文摘

激活NF -B也能防止细胞凋亡,但也可能作为proapoptotic因素为了消除炎症细胞。在这里,我们表明,古典NF -生264.7 B激活巨噬细胞和骨骨髓来源在短大肠杆菌coculture有必要促进细胞死亡在后期时间点。在48小时后短期的,大肠杆菌挑战生存的NF -增加B-suppressed巨噬细胞与自噬的模式有关,而巨噬细胞与正常NF -B信号死去。正常细胞死亡的巨噬细胞自噬相关基因的差别是由前表示对这些atg5和beclin1。引发刺激的巨噬细胞与有限合伙人在48小时后大肠杆菌治疗结果在NF -增强促炎细胞因子的生产B-suppressed巨噬细胞相比,控制细胞。我们因此证明古典NF -B激活抑制自噬和促进推迟程序性细胞死亡。这种机制很可能是为了防止炎症细胞的恢复,从而有助于解决炎症。

1。介绍

炎症和免疫细胞的细胞死亡是特别重要的体内平衡的免疫系统也在防御机制对传染性微生物。调制白细胞细胞死亡的细菌,然而,讨论了作为重要的发病机制。例如,某些细菌如志贺氏杆菌和沙门氏菌能够逃避细胞内杀死吞噬作用,最终导致吞噬细胞死亡后(<一个href="#B1">1]。另一方面,low-virulent细菌等葡萄球菌,链球菌,或大肠杆菌(大肠杆菌)通常无法生存在吞噬细胞和由中性粒细胞和巨噬细胞清除效率。值得注意的是,这些化脓性细菌还可能诱发细胞程序性死亡的巨噬细胞吞噬后(phagocytosis-induced细胞死亡,PICD) [<一个href="#B2">2,<一个href="#B3">3]。虽然这种形式的细胞死亡的意义是不清楚,人们普遍认为,早日消除激活免疫效应细胞如巨噬细胞可能严重损害的间隙感染,而消除终末分化吞噬细胞有助于解决炎症过程(<一个href="#B4">4,<一个href="#B5">5]。

在过去的几十年里,细胞死亡是由于坏死或凋亡,不管这个简化的二分忽视存在的非典型的细胞死亡形式(<一个href="#B6">6]。有证据表明,几种不同的死亡程序存在,他们以多种方式相声。基本上,两种形式的程序性细胞死亡(PCD)进行了讨论。I型纤毛运动,这是同义的,经典的细胞凋亡,特点是细胞质凝结和染色质DNA碎片,和细胞收缩到凋亡的身体,其次是去除死细胞的吞噬细胞。相比之下,II型纤毛运动,通常被称为自噬,少的特点。在早期阶段,自噬,质膜可能会改变形态和起泡可能发生<一个href="#B7">7]。通常情况下,自噬细胞显示double-membraned囊泡的积累:自噬空泡(AVs) [<一个href="#B8">8]中最初描述的氨基酸或血清饥饿的细胞。因此,自噬可以被解释为一种生存支持机制。另一方面,AVs等不同的病原体也可以使用沙门氏菌或结核分枝杆菌摆脱时间。这导致吞噬细胞本身的复制的利基市场,最终导致死亡的巨噬细胞(<一个href="#B1">1,<一个href="#B9">9]。尚不完全清楚的细胞自噬活动的原因是死亡或实际上是一个试图阻止它(<一个href="#B10">10]。尽管AVs是描述在II型纤毛运动的背景下,自噬本身并不一定导致细胞死亡,但可以作为一个保护机制与细胞凋亡<一个href="#B11">11]。事实上,细胞死亡或生存似乎是同步的结果但差别明显的凋亡和自噬信号。到目前为止,分子基础和信号事件占凋亡和自噬机制之间的相互关系在很大程度上仍未知。

使用最广泛的细胞信号转导通路之一应对细菌暴露NF -核因子B(κB)途径。信号通过NF -B通路感应是至关重要的,维护、炎症反应和差别和随后对这些还参与调节细胞增殖和生存<一个href="#B12">12]。通常,古典NF -B激活通过磷酸化抑制剂我和随后的退化B(NF -抑制剂B)导致金刚石由于增加转录抑制凋亡基因(<一个href="#B13">13]。此外,完全没有古典NF -B信号经常导致细胞凋亡(<一个href="#B14">14,<一个href="#B15">15]。然而,目前NF -的双重职能B对凋亡过程越来越清楚。有实验证据表明NF -B可以作为职业,以及凋亡转录因子根据细胞类型和细胞环境(<一个href="#B16">16]。此外,它表明NF -B通路可能支持proapoptotic机制之后其促炎的功能(<一个href="#B17">17]。

