文摘
背景和目标。微循环障碍在慢性阶段复杂区域疼痛综合征(crp)增加血管收缩,有关组织缺氧和代谢组织受影响肢体的酸中毒。内皮功能障碍是建议减少血液流动的主要原因。本研究的目的是检查内皮一氧化氮合酶的分布(以挪士)和endothelin-1 (ET-1)相对于血管内皮标记密度由CD31-immunoreactivity皮肤组织的慢性患者c反应蛋白。方法。我们进行免疫组织化学染色在部分皮肤标本来自截肢(一只胳膊和一条腿)的两个患者c反应蛋白。结果。相比,近端标本数量的增加我们发现内皮细胞迁移以及增加远端皮肤标本以挪士活动。结论。我们发现迹象表明,内皮功能障碍在慢性c反应蛋白过程中发挥作用。
1。介绍
复杂区域疼痛综合征1 (crp)被定义为“一种综合症的躯体感觉的中枢神经系统表示,somatomotor,和交感神经系统改变与重要的外围变化如水肿、炎症的迹象,交感传入耦合,和营养变化”(1]。外围的方式和中央的变化只是部分交互理解(1]。在慢性阶段的c反应蛋白,增加血管收缩(2),组织缺氧(3),和代谢组织酸中毒(4,5]表明微循环受损,影响营养血流在表面和深层组织(6,7]。
的内皮调节血管张力通过释放endothelium-derived血管舒张药包括一氧化氮(NO)、环前列腺素、缓激肽、和endothelium-derived超极化因子;和血管收缩剂,如endothelin-1 (ET-1)和血管紧张素ⅱ,为了应对大量的生物化学和物理刺激(8]。越来越多的证据表明(9]表明,内皮功能障碍的主要原因是血液流动减少慢性冷crp。
尽管许多论文发表的关于crp自1545年首次描述(10)、文学关于相关的血管病理改变是稀缺的。关于这个主题的一些论文描述清晰可见整个微血管系统的异常,包括增加毛细血管的数量(11,12),内皮肿胀,血管的变化由薄板组成的墙(13]。令人印象深刻的毛细管的变化范围从严重与内膜的增厚基底膜空泡形成,血管周围水肿和碎片从基底膜层之间,周围的周坏死(14,15]。极大地增厚的多层夹层墙被发现,从而极大地降低血管的内径(12,16]。内皮细胞出现萎缩,毛细血管内皮细胞碎片,只有在腔观察,而其他毛细血管增厚可以追踪的基底膜,缺乏其他细胞残留物的存在15]。
组织化学过程(17和免疫荧光16)被用来调查皮神经纤维的分布,但没有使用的报告在c反应蛋白免疫组织化学染色法来评估内皮功能障碍。关键元素在内皮的功能没有和ET-1。失去endothelium-dependent期间不会发生介导的血管舒张早期内皮功能障碍(18]。因为没有半衰期时间只有3 - 5秒(19),我们测量内皮一氧化氮合酶(以挪士),这是一个宪法内皮细胞从精氨酸酶生产没有。ET-1生产和/或活动增加可能参与一些病理状态相关的功能失调的内皮(20.]。
本研究的目的是研究以挪士和ET-1与血管的分布密度所代表的皮肤组织中内皮标记CD31-immunoreactivity截肢患者的crp。
2。方法
2.1。病人
人体组织获得手术切除四肢的两个病人患有1型c反应蛋白,根据Bruehl诊断标准(21),疼痛治疗中心的伊拉斯谟MC。两个病人截肢前书面知情同意。下肢截肢的病人和病人的上肢皮肤样本,收获截肢后,立即被背侧的病人的脚和背侧的手患者B;这两个样本归类为远端组织样本。近端组织样本是从附近的切削面,采取组织似乎最不病。
病人是一位46岁女性发达后crp在她的右腿肌电图记录是在1996年。一年以后,症状出现在左腿,1998年,在她的右手。病人的抱怨持续尽管激烈的康复,两条腿,右手成为非功能。两条腿有水肿,有严重的挛缩和疼痛的腿和手。走是不可能的,她为交通依靠轮椅。在2003年访问我们的诊所,肌肉力量,不能测试和反应能力,协调两腿和手有感觉过敏。她对待扑热息痛、阿米替林、durogesic,甘露醇,巴氯芬,收到一个marcaine和芬太尼硬膜外块。由于双腿连续感染(erisipelas) 2003年6月,是抗生素,但感染耐药治疗。因此,左腿被截肢2003年10月,紧随其后的是右腿一周后。术后治疗是复杂压力溃疡和她出院了使用扑热息痛和曲马多疼痛控制。 A video thermographic recording was not made, but the examining physician described both legs as very cold.
