文摘

的影响Crotalus什麽terrificus毒液(Cdt)分析对磁化率和炎症介质的实验模型严重的表面变质。雌性BALB / c小鼠腹腔注射了感性Cdt,改变特定的迹象,血液生化和炎症介质。毒液诱导的葡萄糖和尿素水平减少,增加小鼠的血清肌酐水平。时间进程的显著差异观察中介从小鼠血清注射Cdt的水平。最大的il - 6水平,不,IL-5, TNF、il - 4和il - 10是观察15分钟,30分钟,1、2和4小时post-injection,分别。观察干扰素水平——没有区别 。综上所述,这些数据表明表面变质的Cdt监管支持和抗炎细胞因子反应时间的方式。从小鼠血清注射Cdt的一分之二小时显示炎性主导地位。然而,随着时间的增加增加观察抗炎细胞因子,平衡向抗炎主导地位。总之,Cdt,影响职业和抗炎细胞因子的生产提供了进一步的证据,Cdt所扮演的角色在调制pro /抗炎细胞因子的平衡。

1。介绍

蛇咬伤是一个严重的公共卫生问题在发展中国家由于其发病率高,严重程度,后遗症[1]。在巴西,叮咬有关的死亡病例Crotalus什麽terrificus(Cdt)很高,对应于72%的病例不提交特定血清治疗和11%的病例提交特定的治疗(2]。这毒液包含各种各样的有毒蛋白质包括crotoxin crotamine, gyroxin, convulsium,类似酶,并产生严重的并发症,如神经毒性、呼吸麻痹、低血压、凝血障碍,myotoxicity,急性肾功能衰竭(3),可能是额外的心脏和肝脏损伤(4- - - - - -6]。

涉及表面变质严重,变态,发生在一个压倒性的感染会导致低血压和低血流量。受害者可能出现严重的并发症,如播散性血管内凝血、多器官功能衰竭和死亡。关于multipleorgan失败代表影响内皮细胞损伤,形成水肿,封存和过度系统性宿主炎性反应在很大程度上是由复杂的免疫过程。一个强有力的、复杂的免疫级联可以确保一个提示保护性反应在人类和实验动物毒液。虽然表面变质期间激活免疫系统的一般保护,感染性休克发展在许多病人因此过度或监管不力损伤机体的免疫反应。这种不平衡反应危害主机通过内生生成时的不适应的释放介质。一个成功的免疫反应的激活依赖一组适当的免疫效应器功能和负载可能决定precursos T辅助(Th0)淋巴细胞的分化成Th1、Th2细胞(7]。这两个子集Th细胞不同的效应器功能和细胞因子的功能主要是在他们分泌对抗原刺激的反应。Th1细胞促进细胞介导效应物反应,而Th2细胞促进B细胞介导体液反应。Th1细胞产生的细胞因子包括干扰素(IFN -γ)、白介素2(2)、白介素和肿瘤坏死因子(TNF -β),构成促炎细胞因子。这些由Th2细胞命名为抗炎细胞因子il - 4、IL-5, il - 6和il - 10。也有一些IL-13和肿瘤坏死因子等细胞因子-α这是常见的两个子集(8]。

许多机制参与表面变质的发病机制,包括细胞因子的释放。细胞因子分为两个重要组:促炎如il - 1 (7),il - 6 (8,9],TNF -α(10,11),和il - 10等抗炎,有负面影响在抗感染和败血症的老鼠,降低il - 10水平提高生存(12- - - - - -14]。

细胞因子的生产表面变质已被广泛研究,似乎赞成和抗炎细胞因子在脓毒症综合征过度繁殖。然而,他们的临床意义和预后价值尚未阐明15- - - - - -19),似乎一个复杂网络可能不同的细胞因子和其他组件之间的交互发生在严重感染的免疫反应。这些积累数据表明赞成和抗炎反应之间的平衡是很重要的的最终结果,受害者严重表面变质(18,19]。

另一个炎症介质是一氧化氮(NO)是一种重要的自由基作为第二信使在流程包括神经传递,维护血管舒张的语气,动脉压和有人建议cytokine-mediated循环冲击是由于激活诱导isorform (II型)号(20.]。在生物系统中,一氧化氮分解亚硝酸盐和硝酸盐,cytokine-mediated亚硝酸盐/硝酸盐浓度的增加。修改的亚硝酸盐和硝酸盐的浓度生产相关的几个条件:严重的表面变质(19),感染性休克,高血压,和atheriosclerosis21]。