到目前为止,有关负监管NF -实验证据B信号及其抗炎作用的背景下,细菌感染是稀缺的。最近,我们已经表明,low-virulent的吞噬作用大肠杆菌264.7原始巨噬细胞抑制早期phagocytosis-induced通过古典NF -细胞死亡B激活(<一个href="#B18">18]。本文的研究中,我们确定一个新的角色的NF -264.7 B细胞死亡的巨噬细胞和小鼠骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)短期的大肠杆菌coculture。使用NF -B-suppressed和正常的巨噬细胞,我们证明长期古典NF -激活的抑制B信号后细菌会导致广泛的自噬vacuolarization挑战,改善生存和提高生产在有限合伙人引发刺激细胞因子NF -B-impaired巨噬细胞。这项工作支持的假设信号通过古典NF -B抑制自噬通过抑制autophagy-related基因(atg),从而促进细胞死亡。我们因此描述古典NF -的一个新函数B信号病原体激活巨噬细胞,抑制“自愈”自噬从而导致炎症的分辨率。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和抗体

小鼠巨噬细胞(原始264.7)在DMEM培养(表达载体)补充10% FCS (PAA), 1% Glutamax我(表达载体)和0,02年毫克/毫升Refobacin(默克公司)37^°C在5%股份有限公司₂。转染细胞的长期培养与200年进行g / mL geniticin(表达载体)。刺激细胞培养进行了1g / mL有限合伙人(从大肠杆菌O26: B6,σ)或者是由coculture的细胞e6大肠杆菌(应变全球)1小时,它对应于一个1:100稀释大肠杆菌文化与OD约0,6。随后,大肠杆菌与媒介被洗3次。同步的细胞进行细胞周期分析,他们一夜之间血清饥饿。这种血清饥饿没有后果自噬的发生。我多克隆抗体B(C21) p65 (C-20) c-IAP-2 (h - 85),肌动蛋白(C-11) beclin1从圣克鲁斯(H-30)获得。此外,抗体CD95L(传导),p100 / p52 mTOR, phospho-mTOR, p70S6K和半胱天冬酶3(细胞信号),p50和p-cJun (Abcam) p53(研发系统),和伯灵顿(北部)。骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs),骨髓从C57Bl / 6小鼠股骨的刷新DMEM(表达载体)补充10% FCS (PAA), 1% Glutamax我(表达载体)和0,02年毫克/毫升Refobacin(默克公司)和与L929 DMEM条件培养基培养(30%)。24小时后漂浮细胞recultured和BMDMs被用于实验后1周。长期抑制NF -B激活BMDMs Pyrrolidinedithiocarbamate (PDTC 10米)使用1小时之后删除大肠杆菌。介质交换实验进行了24小时通过收集条件培养基大肠杆菌刺激巨噬细胞并将其添加到nonstimulated模拟和SR巨噬细胞。细胞死亡和形态学检查在接下来的36小时孵化。对引发刺激实验,大肠杆菌进行预处理细胞收集48小时后,清洗和离心机。e6活细胞(台盼蓝排斥)和10 U /毫升干扰素刺激γ和1g / mL有限合伙人(从大肠杆菌O26: B6,σ)24小时和il - 1的含量和il - 12在上层清液测定Elisa按照生产厂家的说明书(研发系统、明尼阿波利斯)。

2.2。转染DNA结构和扩散试验(MTT-Assay)

的pcDNA3-IB-super-repressor质粒(SR)请提供的r . Zwacka博士(德国乌尔姆大学)。克隆的我Bα序列突变在Ser32 / Ser36形成phosphorylation-resistant (A32、A36)我Bsuper-repressor(我Bsr)。转染,新霉素选择subcloning以及扩散分析空载体转染(模拟)和我B(SR)的肽是前面描述的(<一个href="#B18">18]。BMDMs瞬变转染带有LC3-GFP融合构建由教授请提供t Yoshimori(详细信息请参阅[<一个href="#B19">19])。