病人B是一个38岁女性开发c反应蛋白在2002年12月的右手第二掌骨骨折的结果。石膏10天后,她表现出严重的症状crp与疼痛,水肿,挛缩。尽管广泛的药物治疗,以减少疼痛和炎症,改善外周血流,和缓解痉挛状态,病人发展严重的肌张力障碍的右手。肌张力障碍和疼痛使传统的指甲保健不可能;因此,每隔几个月剪指甲是在全身麻醉下进行。病人在她的手腕和手指挛缩,痉挛的肌肉组织,灼痛,触诱发痛和痛觉过敏,水肿,提高蒸腾,过多的毛发生长,深色皮肤的颜色受影响的肢体。一个视频thermographic记录(22,23肢体]表明,c反应蛋白是6.5°度比侧控制的影响。肩功能是正常的。脊髓刺激试验在2004年2月没有成功。在病人的请求,他再也无法应付的负担频繁的全身麻醉,2006年5月上臂截肢了。没有术后并发症和患者经历了戏剧性的减少疼痛。
2.2。CD31免疫组织化学染色,以挪士
为了证明血管状态的c反应蛋白皮肤组织,内皮标记CD31被免疫反应性的可视化(IR)染色。
冰冻的皮肤组织样本系列6中被削减米部分,转移到poly-L-lysine-coated显微镜载玻片(Menzel-Glaser Omnilabo,布雷达,荷兰),空气干燥,储存在−80°c .免疫组织化学染色,部分被解冻,固定丙酮十分钟,冲洗和磷酸缓冲盐(PBS, pH值7.8)。染色过程中进行半自动色料(泽斯特Sequenza Shandon科学,荷兰)。幻灯片是孵化10%正常山羊血清(门店;Sanquin,阿姆斯特丹,荷兰)10分钟,然后用鼠标主要反人类的抗体CD31 (JC / 70 Dako、斯特鲁普、丹麦)或以挪士(sa - 258 BIOMOL国际石油醚英国埃克塞特)60分钟。抗体阻断缓冲区被稀释1%(阻塞试剂,罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)。每次孵化后一步,幻灯片和PBS冲洗5分钟。孵化与主抗体后,部分被冲洗和孵化与生物素化的山羊antimouse抗体(BioGenex、Klinipath Duiven,荷兰)和10%的正常人血清(NHS;Sanquin) 30分钟。这一步之后,孵化与碱性phosphatase-conjugated链霉亲和素(NHS Biogenex Klinipath)和10%另一个30分钟。幻灯片与PBS和三羟甲基氨基甲烷缓冲液冲洗(三羟甲基氨基甲烷HCl 0.1 mol / L,液pH值8.5),然后用新的碱性品红孵化基质(浓度、Kongen、德国)在三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释。 Finally, the sections were washed with PBS, counterstained with Gill’s hematoxylin (Merck, Darmstadt, Germany) for 30 seconds, rinsed with tap water, dried, and embedded in VectaMount (Vector, Burlingame, Calif, USA).
2.3。免疫组织化学双ET-1和CD31染色
在丙酮和PBS和清洗,修复后内源性过氧化物酶被叠氮化钠0.1%和0.03%过氧化氢在PBS 30分钟。部分门店10分钟冲洗和孵化10%,其次是孵化与老鼠反人类的ET-1 (3 g10、研发系统,阿宾顿,英国)60分钟。部分是冲洗和孵化与山羊antirat抗体结合碱性磷酸酶(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)和10% NHS 30分钟。此后,幻灯片是冲洗和孵化鼠标反人类的CD31 60分钟。然后用生物素化的部分被冲洗和孵化山羊antimouse抗体和10%的正常人血清(NHS)和10%的正常大鼠血清(Sanquin) 30分钟。洗后,幻灯片与streptavidin-conjugated孵化过氧化物酶(NHS Biogenex Klinipath)和10%另一个30分钟。与PBS和衬底三羟甲基氨基甲烷缓冲液冲洗后,幻灯片在快速孵化30分钟蓝色底物(σ)。最后,部分被冲洗,孵化与过氧化物酶新星红底物(向量)5分钟,冲洗PBS,嵌入VectaMount。
2.4。量化的免疫反应
以挪士和CD31染色进行邻串行部分的幻灯片。幻灯片使用徕卡显微镜检查固定的徕卡相机DC500数字化图像。半定量的评价不同的标记是由计数积极的真皮血管的数量从远端和近端两个部分每个标本。在测量使用徕卡的真皮的总面积成像分析系统,积极的血管的数量每平方毫米计算。对于ET-1和CD31双重染色,我们确定的数量ET-1阳性细胞在真皮和积极的百分比ET-1血管对血管的总数。
3所示。结果
3.1。在c反应蛋白血管地位
