文摘

在inflammosome复杂,NALP3或NALP1结合ASC和激活caspase-1导致il - 1 。在小鼠LPS-induced眼部炎症,il - 1的生产 是增加了。我们建议NALP3——或者NALP1-inflammasome复杂可以参与LPS-induced眼部炎症。在这工作,眼、脑、睾丸、心、脾、肺和获得从摘要:母鸡老鼠LPS处理3 - 48小时,NALP1b的表达,NALP3, ASC, caspase-1, il - 1 ,地震-确定。渗透白细胞产生il - 1 前房被发现在12小时后治疗。高调节表达NALP3, ASC, caspase-1, il - 1 同时发现,地震时白细胞渗透被观察到。NALP1b中没有检测到治疗老鼠的眼睛。NALP3也在心脏和肺。这些结果表明,NALP3 -,但不是NALP1-inflammosome复杂,参与小鼠LPS-induced眼部炎症。

1。介绍

的先天免疫是第一个障碍防止眼部感染。toll样受体(通常),属于模式识别受体(PRRs)的家庭,已经承认其所涉及的分子分子模式(pamp)导致眼部炎症过程。然而,等PRRs nod样受体(NLR)也可以参与这一现象。人类基因组数据库显示,NLR由至少22基因家族。替代的名字为这个家庭包括卡特彼勒、点头,NOD-LRR。NLRs有三个结构域,远程雷达领域(carboxy-terminal),中间层纳赫特(国家统计局;点头)域和一个效应域(伴),可pyrin域(PYD),半胱天冬酶招聘领域(卡)或杆状病毒抑制剂细胞凋亡蛋白重复(出生)域1]。

基于纳赫特域的演化历史(这只是出现在NLR),特定类型的效应域,22 NLR家庭成员可以在两个大亚科分类:的点头(NLR家庭卡域包含)也称为NLRCs,和NALPs (NLR家庭,pyrin域包含)也叫NLRPs。通过基因组数据库搜索,14 NALPs成员已确定在人类基因组中(1,2]。NALPs最近发现,这些分子参与眼部炎症仍然未知。

NALPs行之有效的特征之一是他们的能力与凋亡speck-like蛋白质(ASC)通过PYD-PYD交互。ASC编码22-kDa蛋白质包含carboxy-terminal卡和一个伴PYD,适合作为一个适配器PYD -和底牌蛋白质分子。ASC和NALPs之间交互显示最初NALP1 (Nlrp1 / DEFCAP /南京/ CARD7),随后还发现NALP2和NALP3 (Nlrp3 / PYPAF1 / Cryopyrin / CIAS1)。ASC PYD的几个NALPs PYD的相互作用,而ASC的卡片新兵的procaspase-1卡激活(3,4]。所需的活动caspase-1被发现积极的il - 1的生产β和地震-激活巨噬细胞和单核细胞5]。当NALP和ASC与激活caspase-1或caspase-5交互,他们创建一个细胞内复杂的称为inflammosome [1,2]。

超过一种类型的inflammasomes已确定。NALP1-inflammasome NALP1组成,ASC, caspase-1 caspase-5,而NALP2/3-inflammasomes包含NALP2或NALP3, ASC和caspase-1。第四个inflammasome由要诀,ASC, caspase-1 [1,2]。NALP12 inflammasome复杂但不形式参与炎症是一种消极监管机构干涉IRAK-1功能,导致镇压TLR信号(6]。

LPS-induced眼部炎症模型来研究分子机制参与小鼠葡萄膜炎,促炎细胞因子如il - 1的表达β,肿瘤坏死因子α存在,il - 6 (7]。我们建议一个inflammasome复杂可以参与小鼠LPS-induced眼部炎症。信使rna表达NALP1b在这项工作,NALP3, NALP12, ASC, caspase-1, il - 6、TNFα、地震和il - 1β在老鼠的眼睛LPS处理进行了研究。

2。材料和方法

2.1。鼠标应变

摘要:母鸡老鼠(哈伦,墨西哥城,墨西哥)容易被内毒素眼部炎症。所有老鼠都健康,6 - 8周大,不存在任何眼科改变。所有的老鼠都保持在无菌条件下在治疗。

实验协议进行按照研究所Politecnico Nacional语句的使用动物研究。

2.2。LPS-Induced眼部炎症

生成LPS-induced眼部炎症,影响小鼠收到拦路贼注入200 克大肠杆菌k - 235有限合伙人(σ化学公司,密苏里州,美国)在50岁 L磷酸盐溶液(PBS)。老鼠被颈椎脱位在3、6、12、24、48小时后处理和眼睛,脑、睾丸、心脏、脾脏,肺从每个鼠标了。控制,五个老鼠收到了拦路贼注入50 L无菌PBS和48小时后死亡。5组小鼠治疗包括在每一次的治疗。从每个老鼠,一只眼睛在组织学分析甲醛固定,另一个是用试剂盒(美国加州体外的,卡尔斯巴德)试剂进行rt - pcr分析。