2.3。蛋白质提取、免疫印迹、电泳淌度试验和rt - pcr转变

核提取制备细胞,洗两次NP40-buffer(10毫米Tris-HCl, 10毫米氯化钠,3毫米MgCl吗₂30毫米蔗糖0 5% NP40 pH值7.0),离心机(1500克)7分钟后跟两个CaCl清洗步骤₂缓冲(10 M Tris-HCl, 10 M氯化钠,3毫米MgCl₂蔗糖、30米,0.1毫米CaCl₂pH值7日,0)。原子核在溶解缓冲resuspended(50毫米Tris-HCl pH值7.6,250毫米氯化钠,EDTA 3毫米,3毫米EGTA,共同1%,0,NP40 5%, 10%甘油)和细胞溶解冰30分钟之后,离心14.000 rpm 30分钟。上层清液(核提取物)被收集并存储80年^°c .总细胞提取细胞直接与溶解缓冲细胞溶解。所有步骤都在4^°c .缓冲补充1毫米βPMSF -glycerolphosphat 2毫米德勤1毫米,10米亮抑酶肽、2毫米PNPP和0.1毫米原钒酸盐。免疫印迹进行如前所述[<一个href="#B18">18]。参加乐队的转变分析,核提取物(1010 g)被孵化0.1 L反应30分钟克/L polydIdC cpm(法玛西亚)和20000³²P -αdATP标记Hiv -德勤b区域含有寡核苷酸在1毫米,10毫米消息灵通的pH值7.6,MgCl氯化钾50毫米,6毫米₂,1.2毫米CaCl₂1毫米德勤,5%甘油。在本地4% polyacrylamid凝胶复合物分离3小时,干,爱克发Cronex 5 x射线的电影。艾滋病毒,b区域包含oligonuleotides是前面描述的<一个href="#B18">18]。显示RNA制备toChomczynski和萨基<一个href="#B20">20.]。5使用上标核糖核酸酶H g RNA是反向转录⁻根据制造商的指示(表达载体)。0.125 rt - pcr进行使用在35 g cDNA周期复合PCR反应使用的鼠标特定引物配对和actin-specific引物在适当的循环条件下多路复用的方法:atg5S:acggagcggcctttcatc,atg5R:ggcttcggctgcattgc;atg7S:tggatacaagcttggctgctac,atg7R:agggtaagaccggtcaagtc;beclin1S:actggacacgagcttcaagatc,beclin1R:ctccaaacagcgtttgtagttc;从而:ctacaatgagctgcgtgtgg,actinR:caggtccagacgcaggatgg。

2.4。死亡,测定凋亡细胞

细胞死亡分析通过DNA染色permeabilized完整细胞propidium碘(π)。简而言之,在刺激大肠杆菌显示细胞被洗两次PBS、固定和permeabilized冰冷的70%乙醇,洗在PBS和resuspended 0.5毫升染色溶液(0.2毫克propidium碘(π),2在PBS g核糖核酸酶)。1小时内流仪进行了分析。扩大hypodense M1人口代表死细胞,当细胞接受古典细胞凋亡通常积聚在一个独特的,窄subG1高峰。更具体地说比π整个细胞的夹层,凋亡细胞检测测定π夹层在孤立的核Nicoletti et al。<一个href="#B21">21]。凋亡细胞核也积累subG1高峰。这种方法还允许细胞周期分析。此外,决心死细胞,膜的完整性丧失,是由台盼蓝排斥。用台盼蓝染色后,300个细胞的比例和死细胞被记录在检查细胞死亡。

2.5。可视化的自噬空泡

自噬空泡可以染色monodansylcadaverine (MDC)根据Biederbick et al。<一个href="#B22">22]。检测在BMDMs AVs,暂时细胞转染LC3-GFP融合构造如上所述。刺激后,细胞被扫描并拍照使用共焦和光学显微镜,分别。抑制自噬可以评估治疗10M 3-MA(3 -甲基腺嘌呤)在3%乙酸可溶性。电子显微镜是由高压冻结,冻结替换所述<一个href="#B23">23]。量化AVs的每个细胞,AVs的总数每25细胞轮廓确定为每个条件。

2.6。差异表达基因的检测

在模拟和老细胞的差异表达基因微阵列分析探测到使用小鼠topic-defined PIQOR™免疫学微阵列(Miltenyi研究)和相应的服务。我们进行了两个生物独立实验使用的总RNA大肠杆菌刺激巨噬细胞。刺激是12至36小时如上所述。如果细胞RNA被用来设置对照实验。老细胞杂化对模拟细胞为每个时间点。表达变化表示为率SR /模拟除以相应的荧光信号强度。因此,价值表明你没有微分调节,值+ 1,1,分别显示对应。差别——对这些没有价值意味着没有表达特定基因或已经从列表删除由于小于2倍变化发现复制和实验。