本研究的目的是:(a)评估对Cdt的毒性作用,(b)来确定葡萄糖,肌酐,尿素水平与Cdt注入后,(c)探讨血清水平的促炎细胞因子和抗炎细胞因子变化的实验模型严重表面变质诱导小鼠Cdt,和(d)来决定赞成的比率/抗炎细胞因子在小鼠的血清注射Cdt。

2。材料和方法

2.1。化学物质、试剂和缓冲区

放线菌素D, orthophenyldiamine(门诊部当),硝酸钠,n n - (1-naphthyl)乙二胺盐酸盐),sulfanilamida, rpmi - 1640中,和胎牛血清(FCS)购买的σ(圣路易斯,密苏里州,美国),小鼠anti-IL-6(克隆MP5-20F3和MP5-32C11),重组il - 6,小鼠anti-IFN -γ(克隆XGM1.2 R4-6A2),重组干扰素-γ小鼠anti-IL-10(克隆JES5-16E3 SXC-1),重组il - 10,小鼠anti-IL-4(克隆11 b11 BVD6-24G2),重组il - 4,小鼠anti-IL-5(克隆TRFK5和TRFK4),和重组IL-5从BD购买生物科学Pharmingen(美国加州圣何塞)和肿瘤坏死因子重组从Boehring购买曼海姆(德国曼海姆)。

2.2。毒液

冻干的毒液Crotalus什麽terrificus(Cdt)从实验室获得的爬虫学,Instituto Butantan圣保罗,巴西,并存储在−20°c .毒液是溶解在无菌生理盐水(0.85% (w / v)氯化钠溶液),立即使用前。

2.3。动物

雌性BALB / c小鼠身体不同权重获得从一个殖民地成立由学院Biotecnologia Bioterio(自治,墨西哥人。美国)。动物被维护和使用严格的伦理条件下根据国际委员会成员对动物福利的建议,(国际社会在毒理学,1992)22]。组小鼠腹腔内注射(i.p)和不同数量的Cdt通过不同的间隔时间后血液收集retroorbital丛。以来化验确定动力学因子注入的一小部分动物的死亡率,每个实验组小鼠的数量介于5和15之间获得血液样本为每个时间间隔至少五个老鼠。老鼠流血(0)1/4、1/2、1,2,4,8 - 24小时,血清分离和储存在−20°直到使用C。

2.4。杀伤力

Probit方法被用来计算致死剂量50 ( Cdt的)。四组雌性BALB / c小鼠不同的身体重量10 - 12 g;13 - 15克;16 - 20 g, g -腹腔内注射(i.p)增加剂量的毒液和老鼠的数量算24小时后死亡。老鼠的数量在每个剂量使用致命的十岁。

2.5。直肠温度测量

组雌性BALB / c小鼠13 - 15 g被用来研究Cdt在体温的影响实验动物行为的空间,这是保持在第23 - 25°c .每个鼠标被单独在笼子里( (深度)),然后每15分钟,松散的小布袋,核心体温测量使用数字温度计。每次测量后,鼠标是回到笼子里。老鼠的直肠温度之前Cdt政府低于37°C没有用于实验。Cdt是管理后,温度变得稳定。

2.6。血液生化

组雌性BALB / c小鼠腹腔注射0.5 13 - 15克、或1和/或2 Cdt的溶解于0.1毫升的生理盐水。控制老鼠收到0.1毫升的生理盐水。两个小时后注射Cdt,动物被流血。血液样本被允许站,直到他们形成血栓和血清生化分析中使用。葡萄糖、尿素和肌酐水平出现在从控制老鼠或注射血清Cdt测量使用特定工具(SPINREACT诊断、桑特的埃斯特乌德Bas、西班牙),分别根据制造商的协议。

