,曼海姆,德国)。软件LAS AF(莱卡)已经被用于图像的采集和数字录音,及其与图像分析进行了J (Wayne Rasband免费,国立卫生研究院,美国)。

2.8。流式细胞术

固定和permeabilisation进行由于cytofix / cytoperm工具包(BD生物科学,Le Pont de Claix法国)和孵化一个小时主要SSTR5兔多克隆抗体(Ozyme圣昆廷雷诺,法国)在孵化缓冲或所有控件的同型的抗体。三洗烫/洗后,细胞被孵化一小时的Alexa 488 -共轭anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体(分子探针、莱顿、荷兰)。对所有样本造粒、大小和荧光强度都记录在一个FACStar +细胞分选仪(美国BD生物科学,圣何塞,CA)在800细胞/ s,或者一个Easycyte +毛细管血细胞计数器(美国番石榴技术,海沃德,CA) 0.59的速度。数据表示为意味着荧光/细胞;没有切断信号应用。

2.9。肿瘤坏死因子-分泌物化验

人类PBMCs从CD患者24好文化板块5中孵化· 细胞/毫升24小时在湿润/ 95空气大气浓度的增加(从M米)的原始生长抑素类似物,有或没有激活有限合伙人(5)。化合物溶解在PBS。盘子是离心机15分钟在200 g ()和上层清液储存在之前,细胞因子测定如前所述[4]。

2.10。统计数据

实时rt - pcr数据量化使用SDS 2.2.1软件包(应用生物系统公司)。相对比较研究结果量化,使用一个自动基线和阈值来记录周期阈值()设置和18 s rRNA基因表达规范化作为参考()。学生的t以及使用一个阈值的意义

ELISA的数据被表示为一个百分比的基底细胞因子分泌或手段(SE);””是指实验的数量。使用非参数Mann-Whitney U测试结果进行了比较。统计显著性水平是固定的

3所示。结果

通过监测non-orphan RCPGs(即。,279一个mong the 382 RCPGs tested) in PBMCs of 10 healthy donors and 10 CD patients, we found that the data obtained were highly dependant on RNA integrity. The integrity of RNA molecules is of paramount importance for experiments that try to reflect the snapshot of gene expression at the moment of RNA extraction. The RNA integrity number (RIN) is an important tool regrettably often disregarded, in conducting valid gene expression measurement experiments as real-time PCR or DNA microarray [6]。RIN测定20个样本后,只有4 CD患者和4搭配健康的捐赠者可以被认为是由于样本退化而可靠的处理和运输在干冰从医院到实验室。因此即使只有4 CD患者和4控制但可靠的起源,我们发现SSTR1和5受体被发现之间的差异表达RCPGs确定的279年。另一方面,当我们探索表达谱的活检获得的内窥镜检查从五个CD患者活检相比另一个模式出来,当我们从发炎non-inflamed地区。这一次只有一个受体CCR7)(显示显著的超表达在发炎的地区。

3.1。SSTR5 mRNA的表达和CCR7 PBMCs CD患者

SSTR5 mRNA水平(表中显著增加1(一))在CD患者PBMCs: SSTR5中超过时报》()。由有限合伙人并不影响激活SSTR5表达式在CD患者中(表1(b))。没有发现CCR7 mRNA表达差异在CD PBMCs相比,那些来自健康的捐赠者。

3.2。信使rna表达的相关性与记者在PBMCs蛋白质合成

流式细胞仪实验进行PBMCs验证如果蛋白表达对应这样一个戏剧性的mRNA超表达。图的直方图1与70年显示健康PBMCs (B)表现出积极的为SSTR5染色。LPS激活后100%的健康对照组的PBMCs呈现SSTR5蛋白质。相比之下,在CD患者中,所有PBMCs显示阳性染色SSTR5独立激活(D) (C)有限合伙人。然而,预期的蛋白质400倍SSTR5过度时从未见过比较健康PBMCs (A) CD病人PBMCs (C),从这些结果,看来PBMCs从CD患者呈现SSTR5表达水平的LPS-activated PBMCs从健康的捐赠者,但没能找到相关率之间的信使rna和蛋白质表达。

共焦显微镜和流或毛细管血细胞计数显示健康对照组或CD患者PBMCs CCR7超表达。

3.3。删除35 bp的DNA序列SSTR5 PBMCs CD患者

信使rna的提取是实现PBMCs 4 CD患者和4控制捐助者。互补脱氧核糖核酸rt - PCR、PCR获得。我们发现SSTR5 DNA的序列在CD患者不同于控制捐助者(表2)。一个较小的序列在CD患者总是观察平均差异35个基点。因此删除可以提出的假说。这可能给一个理由乳糜泻患者产生更多SSTR5蛋白质比控制捐助者,以提供一个恒定的绑定的生长抑素细胞中蛋白质配体识别的效率较低。