2.7。统计分析

使用学生的数据进行了分析以及和Mann-Whitney-U测试,分别。一个值被认为是具有统计学意义。所有数据都表示为的意思SE。

3所示。结果

3.1。表达我的BSuper-Repressor生264.7导致减少长期NF -B DNA结合活性大肠杆菌刺激

为了验证生化反应的抑制NF -信号通过老,的表达(图<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig1/" target="_blank">1(一))和NF -(图B DNA结合活动<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig1/" target="_blank">1 (b))super-repressor (SR)巨噬细胞与空载体转染控制细胞(模拟)。我在老细胞,内生B和我Bsr coexpressed在基线条件(图<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig1/" target="_blank">1(一))。在刺激与大肠杆菌老,所有筛选细胞克隆最初透露守恒,但适度减少NF -在前30分钟(图B激活<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig1/" target="_blank">1 (b))。这很可能是因为我内生的退化B(数据没有显示)导致相当大的NF -B释放。在后期时间点低下缺乏NF -B SR细胞活动在后期时间点(图<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig1/" target="_blank">1 (b))。因此在老细胞长期NF -B比模拟细胞激活被废除。为了避免克隆文物由于SR向量的插入位点基因组DNA,我们比较几种不同的克隆对NF -B激活。所有老克隆显示相似的DNA结合活性和刺激我动力学相似B和我Bsr表达诱导后大肠杆菌,分别。因此,我们选择了两个独立的SR克隆(没有。3、19)作为代表抑制SR函数在所有进一步的实验。

我的表达Bsr导致减少核p65积累和p50 36小时后48小时刺激相比,模拟细胞(图<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig1/" target="_blank">1 (c))。NF -B抑制仅限于经典通路无显著差异的核p52积累模式可以检测到在模拟和SR细胞(图<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig1/" target="_blank">1 (c))。此外,扩散率并不在老细胞相比,模拟不同巨噬细胞决定通过MTT试验(数据未显示)。同时,p-cJun水平稳定表明其他应激信号转导途径并不受我的影响Bsr表达(图<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig1/" target="_blank">1 (d))。因此由于最初只是局部封锁NF -B激活这个模型是专门研究分子和细胞的影响可能主要受抑制长期NF -B的活动。

3.2。抑制长期NF -B激活与增加细胞的生存

吞噬作用是一个关键机制先天免疫系统抗击入侵的病原体。吞噬病原体可能导致程序性细胞死亡的感应。因此,我们检查的影响大肠杆菌在巨噬细胞吞噬能力对NF -B信号。细胞死亡以应对短期大肠杆菌coculture NF -相比明显不同于正常B抑制巨噬细胞,通过流式细胞仪分析决定的。早期老细胞死亡的细胞相比,模拟细胞(24小时)显著增加在孵化大肠杆菌(数据<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig2/" target="_blank">2(一),<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig2/" target="_blank">2(b))表明NF -主要是凋亡的作用B在早期激活在细菌的挑战。可想而知,这种机制反映了NF -的一个基本属性激活B细胞应激期间防止死亡。虽然老巨噬细胞的诱导细胞死亡是更迅速比模拟细胞,死是平衡的程度约36小时后在两种细胞类型。随后,剩下的老巨噬细胞开始扩散,这是符合经济复苏的细胞群,而模拟细胞不断死亡。从36小时,模拟细胞的细胞死亡率明显超过NF -B-suppressed SR巨噬细胞。可以由类似的观察台盼蓝排斥、模范的48小时内(图所示<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig2/" target="_blank">2(c))。

排除细胞死亡的模拟和SR巨噬细胞旁分泌涉及监管通过分泌介质循环,我们测试的刺激巨噬细胞条件培养液的能力导致细胞死亡。我们不能检测重要的细胞死亡率在模拟巨噬细胞孵化与模拟或SR-conditioned媒介。我们不能检测的重要细胞死亡SR巨噬细胞使用模拟或SR-conditioned介质(数据没有显示)。总之,NF -B-dependent调节细胞死亡不仅仅是由于介质排泄的差异(例如,肿瘤坏死因子),而是与死亡细胞内在关联程序。