3所示。介质生产

3.1。亚硝酸盐的检测

从小鼠血清中的亚硝酸盐含量测定如前所述,施密特et al ., 198923]。简单地说,40 L的小鼠血清样本被转移到40 96 -孔板和混合 L减少解决方案(NADPH 1.25 ng / mL;时尚10.4 ng / mL;K P 含0.125米)0.5 U N 还原酶2小时37°c .这一次之后,80年 L格里斯试剂(1部分0.1% N-1-naphthyl-ethylene-diamine盐酸盐在水和1份1% sulfanilamida 3%集中 P )被添加到每个。混合物在室温和孵化5分钟阅读标540海里。浓度测定与亚硝酸钠的标准曲线。试验的检测极限是1 亚硝酸盐。

3.2。细胞因子

细胞因子il - 4水平,IL-5, il - 6、il - 10和干扰素-γ在BALB / c小鼠的血清化验由two-site三明治enzyme-like免疫吸附试验(ELISA) [24]。总之,ELISA板涂有100人 L (1 g / mL)的单克隆抗体anti-IL-4, anti-IL-5, anti-IL-6,抗il - 10,或者anti-IFN -γ在0.1 M碳酸钠缓冲区(pH值8.2)和在室温下培养6小时。然后洗井和磷酸盐(PBS / Tween-20) 0.1%,与100年了 L 10%的胎牛血清在PBS (FCS)在室温下2小时。洗后,重复的血清样品50 L被添加到每个。经过18个小时的潜伏期在4°C, 100年井清洗和孵化了 L (2 g / mL)的生物素化的单克隆抗体anti-IL-4 anti-IL-5 anti-IL-6 anti-IL-10或anti-IFN -γ作为第二抗体在室温下45分钟。最后一个洗后,反应是由添加orthophenyldiamine(门诊部当)好。光密度测量在405纳米微型板块读者。每个样本的细胞因子的内容读取标准曲线建立适当的重组细胞因子(每毫升用皮克表示)。每个细胞因子检测到的最低水平的条件分析10 pg / mL il - 4, IL-5, il - 6、il - 10和干扰素- 300 pg / mLγ。

测量肿瘤坏死因子存在于血清的细胞毒性BALB / c小鼠,一个标准的试验与l - 929细胞,成纤维细胞连续细胞系使用前面描述的飞边和吉福德(1988)(25]。细胞毒性百分比计算如下: 。滴定度计算的互惠稀释的样本中,50%的细胞单层细胞溶解。TNF活动表示为pg / mL,估计50%的细胞毒性剂量率的测试标准的鼠标重组TNF。

3.3。统计分析

数据表示为平均值±标准偏差。统计分析是由学生完成 以及和水平的意义是 。

4所示。结果

4.1。的决心 和症状

毒液来验证是否存在影响体重和确定 、组不同体重的雌性BALB / c小鼠腹腔注射不同剂量的Cdt。的 值在95%置信概率单位分析计算。这些动物被分布在四组,不同的身体重量。如图1,雌性BALB / c小鼠不同的易感性Cdt,(10 - 12克, 7.5 克),(13 - 15克, 10 克),(16 - 20克, 15.8 g g)和(21 - 25日, 23.5 g)。女性团体的最高易感性观察10 - 12 g身体重量。随着体重的增加,可以观察敏感性下降(图1)。当老鼠收到的腹腔内注射1 Cdt,时间的死亡率之间没有差别的研究团体。在所有组中,大多数死亡发生在前6小时内。没有观察到死亡小鼠注射生理盐水(结果未显示)。因此,在后续的实验中小鼠权重13 - 15 g。


图1
Cdt根据体重的影响。10组不同体重的雌性BALB / c小鼠腹腔注射不同数量的Cdt。记录和死亡发生在24小时 值计算。统计差异组标有星号( )。

死之前通常是某些信号或症状,如体温过低。13 - 15 g组雌性BALB / c小鼠的体重是ip注射0.5,或1和/或2 Cdt,观察在不同的时间间隔特定迹象(数据没有显示)。确定葡萄糖、尿素和肌酐水平,组雌性BALB / c小鼠体重的13 - 15 g ip注射0.5或1和/或2 Cdt的2小时。如图2的 增加,可以观察血糖水平下降。葡萄糖含量显著降低动物组织收到了Cdt相比,那些从对照组的动物( )。