3.4。促炎细胞因子的抑制TNF -生长抑素类似物在PBMCs从CD患者

有发现,如此高的SSTR5 mRNA过度不关联SSTR5蛋白质含量除了CD患者35 bp在SSTR5 DNA缺失,我们打算评估如果表达SSTR5仍然活跃在PBMCs CD患者。为此,我们测试了不同原始生长抑素类似物的力量抑制促炎细胞因子TNF -的生产PBMCs LPS激活后在CD患者(图获得的2)。所有四个测试类似物被发现活跃,即使在不同的利率,强调的效率SSTR出席CD患者PBMCs的表面。

3.5。活检从CD患者CCR7 mRNA的表达

肠道组织切片的CD患者,其过表达了*健康的捐赠者结肠粘膜相比(表1(c))。生长激素抑制素受体5 mRNA表达不是控制或增加的CD病人的肠道粘膜。

3.6。本地化CCR7和SSTR5 CD病人的组织

CCR7古典这项工作是不可能的免疫荧光检测技术由于高自发荧光的粘液和肠道组织的分泌物。只有通过共焦显微镜Alexa 647标记的第二抗体,我们能够检测CCR7表达CD发炎组织与non-inflamed部分。此外,获得的图像表明,检测受体是位于细胞膜,尤其是在单核细胞表面的肠道固有层(图中3)。

正如所料,没有SSTR5标签可以发现在健康对照组或CD患者结肠活检,同意提前获得的结果实时rt - pcr实验。

4所示。讨论

目前的工作强调了通过两个具体的例子,RNA质量评估的重要性尤其在资料解释RNA的完整性(RIN)分配数量完整性值RNA。建立步骤RIN身上往往处理不当,显然无法取代通过检查大量的样本。此外,我们的研究结果说明了流式细胞仪和共焦显微镜,结合细胞挑战(s) (a)(即响应LPS激活)构成重要的工具可能带来新的亮点通过分子生物学的实验结果。

我们发现SSTR5 mRNA水平显著增加(400倍)的CD患者PBMCs。相比之下,流式细胞仪实验表明,SSTR5蛋白表达没有揭示蛋白质表达水平对应这样一个戏剧性的mRNA超表达。的形象SSTR5蛋白表达在不活跃的CD患者PBMCs基底条件(即我们观察到。,without any in vitro exogenous activation of PBMCs) was comparable to the SSTR5 expression of LPS-activated PBMCs from healthy donors. Furthermore, to answer the question of the functional activity of SSTRs from inactive CD patients, we assessed the ability of different somatostatin analogs to inhibit PBMCs TNF-体外生产。所有四个测试原始类似物被发现显著抑制肿瘤坏死因子-活跃分泌,展示的效率SSTR出席CD患者PBMCs表面充分满足这个生物属性而不是解释为什么SSTR5信使rna是过表达。

这样的一个假设来解释400倍增加之间缺乏相关性SSTR5 mRNA水平和较小的增加SSTR5蛋白表达在CD患者PBMCs担忧的内化和老年病SSTR5 [8]。的胞质尾SSTR5对腺苷酸环化酶相互作用至关重要,所以在调停脱敏和内化9]。使用爆炸(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/),我们确认具体的引物来扩增外显子2的轨迹在SSTR5后启动子区域。bp PCR扩增后删除35暗示的含义SSTR5编码序列(CDS)在CD患者。删除的c端尾GPCR可能影响回收的GPCR内化和老年病。因此SSTR5之间的绑定和生长激素抑制素将无法激活腺苷酸环化酶;结果这可能会导致支持增加SSTR5 mRNA表达的结果缺乏消极追溯管理循环。然而,正如我们已经表明,合成生长激素抑制素类似物仍然能够调节TNF -生产PBMCs CD患者LPS激活后,这个假设仍让人怀疑和需要额外的工作,既可以验证,如果缺乏35 bp位于c端区域,并确定SSTR受体(s)参与抑制PBMCs TNF -生产使用生长抑素类似物,其他比SSTR5 SSTR受体可能参与或补偿SSTR5的假想的障碍。