2.3。组织学分析

验证如果白细胞的浸润的眼睛治疗小鼠发生,在缓冲福尔马林固定的眼睛(3.5 g Na P 无水,6.5 g Na P ,40%甲醛)是嵌入在石蜡。部分3 m幻灯片与haematoxylin-eosin染色。量化的渗透细胞,观察细胞每视野(40 x)也计算在内,平均值是报道。

2.4。免疫组织化学分析

免疫组织化学分析是在3.0开发的 m的眼和睾丸组织与缓冲甲醛固定。兔多克隆免疫球蛋白antimouse il - 1β(美国加州圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯)和无关紧要的兔免疫球蛋白(圣克鲁斯生物技术)被用来评估表达的蛋白质,紧随其后的是一个二级生物素化的抗体和链霉亲和素/过氧化物酶复合物(LSAB +装备过氧化物酶,Dako Cytomation, Carpinteria,加州,美国),和可视化TACS-Blue标签(美国明尼苏达州研发系统)作为发色体和核快速复染色红复染色(Sigma-Aldrich,密苏里州,美国)。

2.5。RNA隔离和rt - pcr分析

所有研究器官D-PBS消除血液中被彻底洗干净。执行总RNA提取试剂盒试剂和对待DNAse我免费的核糖核酸酶。逆转录酶(RT)反应,总RNA (3 g)和0.5 克的低聚糖(dT (表达载体)变性,享年70岁°C 10分钟,1 x单链缓冲区,0.5毫米德勤,500年 每个核苷酸的米,和200 u MMLV逆转录酶(美国俄亥俄州英杰公司)补充道。在42 RT反应进行°C 1小时。PCR反应是用1 L的cDNA、1 x缓冲区,德国1毫米 ,200年 每个核苷酸的M, 1 u TaqDNA聚合酶,和0.2 每个NALPs M, ASC caspase-1, il - 1β、地震和β肌动蛋白引物(见表1)。优化PCR条件30 92年的周期°C 30秒,60°C 30秒,72°C 30秒。

表1
寡核苷酸序列。

semiquantitate PCR产品,扩大乐队的强度与AlphaImager软件进行了分析。带强度与相应的规范化β肌动蛋白的信号,NALPs /关系β肌动蛋白,ASC /β肌动蛋白,caspase-1 /β肌动蛋白和白介素/β肌动蛋白进行了计算。分析的结果是克鲁斯卡尔-沃利斯和土耳其统计测试。

3所示。结果

3.1。分析眼部炎症的小鼠接受有限合伙人

组织学和分子分析来评估小鼠的眼部炎症治疗有限合伙人,因此白细胞渗透前房和促炎细胞因子表达的程度。在LPS-treated老鼠的眼睛,有白细胞渗透在前房(见图3 - 48小时的治疗1(一))和12小时均值的白细胞渗透是最高的(10细胞/字段; ;参见图1(b))。



图1
组织学和分子分析LPS-induced眼部炎症。摘要:母鸡小鼠接种在拦路贼200 g / 50 L有限合伙人和分析了炎症的3、6、12、24、48小时。控制老鼠(C)收到了拦路贼注入50 L无菌PBS。(一)白细胞浸润的组织学分析前房沾hematoxylin-eosin (40 x)。箭头点渗透细胞。图显示了一个代表五个老鼠在每次学习的结果。(b)的平均渗透白细胞中观察到(a)。(c) il - 6和TNF的平均半定量的分析α信使rna表达。星号显示显著差异与控制( )分析了克鲁斯卡尔-沃利斯和土耳其测试。摘要意思(d)的表达式β蛋白质在处理和未经处理的小鼠。Immunostaing il - 1的β未经处理的小鼠(I)和治疗小鼠在12小时后处理(II和III)。(e)睾丸组织作为积极控制摘要意思β的表情;无关紧要的抗体(我),il - 1β抗体(II)。蓝染色意味着积极的信号。