定性差异远端和近端标本图所示1(一)。这些差异的图像经定性分析部分。在这两个病人,内皮细胞免疫反应性更突出在远比在近端标本。在病人,平均数量的CD31-IR毛细血管在远端组织43血管/毫米2与14血管/毫米2在近端组织;在病人B,意味着39和19血管/毫米2,分别。
(一)
(b)
3.2。以挪士免疫反应性
以挪士免疫反应性毛细血管和其他小直径血管突出在远端标本(见图1 (b))。eNOS-IR内皮的测量病人血管23岁/毫米2在远端组织和血管/ 7毫米2在近端组织;在病人B,意味着20和13血管/毫米2,分别。
3.3。比率
以挪士/ CD31-IR船只相似的比率。在病人,平均比率在远端和近端组织分别为53%和50%,分别而在病人B,分别平均比例分别为51%和68%。
3.4。Endothelin-1阳性细胞
ET-1-positive细胞的平均数确定在真皮和血管(图2)。在患者,有81 ET-1-positive真皮细胞/毫米2在远端组织与22 ET-1-positive真皮细胞/毫米2在近端组织;在病人B中,有42个和12 ET-1-positive真皮细胞/毫米2,分别。的平均百分比ET-1-positive血管是相似的;在病人,有70% ET-1-positive远端血管组织和近端组织的69%;在病人B,平均值分别为78%和63%,分别。
4所示。讨论
因为对皮肤活检的过度反应的风险增加(15),我们不能冒CRPS-affected四肢的皮肤组织样本以通常的方式。因此,我们使用标本取自截肢,很少使用。近端和远端切除标本的腿或者手臂从两个不同的患者截肢后,解剖和深度在液态氮冷冻。标本从contra-lateral或健康组织没有可供比较,我们认为远端标本最严重和近端非或影响最小组织标本。这是第一个研究调查的分布以挪士ET-1 crp患者的组织,因此我们决定限制研究皮肤组织,在皮肤疱液从以前的观测后crp的病人。扩大研究肌肉和/或神经组织可能提供额外的见解机制crp。
组织的血液分布改变患者的crp。人们普遍认为这种疾病的过程中,部分由于停止使用,组织会发生缺血,导致慢性疼痛(24]。然而,到目前为止,没有证据表明这些患者内皮功能障碍或受损的血管生成以应对缺血。我们观察到在内皮标志物的表达区域差异CRPS-affected四肢。正态分布的信息这些标记上层或下肢近端和远端之间是不可用的。表达CD31、以挪士和ET-1最高远的标本,代表受影响最严重的病变样本四肢。然而,以挪士/ CD31比率相似,从51%到68%不等。Palatka et al。25]报道以挪士/ CD31比率92%健康的粘膜活检,而组织样本中这一比率是8%患有克罗恩病和溃疡性结肠炎患者样本的82%,这表明在流感传染内皮细胞以挪士活动减少。虽然从粘膜值可能不是与皮肤组织的价值观在我们的研究中,以挪士活动的建议是在我们的病人减少,但并不显著。此外,我们没有观察到明显的地区差异,与过程中疾病的观察,通过整个肢体疼痛蔓延,c反应蛋白也可能出现在反侧肢体和/或其他四肢(26]。它已经表明,在缺氧,内皮细胞标记物的表达CD31和增加以挪士(27]。在缺血的情况下,以挪士是必不可少的促进抵押品增长为了恢复血液分布到组织(28,29日]。因此,在患者c反应蛋白,补充没有前兆不会因为以挪士活动提供好处是妥协。慢性患者c反应蛋白与endothelium-independent没有捐赠者可能是一个更有效的策略30.]。
我们的数据证实了之前报道增加毛细血管密度CRPS-affected组织(11,12],显示更多的ET-1-positive血管/毫米2在远端和近端标本。上却有显著的差异(3 - 4折)ET-1-positive细胞数量的远端和近端之间的真皮。ET-1促进内皮细胞的增殖和迁移通过endothelin-B受体(31日]。这些迁移细胞与肿胀和薄板状的墙中断(13]。ET-1表达明显增加远端肢体早些时候确认工作由我们小组中我们发现高浓度的ET-1表面起泡液体从crp四肢远端地区的收获24]。然而,改变ET-1-positive细胞的数量和皮肤疱液浓度不一定反映的数量的增加endothelin-B受体结合CD31-positive内皮细胞(31日]。然而,ET-1阻滞剂可以提供救济。
本研究仅限于只有两个c反应蛋白1型患者,和缺乏适当的控制侧的形式组织,或一个正态分布的这些标记。患者慢性和与许多医学治疗和介入程序。因此结论只适用于潜在的机制,维持慢性c反应蛋白,如严重的血管收缩,血液供应分配由于异常血流分流营养血管灌注不足,缺氧,乳酸增加,和酸中毒1]。
总之,我们发现表明内皮功能障碍在慢性c反应蛋白过程中发挥作用。近端标本相比,我们发现越来越多的内皮细胞迁移以及增加远端皮肤标本以挪士活动。
确认
我们感谢博士的技术援助琼·豪斯泰之(病理学系),Feikje Wesseldijk,和范Bodegraven艾美奖。研究了作为一个趋势(创伤相关神经功能障碍)的一部分知识联盟,集CRPS1研究。人力成本的乔治Groeneweg由荷兰政府拨款资助(BSIK03016)。