3.3。抑制NF -B激活与液泡的形成和随后的复苏大肠杆菌全身的细胞死亡

常规的NF -B的激活被认为是一个重要的机制,防止细胞程序性死亡在细胞应激(<一个href="#B13">13]。为了阐明机制NF -的早期细胞死亡B-suppressed SR巨噬细胞和正常模拟巨噬细胞的细胞死亡,我们首先研究了刺激细胞的形态结构。很显然,短期大肠杆菌接触模拟细胞的诱导大液泡的形成在第一个24小时(图<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig3/" target="_blank">3上半部分)。36个小时,这些液泡变得越来越大,数量越来越多最终在整个细胞的扩大和随后的细胞死亡后36至48小时。在36个小时,细胞也开始显示膜气泡在细胞凋亡。老细胞显示vacuole-like结构。模拟细胞液泡的SR相比,细胞较小(图<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig3/" target="_blank">3较低的面板)。膜气泡在老细胞只发生在24小时内,但是在之后的时间点缺席。Stimulation-dependent液泡消退36个小时,老细胞回到生理表型。

3.4。细胞死亡的Macropages大肠杆菌公司文化不是由于细胞凋亡

膜气泡的存在表明apoptosis-like机制可能负责模拟细胞的细胞死亡。然而,模拟细胞的形态变化以及在老细胞不同模式在古典细胞凋亡。例如,我们不能发现任何固缩。为了更具体地评价细胞死亡的形式,我们进行一个更敏感的π孤立的巨噬细胞细胞核染色根据Nicoletti et al。<一个href="#B21">21),确定细胞凋亡调节蛋白的表达。

众所周知,细菌摄取可以诱导细胞凋亡的巨噬细胞(<一个href="#B24">24]。然而,NF -的作用B信号在这种情况下还不清楚,可能pathogen-dependent [<一个href="#B25">25]。如图<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig4/" target="_blank">4(一)临时的挑战大肠杆菌1小时增强细胞死亡在SR相比,模拟细胞在24小时内。然而,一个典型的subG1-peak不能被孤立的细胞核染色(<一个href="#B21">21]。之前这个证实细胞死亡率与完整的细胞染色(图确定<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig2/" target="_blank">2)。在48小时内,当模拟细胞的细胞死亡的比例明显超过了SR的巨噬细胞,我们还未能发现一个限制subG1-peak。因此,我们调查是否染色的原子核与核分裂和apoptosis-relevant蛋白质的正常表达。有趣的是,典型的凋亡DNA碎片梯子和重大监管的经典proapoptotic蛋白质可以在相关时间点检测在模拟或SR细胞(数字<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig4/" target="_blank">4(b),<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig4/" target="_blank">4(c))。Proapoptotic伯灵顿以及p53表达下调在模拟细胞24-36小时poststimulation但又诱导在48小时内,而老细胞通过免疫印迹(图展示稳定水平<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig4/" target="_blank">4(c))。NF -没有区别B-regulated凋亡cIAP2(凋亡抑制剂2)或proapoptotic CD95L表达能被检测出来。然而,在24 - 48小时poststimulation效应半胱天冬酶3是模拟细胞裂解低扩展而不是老细胞(图<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig4/" target="_blank">4(c))。这可能部分解释偶尔出现的模拟细胞的凋亡形态学。裂开的效应细胞凋亡蛋白酶3指导细胞程序性细胞死亡(<一个href="#B26">26),我们的数据显示一个间接proapoptotic NF -角色B在后期时间点后细菌的挑战。这是符合增加伯灵顿在48小时内模拟细胞的水平。强健的pro - SR细胞和凋亡蛋白在细菌的挑战,然而,表明NF -古典的封锁B信号导致的死亡通路稳定防止定这些巨噬细胞的死亡。