确认眼部炎症治疗老鼠的眼睛,促炎细胞因子il - 6和TNF的mRNA的表达α是确定。白介素mRNA高度表达LPS-treated老鼠和半定量的分析显示显著增加il - 6的3、6、12小时后处理(见图1(c))。在治疗的老鼠,TNF的表达最高α信使rna(参见图观察到12小时1(c))。在这个时候,也观察到白细胞渗透在生产和分泌il - 1β(见图1(d))。这些结果表明LPS诱导的眼部炎症。

3.2。表达分析NALP1b和NALP3老鼠LPS处理

分析inflammasome复杂的类型出现在治疗的老鼠的眼睛,表情NALP1b NALP3决心。NALP1b mRNA不存在,无论是在接受过治疗的老鼠的眼睛,还是在控制(见图2)。相比之下,NALP3表达式中检测出的眼睛治疗小鼠,观察和最高表达在12小时后治疗( ;参见图2)。这些结果说明有微分表达式NALP1b和NALP3 LPS-induced眼部炎症。


图2
半定量的分析NALP3和NALP 1 b mRNA表达LPS-treated老鼠的眼睛。老鼠接受有限合伙人在3、6、12、24、48小时。rt - pcr NALP3和NALP1b mRNA表达测定。平均每只5老鼠分析化验报告时间。星号显示显著差异与控制( )分析了克鲁斯卡尔-沃利斯和土耳其测试。

在其他研究器官,NALP3信使rna中检测出心(3小时后处理)和肺(从6小时后处理)但在睾丸,大脑,脾(见图3)。尽管最高NALP3表达发生在12小时后治疗眼睛,NALP3早些时候出现心脏和肺(3和6小时,职责)。


图3
半定量的分析NALP3 mRNA表达的眼睛,心脏,肺,睾丸,大脑,LPS-treated小鼠的脾脏。NALP3 mRNA表达决心通过rt - pcr在老鼠的器官LPS处理3、6、12、24、48小时。平均每只5老鼠分析化验报告时间。星号显示显著差异与控制( )分析了克鲁斯卡尔-沃利斯和土耳其测试。
3.3。表达分析ASC, Caspase-1, il - 1β,地震LPS-Treated老鼠的眼睛

作为NALP3表达发生在眼睛,和增加其被LPS诱导表达,表达的其他inflammasome组件(ASC caspase-1, il - 1β和地震)在这个器官是确定。ASC mRNA表达在参与观察和治疗老鼠但是最高的表达被发现在12小时后处理(见图4)。caspase-1的表达逐渐增加至3小时,并在12小时显示最高表达式(见图4)。il - 1的表达β从3小时调节治疗后,其最高表达发生在12小时后处理与蛋白质发生(参见图吗4和1(d))。类似的结果观察地震-表达式(见图4)。


图4
表达分析NALP3-inflammasome组件LPS-treated老鼠的眼睛。半定量rt - pcr进行分析NALP3, ASC, caspase-1, il - 1β,地震-表达式LPS-treated老鼠的眼睛。平均每只5老鼠分析化验报告时间。星号显示显著差异与控制( )分析了克鲁斯卡尔-沃利斯和土耳其测试。
3.4。表达NALP12(君主1)和NALP5的眼睛LPS-Treated老鼠

NALP12(君主1)是一个分子可以负调控inflammasome复杂,这个分子参与LPS-induced眼部炎症了。略有感应的表达NALP12由于LPS-treatment观察到12和24小时,但没有统计相关性( ;参见图5(一个))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
半定量的分析NALP12和NALP5 mRNA表达的眼睛LPS-treated老鼠。NALP12(面板(a))和NALP5(面板(b)) mRNA表达rt - pcr测定。老鼠接受有限合伙人在3、6、12、24、48小时。平均每只5老鼠分析化验报告时间。克鲁斯卡尔-沃利斯的分析测试显示没有统计学意义。

评估如果有限合伙人的待遇还可以修改的表达没有参与的其他NALPs inflammasome复杂,比如NALP5,这个分子的表达程度。未经处理的小鼠的眼睛没有表达NALP5,和LPS诱导轻微的表达在12小时后治疗,但又没有统计相关性( ;参见图5 (b))。

4所示。讨论

在这项工作中,我们观察到,LPS诱导的mRNA表达il - 1β、il - 6、TNF -α,地震以及il - 1的分泌β的白细胞浸润眼的前房,确认一个眼部炎症过程。因此,我们搜查了如果NALP3的表达,NALP1b, ASC, caspase-1与il - 1的表达β和地震LPS-induced眼部炎症模型。