虽然不是本研究的目的,增加SSTR5 mRNA和蛋白表达等PBMCs从临床上不活跃的CD患者与健康对照组相比,仍然是有趣的。实际上,生长激素抑制素已被证明在几项研究参与炎症和免疫反应10]。这个角色主要是受到生长激素抑制素和SSTRs发炎的细胞器官(11),免疫系统的结构如人类淋巴组织,最后外周血细胞(10]。生长激素抑制素的生物活性抑制性质的一般。五个生长激素抑制素受体亚型,称为SSTR(1 - 5),迄今已克隆的人体组织。SSTR(1 - 5)是由五个non-allelic编码基因在染色体14日,17日,22日,20日和16日(12- - - - - -15]。生长激素抑制素和生长激素release-inhibiting因素(研)环肽。生长激素抑制素是由正常的内分泌,胃肠道,免疫,神经细胞,以及某些肿瘤(16- - - - - -20.]。高度有效的生长激素抑制素肽SRIF-14并从prosomatostatin SRIF-28生成c端产品。通过绑定到靶细胞上的受体结合,研作为各种分泌过程的强有力的抑制剂和细胞增殖16- - - - - -20.]。先前的研究已经证明SSTRs在炎症的存在21- - - - - -25]。人们普遍认为的神经肽生长激素抑制素是一种重要的免疫系统的监管机构的组织。有丰富的数据显示,炎性细胞因子调节生长激素抑制素免疫和神经细胞(26- - - - - -29日),它将会是很有趣的探索更准确的机制(s)和SSTRs的潜在作用,例如,SSTR5作为抗炎治疗的目标。此外,高SSTR5表达PBMCs从CD没有临床或生物活动的迹象可以表明这个SSTR5过度可能被视为一种生物标志物的CD。然而,这已经被证实在一个更大的患者人群中,均匀的疾病活动和病人治疗;这项工作目前正在进行。

另一方面,第二个例子,我们研究CCR7 mRNA和蛋白表达在肠道粘膜活检组织的CD患者。我们发现CCR7 mRNA表达是有着健康对照组相比增加结肠粘膜。这次CCR7蛋白表达中检测出相应的组织与non-inflamed发炎的CD。

趋化因子也代表控制炎症反应的重要参与者。他们通过绑定和激活影响细胞表面受体,是七个跨膜域GPCR。趋化因子在炎症条件和监管是由激活白细胞和组织细胞以及众多的肿瘤。他们控制效应白细胞的招聘,因此,确定炎症浸润的成分(30.]。在这项研究中我们观察到CD结肠粘膜发炎,CCR7 mRNA表达增加以及CCR7染色固有层单核细胞。这些结果符合Middel报道的数据等。(31日在CD]表明,淋巴趋化因子CCL20(及其受体CCR6)和CCL19 CCL21(及其受体CCR7)数量的增加可能导致成熟树突状细胞(DC)在肠道壁的影响,导致当地的T细胞的激活和增殖,DC / T细胞的形成集群CCR7表达,最后参与维护肠道炎症和免疫反应。这样一个“封存”CCR7-positive免疫细胞可以解释为什么我们没有发现CCR7表达增加PBMCs从CD患者。是否调制的淋巴趋化因子或受体可能代表一个有效和安全的治疗策略仍有待澄清。如果CCR7在CD患者的肠道发炎,SSTR5,调节免疫反应的一个重要因素,也同样将在相同的组织。没有SSTR5 CD患者的炎症组织可以解释为什么somatostatinergic系统不是在肠道发挥免疫抑制作用。我们的数据表明,不需要开发新的生长抑素类似物是否有如此重要的缺乏目标表达式在CD患者的肠道发炎。

乳糜泻患者,我们观察到的差异SSTR5 mRNA表达与活检相比,血液循环。这样的差别两个独特的本地化是难以解释的。存在高SSTR5 mRNA在CD患者PBMC可以减弱免疫反应的结果,反过来导致失控积累诱导物的刺激从而激活适应性免疫系统(32]。我们跟着并联一组基因的表达参与炎症过程。只有轻微的生物标志物的表达像CHRM1, CCR10,财政年度,BDKRB1, HTR1B观察(数据未显示)。的表达CCR7在CD患者活检,可以将这一现象,直接或间接地基因缺陷诱导一个夸张的先天反应肠道微生物菌群,导致过度炎症反应(33]。

总之,目前的研究凸显了需要谨慎的在解释数据只提供信息在RNA表达或蛋白表达,为了避免错误的解释在受体表达和虚假的生理或病理的相关性。这些结果也强调RNA质量数据分析的重要性,特别是当使用高通量DNA芯片技术或micro-fluidic设备。最后,尽管它尚未研究的目的,我们提出初步结果表明角色SSTR5 CCR7在CD发病机制,这可能如果确认进一步的大规模研究中,行为识别(a)新疾病标记(s)和/或治疗目标(s)。

确认

这项研究是由ACI 2002)的资助下,MNRT CNRS-INSERM-CEA, Pathologies-RCPG-Medicaments。娜塔莉Taquet被授予来自法国的显示出实验室,支持非犹太人,法国,和让-玛丽•Reimund拨款的联合实验室、法国。生长抑素类似物是一个仁慈的礼物专机实验室(公关。c . g . Wermuth m·l·荣格)博士,法国。