3.5。抑制长期古典NF -B活动促进巨噬细胞的自噬大肠杆菌挑战

解决机制的细胞死亡形式,我们评估的性质模拟和老细胞的液泡。Monodansylcadaverine (MDC)积累特别是在AV,所谓的“自噬小体”。细粒度的染色模式表明AVs的形成(<一个href="#B22">22]。标签的大肠杆菌刺激与争取民主变革运动的主要导致扩散模拟细胞染色模式和只有少数染色(图24小时后液泡<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig5/" target="_blank">5(一))。48小时的观察期间,没有积累的MDC AV可以检测到在模拟细胞。相比之下,大肠杆菌coculture老细胞明显引起广泛的争取民主变革运动积累在AVs(图12到24小时<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig5/" target="_blank">5(一))。随后,AV染色在减少36至48小时poststimulation(数据没有显示)。外观AV与PI-hypochrome细胞的发生密切相关。治疗老细胞3-methyladenine (3-MA),一个著名的自噬抑制剂,导致分散染色的巨噬细胞和AVs(图消失了<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig5/" target="_blank">5(一))。电子显微镜证实了这些观察。在24小时后大肠杆菌老治疗典型AVs主要可以检测到细胞(图<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig5/" target="_blank">5(b))。重要的是,大肠杆菌对待BMDMs表现出类似的模式。的相同器官BMDMs是暂时性的转染LC3 Apg8p必不可少的同时常常用来专门检测自噬在酵母和AVs (<一个href="#B19">19]。24小时之后大肠杆菌挑战,BMDMs,对待PDTC抑制NF -B 12小时前这个观察点,清晰地展示了颗粒形态,明确表明AVs。这些模式并没有检测到控制BMDMs PDTC处理(图<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig5/" target="_blank">5(c))。综上所述,这些数据表明,古典NF -B在细菌挑战阻止巨噬细胞的自噬激活。

3.6。在大肠杆菌刺激Utophagy-Related基因atg5和Beclin1 NF -稳定表达杂交细胞,但在控制巨噬细胞抑制

据了解,至少有三个主要的自噬相关基因(atg)基因参与哺乳动物的感应和自噬空泡的形成:beclin1,atg5,和atg7。这些基因的产物对自噬的过程是必不可少的,因为他们的自噬过程的缺乏导致取消<一个href="#B27">27,<一个href="#B28">28]。为了研究分子基础如何NF -B抑制促进自噬,rt - pcr分析,最相关的autophagy-related基因。自噬相关基因的测定显示一个常数的表达beclin1,atg5,和atg7在老细胞自噬空泡的形成(数字<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig6/" target="_blank">6 (b),<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig6/" target="_blank">6 (c))。相反,模拟细胞显示明显减少atg5和beclin1在12到24小时内基因表达。同样的,beclin1蛋白表达也减少了在模拟细胞24小时后大肠杆菌coculture,而它在SR巨噬细胞(数据保持不变<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig6/" target="_blank">6 (d),<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig6/" target="_blank">6(e))。因此,长期的古典NF -B激活可能是通过抑制autophagy-relevant间接抑制自噬基因。

3.7。生存和死亡的微分表达式基因微阵列分析

阐明炎症的分子机制相互关系能力和巨噬细胞的细胞死亡,我们进行了基因表达分析使用PIQOR免疫学微阵列。如表所示<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/tab1/" target="_blank">1的表达几个NF -B-responsive目标基因的影响大肠杆菌在老细胞的刺激。正如所料,古典NF -杂交巨噬细胞表现出抑制促炎的基因。同时,Ikba和nfkb2在老细胞抑制2倍。此外,基因表达下调的古典NF -B缺乏针对不同死亡相关的基因编码。有趣的是,抗凋亡基因(A20 c-IAP12)等基因proapoptotic CD95、半胱天冬酶1,组织蛋白酶D在SR表达下调细胞凋亡的次要角色大肠杆菌治疗和NF -B-suppressed macropahges。第二个涉及到几个不同的监管组基因的转录因子和酪氨酸激酶,例如,src1。最显著抑制soc因素、ATF3 IRAK-M。他们是参与细胞因子信号。在几乎所有情况下,微分调节的基因只有在短期挑战大肠杆菌。这就解释了如果模拟之间缺乏正常生长行为的差异和SR细胞(数据没有显示)。

第三组显著的基因调节在NF -B失活,大肠杆菌挑战包括细胞周期和proliferation-associated基因如细胞周期素B2、细胞周期蛋白D1,而PIM1表达下调。这表明修改老细胞的增殖特性在刺激。综上所述,数据来源于微阵列分析支持了这样的观点,即长期NF -B活性抑制机制,参与细胞功能与生存相关antiapoptosis等和分化,增殖,proinflammation。

3.8。增强细胞因子的生产在有限合伙人引发刺激大肠coli-Pretreated NF -杂交巨噬细胞

自噬的NF -解决假设B-suppressed巨噬细胞促进这些细胞的自我修复大肠杆菌进行预处理SR和模拟巨噬细胞与LPS重振/干扰素γ在36小时和摘要意思和IL12生产测量。作为显示在图<一个href="//www.newsama.com/journals/mi/2008/725854/fig7/" target="_blank">7,这些细胞因子的生产是在老细胞显著增强。这些数据支持这样的想法,自噬导致老细胞的功能恢复。综上所述,我们的研究结果表明,古典抑制NF -B激活最终巩固了炎性巨噬细胞。因此古典NF -在之后的时间点B抑制可能是防止炎症的决议,并可能促进慢性炎症。