NALP3 multiprotein复杂形式称为“inflammasome”,其中包含ASC和caspase-1,这复杂的激活,从而促进caspase-1 pro-IL-1的处理β在巨噬细胞和地震文化(2]。我们发现NALP3 mRNA表达增加与有限合伙人的眼睛治疗的小鼠12小时。的表达NALP1b被发现在治疗和控制老鼠,这表明NALP3-inflammosome复杂,但不是NALP1b-inflammosome复杂,可能与LPS-induced眼部炎症。NALP3表达式主要记录在单核细胞,粒细胞,软骨细胞(8]。小鼠NALP3 mRNA表达最初被发现在外周血白细胞,与炎症函数的要求一致。NALP3中还发现健康老鼠的眼睛和皮肤9]。然而,这是第一个报告显示增加LPS-induced NALP3表达式的眼部炎症。重要的是要强调NALP3的过度表达与白细胞渗透产生il - 1被发现的时间β。体外研究表明主要人类单核细胞与LTA刺激,有限合伙人或聚(我:C)引起一个健壮的感应NALP3表达式(10]。与我们的结果,我们表明,有限合伙人可以诱导体内的表达NALP3的眼睛。

这也是第一个报告表明LPS诱导的表达NALP3在心脏和肺部但不是在脾脏,不过据报道,NALP3不是表达的淋巴组织和皮肤健康老鼠的11但是,NALP1。楚等等。报道,NALP1 mRNA表达健康的器官,如心脏、胸腺、脾、肾、肝、肺、外周血淋巴细胞(12];我们报告,NALP1不是表达的眼睛健康的老鼠,但即使治疗后与有限合伙人仍缺席。

我们发现NALP3的眼睛被延迟的表达尊重的心和肺的。,我们建议hemato-ocular屏障,延缓眼部组织的有限合伙人的到来干涉NALP3诱导时。心脏和肺的早期表达NALP3可能导致感染性休克的效果有限合伙人。

NALP3-deficient老鼠已经生成调查pathogen-derived分子NALP3在炎症反应中的作用。NALP3-deficient巨噬细胞il - 1不产生活跃β有限合伙人,Pam3 CSK4 (TLR2受体激动剂),金黄色葡萄球菌,单核细胞增多性李斯特氏菌(13),细菌RNA, imidazoquinoline化合物R837和R848 (TLR7和TLR8受体激动剂)(14]。然而,NALP3-deficient巨噬细胞,但不是IPAF-deficient巨噬细胞,能产生il - 1β当刺激沙门氏菌。另一方面,ASC-deficient巨噬细胞不产生il - 1β与任何toll样受体激动剂和引用的细菌。这些结果表明,适配器ASC是主体分子NALP——和IPAF-inflammasome复合物(4,15]。ASC大量表达在上皮细胞、白细胞、毛囊,外周血淋巴细胞(16),位于严重中性粒细胞炎症网站(17]。的眼睛,我们发现ASC表示,有限合伙人可以增加其表达。

Caspase-1 inflammasome复杂的是另一个组件用于il - 1的激活β。Caspase-1-deficient老鼠携带缺陷生产成熟的il - 1β与LPS刺激后。此外,这些小鼠抗内毒素休克(18]。细菌RNA还可以诱导激活caspase-1槽NALP3 [14]。我们发现caspase-1增加眼睛的老鼠接受有限合伙人同时当NALP3, ASC, il - 1β,地震显示的最高表达(12小时)。这些结果表明,高表达NALP3, caspase-1, ASC, il - 1β,地震可以参与小鼠LPS-induced眼部炎症。

在这个报告中,我们还分析了NALP12表达LPS-induced眼部炎症。虽然略有增加的表达NALP12眼中的老鼠被发现治疗,统计不相关。这表明这个分子不参与监管LPS-induced眼部炎症的发生与肿瘤坏死因子单核细胞和粒细胞刺激α和其他通常配体(6]。

NALP5尚未参与inflammasome复杂,但它与生殖有关,因为它已经被发现在卵母细胞(19,20.]。到目前为止,还没有报道的表达NALP5的眼睛。虽然我们没有发现NALP5表示控制老鼠的眼睛,我们发现几乎测不出它在一些治疗老鼠的眼睛。

总之,这些结果表明LPS诱导显著表达NALP3-inflammasomme复杂endotoxin-induced眼部炎症。

确认

这项工作是由CONACYT格兰特(47424)。f . Gonzales-Benitez和m . a . Juarez-Verdayes收到CONACYT博士奖学金和PIFI-IPN CQB研究生学习。美国Rodriguez-Martinez收到CONACYT授予博士后。m . e . Cancino-Diaz和j . c . Cancino-Diaz COFAA-IPN同伴,EDI-IPN, SNI-CONACYT。