图2
葡萄糖测定。组雌性老鼠从BALB / c株,13 - 15克的体重,是ip注射0.5或1和/或2 Cdt。2小时后老鼠流血和葡萄糖水平存在于小鼠的血清注射测定。每个竖线代表平均值±标准偏差值的样本获得的结果与两个独立的两个实验进行五组小鼠。注射是标有星号(统计差异 )。

图3显示了所有的老鼠获得不同数量的Cdt,血清中尿素氮的水平显著降低( )相比,那些获得了对照组。


图3
尿素的决心。组雌性老鼠从BALB / c株,13 - 15克的体重,是ip注射0.5或1和/或2 Cdt。2小时后老鼠流血和尿素水平存在于血清测定。每个竖线代表平均值±标准偏差值的样本获得的结果与两个独立的两个实验进行五组小鼠。注射是标有星号(统计差异 )。

血清中肌酐的水平组老鼠注射了Cdt图所示4。肌酐的水平增加浓度的方式。最大的肌酐水平观察组小鼠的血清注射2 (图4)。


图4
肌酐测定。组雌性老鼠从BALB / c株,13 - 15克的体重,是ip注射0.5,或者,1或2 Cdt。2小时后老鼠流血和存在于血清肌酐水平测定。每个竖线代表平均值±标准偏差值的样本获得的结果与两个独立的两个实验进行五组小鼠。注射是标有星号(统计差异 )。
4.2。比较在Cdt毒液注入体内介质释放

为了比较介质释放细胞因子分泌和一氧化氮等生产,从雌性BALB / c小鼠血清13 - 15克的体重是ip注射0.5,或者,1或2 2小时后Cdt和流血。这时,IL-5和il - 6的水平从老鼠注射不同的血清中检测不到 。如图5肿瘤坏死因子的水平,不,明显高于il - 4和il - 10 ( )在小鼠的血清注射2小时与不同数量的Cdt相比,那些获得的血清对照组。有趣的是获得的结果也表明,这些介质的水平是持续和显著降低( 从小鼠血清注射2中) 相比,那些获得组小鼠的血清收到0.5和/或1 (图5)。相比之下,无显著差异水平的观察干扰素-γ在小鼠的血清注射不同数量的Cdt(图5)。

(一)
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(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
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(e)
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图5
介质分泌。组雌性BALB / c小鼠腹腔注射0.5 13 - 15克、或1或2 Cdt, 2小时后,动物血和细胞因子的水平,没有出现在血清测定材料和方法(见部分中所述2)。每个点代表平均值的结果从两个独立的实验动物每五到十五。注射是标有星号(统计差异 )。
4.3。动力介质的释放在Cdt毒液注入

确定细胞因子分泌的动力学和没有生产,与13 - 15 g组雌性BALB / c小鼠体重的ip注射1 Cdt和流血后不同时间间隔。N的最高水平 Cdt注射后30分钟接受,腐烂之后(图6)。Cdt诱导一个离散增量的il - 6水平接受(图15分钟6)。肿瘤坏死因子、干扰素-γ水平逐渐增加,达到的最高接受2小时,腐烂之后(图6)。最高层IL-5观察接受(图1小时6)。Cdt也能够诱导增加血清il - 4和il - 10水平最高的价值观发生4小时接受,腐烂之后(图6)。

(一)
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(b)
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(c)
(c)
(d)
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(e)
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(f)
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(g)
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图6
中介动力学分泌。从BALB / c株组雌性老鼠,13 - 15克的体重,腹腔注射1 Cdt。后不同时期的动物是流血和细胞因子的水平存在于血清测定材料和方法(见部分中所述2)。每个点代表平均值的结果从两个独立的实验动物每五到十五。注射(统计差异 )。
4.4。Cdt Pro - /抗炎细胞因子平衡的影响

细胞因子测定如上描述和探讨血清促炎细胞因子水平的变化(IFN -γ和肿瘤坏死因子-α)和抗炎细胞因子(il - 4和il - 10)和pro - /抗炎(TNF的比率α/ il - 4, TNF -α/ il - 10,干扰素-γ/ il - 4和干扰素-γ/ il - 10)计算。如图7肿瘤坏死因子-α/ il - 4和TNF -α/ il - 10比值逐渐增加,在2小时达到最高,之后衰减。最高的比率干扰素-γ/ il - 10和干扰素-γ/ il - 4在15分钟到2个小时,观察(图7)。肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ减少,伴随着il - 4和il - 10释放增加。