4所示。讨论

在巨噬细胞中,我们已经表明大肠杆菌最初引发NF -B信号,以防止细胞死亡(<一个href="#B18">18),而后来导致PICD,机制,通常取决于caspase-3激活(<一个href="#B3">3]。这表明proapoptotic函数的古典NF -B通路在稍后的时间点巨噬细胞激活。事实上,长期的抑制NF -老B活动在我们的巨噬细胞与降低效应procaspase 3乳沟和提高生存率48小时之后大肠杆菌挑战而控制巨噬细胞。正如所料,在更早的时间点在NF -细胞死亡率更高B-suppressed巨噬细胞与半胱天冬酶3不诱导。最有趣的是,这种形式的细胞死亡与自噬相关。在这种情况下,重要的是要注意,负面的监管还存在自噬活动报道(早些时候<一个href="#B29">57]。另一方面,这是表明,抑制自噬触发caspase-3激活(<一个href="#B30">58]。这些数据符合观察半胱天冬酶3激活自噬的模拟细胞与镇压。其他几个事实的发生自噬在NF -B-suppressed巨噬细胞治疗大肠杆菌。除了典型的住客,自噬过程可能伴随着“apoptotic-like模式”,如细胞膜出泡(<一个href="#B7">7作为我们老巨噬细胞中观察到。Autophagy-specific MDC-positive AVs无法检测到在模拟整个观察期表明巨噬细胞激活的古典NF -这些AVs B区块的开发。此外,LC3, yeast-homolog atg6,被证明是特别参与自噬空泡的形成(<一个href="#B19">19),也未能积累正常BMDMs后续的液泡大肠杆菌治疗。NF -B PDTC失活,然而,导致特定的积累在AVs证明自噬在这些细胞。它也表明NF -B-suppressed尤因肉瘤细胞与肿瘤坏死因子刺激α展览自噬(<一个href="#B31">59]。这表明,自噬的镇压古典NF -B激活构成一般的细胞机制。我们的观察大肠杆菌的差别导致对这些autophagy-related基因等beclin1和atg5(<一个href="#B28">28,<一个href="#B32">60]在NF -认为B-competent巨噬细胞通过基因失活行为的一种机制。通过NF -这可能发生B组成的p50为,显示出抑制基因转录(<一个href="#B33">61年]。然而,我们推测,NF -间接B-dependent抑制自噬的发生。没有相关的NF -可以检测到B网站beclin1和atg5基因的启动子区域使用通过MatInspector计算分析软件(<一个href="#B34">62年]。相比之下,p53的假定的结合位点,这是消极的受NF -B,可以检测到beclin1启动子(位置1676)。p53的参与监管的beclin1表达式是未知的。然而,同时抑制beclin1 atg5, p53基因表达大肠杆菌挑战在模拟巨噬细胞表明消极的直接或间接调节自噬相关基因的NF -NF - b可能反过来活动B和p53 [<一个href="#B35">63年]关于自噬的发生是非常重要的在我们的系统。与不变的NF -B信号在模拟细胞,我们可以通过微阵列和免疫印迹分析表明NF -B-defective老细胞显示缺乏抑制p53转录和p53蛋白表达大肠杆菌治疗。P53反过来自噬相关基因的差别可以防止对这些导致自噬。因此,我们得出这样的结论:古典NF -B激活在细菌摄入通常抑制自噬至少部分通过自噬基因的失活。综上所述,我们的数据展示的古典NF -一个新的角色B信号与目标抑制巨噬细胞自噬的环境中细菌的接触。

因此晚期凋亡抑制NF -B-inhibited巨噬细胞。怎么可能抑制细胞凋亡(PCD I型)促进自噬过程?众所周知,心态占据主导地位的凋亡proapoptotic分子(例如,见伯灵顿/ bak^{- / -}小鼠胚胎成纤维细胞,不能接受古典凋亡)倾向于自噬的发生对依托泊苷治疗(<一个href="#B36">64年]。相反,它也表明,抑制macroautophagy (PCD II)触发细胞死亡(PCD) (<一个href="#B30">58]。因此,可想而知,并行自噬和纤毛运动总是诱导。结果取决于流行的因素。自噬和纤毛运动也可能是由相同的蛋白质。结果表明,bcl - 2抑制细胞凋亡和自噬(<一个href="#B37">65年]。在这种背景下出现的一个问题是是否支持细胞死亡或垂死的细胞自噬活动实际上是一个试图阻止它。据我们所知,还没有研究证明自噬诱导细胞死亡。事实上,有相当多的证据表明,自噬活动在垂死的细胞可能会试图避免死亡(<一个href="#B38">66年]。我们相信,巨噬细胞加速复苏缺乏长期的古典NF -在这个背景下B必须被激活。因此细胞的命运可能是由专业的平衡程度和凋亡信号调制的拯救自噬。

