文摘

高机动组盒1 (HMGB-1)是一种dna结合蛋白分泌激活单核细胞,已被确定为一个关键中介内毒素休克。我们调查的规定HMGB-1人类外周血单核细胞(PBMCs)与葡萄球菌超级抗原刺激后,中毒性休克综合征toxin-1 (TSST-1),并发现TSST-1,像LPS诱导的分泌HMGB-1从人类PBMC。但是,与monocyte-driven内毒素造成的败血症,易位和分泌HMGB-1由TSST-1依赖于激活T细胞和单核细胞的存在。此外,我们表明,核HMGB-1释放TSST-1刺激T细胞。这一发现提出了一种依据调查针对的潜在HMGB-1治疗中毒性休克综合征,并进一步了解的角色之间的相声HMGB-1激活单核细胞和T细胞。

1。介绍

高机动组盒1 (HMGB-1)蛋白质是30 kDa非组蛋白的核DNA结合蛋白,显示有一个在炎症细胞外的作用,细胞分化,依从性和能动性1- - - - - -3]。细胞外HMGB-1最初被确定为amphoterin, heparin-binding促进神经突蛋白产物在围产期老鼠大脑4]。HMGB-1现在被视为被动的内源性危险信号发布的坏死细胞或由刺激细胞主动分泌(5]。王等人发现这个关键的蛋白质是一个中介内毒素休克晚期(6,7]。激活巨噬细胞和单核细胞分泌炎性分子的过程需要蛋白质的乙酰化作用,允许其从核易位分泌溶酶体(8]。与肿瘤坏死因子α和干扰素γ出现第一个4 - 6小时内post-LPS治疗小鼠,HMGB-1血清水平升高之间16和32小时后有限合伙人管理。此外,中和抗体针对HMGB-1救老鼠从致命的内毒素即使接种24小时后脓毒症开始(7,9]。由于这些原因,HMGB-1被视为一个有吸引力的治疗各种炎症性疾病包括内毒素休克的目标(10]。

中毒性休克综合征toxin-1 (TSST-1)是一个超级抗原(凹陷)的一些菌株分泌金黄色葡萄球菌,这凹陷随后被确认为中毒性休克综合征的主要病原体(11]。相比LPS-induced脓毒症,这主要是由刺激单核细胞,凹陷的需要引起的中毒性休克综合征V的交联β特殊的区域αβT细胞受体(TCR)二类主要组织相容性复合体(MHC II)分子抗原呈递细胞(apc) [12]。除了大量的T细胞增殖,这三分子相互作用导致不可控释放各种促炎细胞因子(13),这是关键的TSS的发病机制。在目前的研究中,我们试图确定HMGB-1也起着核心作用TSST-1-induced hyperinflammatory反应。我们发现TSST-1介导细胞内HMGB-1的易位和随后的分泌人类PBMC休息。与先前的研究发现,单核细胞,但不是T细胞,释放HMGB-1刺激与有限合伙人或TNFα(6,7,14),我们发现损失和随后的分泌细胞内引起HMGB-1 TSST-1依赖于T细胞和单核细胞的合作互动,和两个细胞动员HMGB-1 TSST-1治疗。

2。材料和方法

2.1。毒素净化

重组TSST-1从文化上层清液的净化金黄色葡萄球菌应变RN4220之前改变了的结核菌素基因,利用制备等电点聚焦和chromatofocusing [15]。毒素纯度被银染色后评估钠十二烷基sulfate-polyacrylamide在14%的丙烯酰胺凝胶,凝胶电泳和有限合伙人活动是探测不到的鲎变形细胞溶解产物凝胶(灵敏度极限,10个pg / mL)。

2.2。制备的细胞和文化条件

从健康的捐赠者得到新鲜的人类PBMCs Ficoll-Paque +(美国新泽西州Amersham生物科学公司,皮斯卡塔韦)密度离心,和96年培养U-bottom板块 1 。 5 × 1 0 6 细胞/毫升完全培养基组成的RPMI 1640(干细胞技术有限公司,公元前的温哥华,加拿大),heat-inactivated 10%胎牛血清(美国犹他州洛根HyClone实验室Inc .), 2毫米谷酰胺(干细胞),25毫米消息灵通的缓冲区(干细胞),和2 ug /毫升的硫酸多粘菌素B (Sigma-Aldrich Corp .,圣路易斯,密苏里州,美国)。分析细胞培养上清液的分泌HMGB-1 PBMCs镀在24-well的平底盘子Opti-MEM我降低血清培养基(Gibco)。THP-1细胞(人类单核细胞的细胞株)从写明ATCC获得和保存在推荐增长媒体在使用之前,在这段时间里,这些细胞被镀的浓度 1 。 5 × 1 0 6 细胞在Opti-Mem我介质。人类PBMC的T细胞耗竭了使用无列磁珠法分离(从干细胞技术EasyCep) T细胞的积极的选择使用一个anti-CD3共轭抗体根据制造商的指示。这个过程中单核细胞负选择和没有动过进一步的实验调查的目的。