(一)
(一)
(b)
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图7
赞成/抗炎细胞因子的平衡。血清细胞因子水平的测定(见材料和方法部分中描述2)。赞成的比率/抗炎;干扰素-γ/ il - 4,干扰素-γ/ il - 10, TNF -α/ il - 4, TNF -α/ il - 10代表两个实验样本的值在不同组的五到十五老鼠。

5。讨论

各种因素导致的存在特定的症状和体征随后刺或咬的毒液毒性变化(26]。然而,它已经表明,其他因素也可能导致临床症状,如年龄和大小的受害者,注入的,受害者的毒液的脆弱性15,26,27]。

本研究旨在模拟人类意外表面变质,在Cdt政府的路线,注入之间的时间和特定的迹象,剂量,介质生产进行了研究。研究的实验模型应该包含不同的易感性毒液毒性作用。这是在目前的研究中,取得最高的易感性观察女性群体在不同的身体重量。分析中雌性BALB / c在10 - 12 g是更容易受到Cdt致命的影响比其他组用不同的身体重量。在目前的研究中,我们观察到小鼠呼吸道异常后Cdt注入。这些观察同意先前的研究显示,Cdt老鼠产生呼吸道异常(28]。

各种研究表明Crotalus动物毒液诱发广义横纹肌溶解,导致肌痛、增量大幅增加的血清肌红蛋白和肌酐激酶水平伴随着肌红蛋白尿(29日]。急性肾功能衰竭是主要的死亡原因在人类中观察与Cdt de表面变质后和可能的额外的心脏和肝脏损伤(2- - - - - -6]。在这项研究中,我们观察到的变化在一些老鼠的血液生化参数测量Cdt注射后。大量的血清葡萄糖、尿素和肌酐水平测量数据详细描述2,3,4。这些结果与先前的研究一致,表明,临床和实验室改变动物免疫与蛇毒液(30.]。Cdt表面变质也提供了一个高度的儿茶酚胺,血管紧张素ⅱ,胰高血糖素、皮质醇伴随着胰岛素分泌的变化(31日]。在Crotalus表面变质胰岛素和葡萄糖代谢的改变可能是负责各种临床症状的发病机制。目前的研究表明,血液中组老鼠注射了Cdt,葡萄糖水平降低了。尿素在肝脏和血液中循环形成尿素氮的形式。健康人类最尿素氮是由肾脏过滤掉,离开人体尿液中。如果肾脏不正常运作或者身体是使用大量的蛋白质,血尿素氮水平上升。如果人类有严重肝脏疾病的血液尿素氮会腐烂。在本研究中,我们观察到在血尿素水平降低小鼠注射Cdt表明肝衰竭。这些结果与先前的报告显示内联,人类病人咬伤Cdt显示水肿的变性和肝线粒体损伤(4]。血液参数的变化是典型的Cdt是葡萄糖和尿素的影响而降低肌酐水平增加。目前的研究还表明,血清观察这些变化只有当大量的Cdt被注入这个动物。

表面变质的特点是广泛性炎症状态。正常反应表面变质涉及一系列复杂的免疫级联,以确保一个提示保护性反应人类毒液(32和实验动物15- - - - - -19,27]。虽然表面变质期间激活免疫系统的一般保护,感染性休克发展在许多患者由于过度或监管不力,损伤机体免疫反应(19,32]。这个不平衡的反应可能会伤害宿主通过maladaptitive释放内源性介质,包括细胞因子和一氧化氮。

细胞因子是蛋白质可溶性介质重要的人体的炎症反应的编排33]。促炎和抗炎细胞因子的生产是由复杂的反馈机制(严格控制14,34,35]。细胞因子可分为促炎和抗炎。促炎细胞因子(TNF -α、il - 1和引发包括动员免疫系统细胞增殖和产生更多的细胞因子产生炎症级联,和等抗炎细胞因子il - 10的功能抑制或控制炎症反应。促炎细胞因子主要是负责发起有力抵御外源性病原体。相比之下,抗炎细胞因子对下来至关重要的升高的炎症过程和维持体内平衡调节正确重要器官的功能(36]。然而,过度生产的这些介质可能显著导致休克、多器官功能衰竭和死亡(14,34,35]。