然而,目前还不清楚什么样的细胞死亡模拟巨噬细胞执行后48小时大肠杆菌挑战。Bacteria-induced死亡的细胞可能与不同的细胞死亡形式,如纤毛运动我或坏死(<一个href="#B3">3,<一个href="#B39">67年]。尽管这些细胞激活半胱天冬酶3,未能检测金刚石类型我的迹象,如核DNA碎片,与古典凋亡很难协调。它不能排除nonapoptotic巨噬细胞凋亡细胞的吞噬作用的面具典型的凋亡特征。然而,台盼蓝的吸收和缺乏古典subG1高峰越来越hypodense propidium碘更积极的人口可能反映了坏死模式。细胞凋亡和坏死通常不支持清晰可辨“程序性坏死”这个词最近出现(<一个href="#B40">68年]。大量的证据关于生物坏死细胞程序性死亡的重要性,以破坏细胞膜的完整性(<一个href="#B40">68年]。在坏死,胞质成分渗入细胞外空间这可能引发炎症反应。然而,这也可能促进一个适应过程出现强烈的免疫反应(<一个href="#B40">68年]。这是符合我们的数据公布前,我们已经表明,古典NF -B激活巨噬细胞早期防止PICD并最终促进t细胞激活(<一个href="#B18">18]。在这一点上,但是,它不能歧视之间的影响部分抑制早期古典NF -B激活和其完全没有迟到时间点大肠杆菌挑战。因此不能排除所有观测(早些时候报道,<一个href="#B18">18)可能来自减少初始古典NF -B的活动。此外,炎症巨噬细胞功能是通过交互直接监管的古典和替代NF -B信号(<一个href="#B41">69年]。为了解决这一点,与特定的IKK动力学研究β和IKKα抑制剂需要执行。然而,随着古典NF -B激活/定义取决于我Bα退化,我们的研究让一般洞悉inflammatory-associated细胞过程中规范化的作用途径,如巨噬细胞自噬。

NF -生物的重要性是什么B-mediated抑制自噬?PCD I型和随后的摄入炎症细胞的吞噬细胞的生理过程的死亡细胞的炎症和本质上有助于体内炎症的决议<一个href="#B42">70年]。促进白细胞凋亡的信号是重要的炎症和凋亡细胞本身的分辨率可以支持这一过程。结果表明,巨噬细胞的吞噬凋亡细胞的清除有利于释放TGF -β1进而抑制巨噬细胞的促炎的活动(<一个href="#B43">71年]。这个过程被认为是NF -B相关联(<一个href="#B17">17,<一个href="#B44">72年]。在这里,我们表明,缺乏后期proapoptotic NF -B信号导致增强巨噬细胞的自噬相关的生存。此外,我们的数据表明,细胞凋亡和upregulation proliferation-regulating基因的差别,对这些在NF -B-suppressed巨噬细胞复苏的高潮inflammatory-differentiated巨噬细胞。这是符合增加细胞因子NF -的生产B-inhibited有限合伙人引发刺激巨噬细胞。因此我们推测自噬促进炎性巨噬细胞种群的生存,甚至可能导致长期的发作或慢性炎症。

总之,我们的数据大纲antiautophagic角色的古典NF -B在巨噬细胞活化,可能会导致炎症的决议。NF - death-supporting函数B在这种背景下时必须考虑抗炎疗法的基础上NF -B-inhibition。进一步的研究需要阐明是否抑制NF -B活动过程中传染病延长恢复体内。

确认

作者要感谢博士r . Zwacka我的慷慨的礼物B进行super-repressor构造,埃伯哈特Reithmeier实验建议和新浪海德里希,和Rosemarie Mayer技术支持。他们也感谢Tamotsu Yoshimori LC3-GFP构造。这项工作是由德意志的格兰特Forschungsgemeinschaft给我们。