表面变质是一个星座的临床症状和体征造成过度系统性主机主要由细胞因子介导的炎症反应,释放进入体循环。血清浓度的特定细胞因子TNF -αil - 6,经常envenomated老鼠和他们的浓度升高与严重程度和表面变质的结果。此外,促炎细胞因子产生大量envenomated老鼠,然而,这些分子在脓毒症的具体作用仍是未定义的。

赞成的比例平衡和抗炎细胞因子是重要的适当的免疫反应,过度炎症,或hyporesponsiveness从而导致下毒的并发症。确定细胞因子反应的大小由Cdt毒液注入和评估职业的平衡——在表面变质和抗炎细胞因子释放,我们测量从小鼠血清中细胞因子水平。

肿瘤坏死因子-α是一种促炎细胞因子在免疫反应中起着重要的作用,感染和癌症和炎症的规定(37]。目前的研究表明,血清TNF -浓度的升高α2小时后发生的Cdt管理。

il - 6是由各种类型的细胞在感染、创伤、和免疫学的挑战。il - 6的功能性质是非常不同的,这是反映在最初的术语用来描述这种细胞因子的活动。它被描述都赞成和抗炎作用,以及参与各种各样的免疫反应。这一研究获得的结果表明,il - 6的水平增加,直到15分钟后1 Cdt注入,腐烂。

干扰素-γ是由多种细胞类型和可能发挥作用在主机的早期阶段应对毒液。在目前的研究干扰素的血清浓度-γ类似于所有组的老鼠注射不同数量的Cdt。成群的老鼠注射1 Cdt的干扰素-的水平γ可能观察到适度直到4小时,之后衰减。

细胞因子il - 10是一个多功能免疫调节以前没有从人类和小鼠t细胞克隆。il - 10是一种抗炎细胞因子,强有力地抑制促炎细胞因子的分泌,如TNF和il - 1 (38)和调节一些免疫细胞的分化和增殖(39]。目前的研究还表明,il - 10的水平增加到4小时组的小鼠注射1 Cdt。

il - 4有一个广泛的功能和体内细胞因子主要是负责生产的IgE老鼠在回应各种刺激引起的搞笑类切换到这个搞笑类的表达(40]。目前的研究表明,Cdt有能力刺激il - 4生产,当然是发挥调节宿主炎性反应的影响。

在这项研究中,我们观察到的水平与干扰素除外——介质γ是持续和显著降低( 从小鼠血清注射2中) 相比,那些获得组小鼠的血清收到0.5和/或1 (图5)。这些结果与先前的研究一致,进行的crotoxin主要神经毒素存在于Crotalus毒液,展示了活动immunosuppresor和免疫调节等实验动物(41,42]。

没有被认为是参与多种重要的生物反应(43,44]。这种化合物是一种气体,容易扩散从内皮细胞在血管壁平滑肌细胞。目前的研究表明,Cdt有能力刺激生产,当然是发挥调节影响宿主炎性反应。没有的生产是内皮功能的主要机制之一。当没有从精氨酸合成,通过NO合酶(NOS)反应,瓜氨酸和中间形成尿素循环的产物。因此,尿素循环绕过了NOS反应。关于中介的水平,也获得了类似的结果小鼠组用不同的体重(数据没有显示)。

在这项研究中,我们发现干扰素-的水平γ和肿瘤坏死因子-α高在老鼠身上注射1 比对照组小鼠和/或组注射2 。然而,干扰素-直接相关γ和肿瘤坏死因子-α观察细胞因子il - 4和il - 10在老鼠身上注射了Cdt指示共同支持/抗炎的参与。总之,Cdt受到支持和抗炎细胞因子的反应。成群的老鼠注射短时间内支持/抗炎平衡的偏差对促炎主要类型。相比之下,注射时间的增加平衡的偏差是消炎的主导地位。

承认

这项工作是支持的批准号从Secretaria UAEMOR-02-01 de la Educacion上市(SEP-PROMEP),墨西哥。