2.3。治疗PBMC TSST-1或有限合伙人

纯化PBMCs镀在24-well或96孔文化板块隔夜37岁°C在5%股份有限公司2之前刺激与1 nM TSST-1或500 ng / mL有限合伙人(σ),指出。文化上层清液收集在24小时post-TSST-1治疗,微型离心机在800 xg 5分钟,冻结在-70年°C直到蛋白分析。

2.4。通过荧光显微镜检测HMGB-1

PBMCs首次surface-stained与鼠标反人类的表达CD3 CD3免疫球蛋白(Pharmingen BD生物科学,米西索加、加拿大)其次是antimouse免疫球蛋白抗体共轭Alexa594(分子探针);随后细胞被固定使用Cytofix缓冲区(Pharmingen)。HMGB-1的细胞内检测、细胞与Cytoperm permeabilized (Pharmingen)和孵化30分钟(4°C)和兔多克隆抗体anti-HMGB-1 (Orbigen BioCarta,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)稀释在阻止缓冲区(磷酸缓冲盐,3%的边后卫),后跟一个二级抗体Alexa488-conjugated山羊antirabbit免疫球蛋白。anti-HMGB-1抗体是针对氨基酸肽序列对应于166 - 181年以前是专门针对HMGB-1而不是HMGB-2 [16]。建立了表面表达HMGB-1 PBMC培养细胞(37°C, 5%股份有限公司2)直接在盖玻片前一夜之间允许附件贴壁细胞刺激TSST-1 1海里。细胞被固定和surface-stained如上(但不透化作用的步骤)。使PBMCs随后被沾染了赫斯特3342年核染料(分子探针),并安装在幻灯片使用延长不变色试剂(分子探针)。细胞被可视化的AxioPlan II荧光显微镜配备CCD相机使用Eclipse北部软件(Epix(他们刚刚与)收购图像。图片拍摄与63 x油浸物镜,和Adobe Photoshop 6.0软件被用于图像布局。

2.5。流仪分析Surface-Expressed HMGB-1分化细胞

分析了Surface-expressed HMGB-1流式细胞术(FACSCalibur流式细胞仪系统,BD生物科学Pharmingen)使用上述anti-HMGB-1抗体和二级Alexa488-conjugated抗体结合藻红蛋白(PE)共轭anti-CD3 anti-CD14抗体(BD生物科学Pharmingen),用最少的000事件为每个样本收集。

2.6。免疫印迹分析HMGB-1分泌

PBMC或THP-1文化上层清液集中10倍使用Amicon超离心过滤器从原始体积的分子量截止10 kDa(微孔)。一些文化上层清液进一步准备使用sds - page清理工具(Amersham)根据制造商的指示之前运行在12%的聚丙烯酰胺凝胶。西方墨点法是由半干转移蛋白(Trans-Blot SD半干电泳转移细胞,BioRad)到Immobilon-P PVDF膜(微孔),阻止了1小时在室温下以1% BSA,三羟甲基氨基甲烷缓冲液渐变0.5%生理盐水(TBS)前一夜孵化(4°与兔多克隆抗体anti-HMGB-1 C)。膜随后孵化与antirabbit免疫球蛋白horse-radish-peroxidase合共轭二次抗体1小时在室温下瓶。执行检测HMGB-1使用超级信号衬底(皮尔斯)和开发以及分析使用Alpha Innotech 3400凝胶文档系统(美国加州αInnotech)。

2.7。统计分析

使用Prism 3.0执行统计分析软件包(GraphPad)。治疗后的比例PBMCs表达HMGB-1 TSST-1或RPMI不同捐赠者被配对的学生相比t以及。如果认为重要差异P< . 05。

3所示。结果与讨论

3.1。分泌细胞表面表达HMGB-1分化和贴壁细胞24小时Post-TSST-1刺激

一些分化以及附着在细胞表面上细胞表达HMGB-1,这个细胞的膜相关HMGB-1被称为amphoterin区别于细胞内HMGB-1 [17]。前面描述的细胞外amphoterin表达一直良好,使用各种方法包括亚细胞分离已被调查,immunogold电镜,信使rna本地化研究[18]。我们检查了表面的表达HMGB-1 (amphoterin)在人类PBMC培养后细胞在48小时内96 - U-bottom板块在完整的生长介质。这个孵化时间后,我们发现了一个人口分化细胞表达高水平的HMGB-1没有任何进一步的治疗外源性兴奋剂(图1(a))。因为他们是悬浮细胞,新鲜纯化PBMCs不表达amphoterin(即。细胞表面表达HMGB-1)。表达cell-surface-associated HMGB-1发生在48小时时间PBMCs培养,和单核细胞谱系的细胞已经成为附着。T细胞,被costaining anti-CD3和Alexa594-conjugated antimouse免疫球蛋白(红色),没有表达amphoterin因为他们保持悬浮,和表面的表达HMGB-1似乎贴壁细胞的性质;然而,所有细胞表达细胞内HMGB-1(如图2)。我们的观察证实了与Rouhiainen et al。18),报告amphoterin的积累在细胞的细胞外空间轴承过程中扩展,和HMGB-1表面表达抑制细胞中没有这些流程。TSST-1刺激后,有重大损失amphoterin从细胞表面的人口培养贴壁细胞表面表达HMGB-1,所观察到的荧光显微镜(数字1(一)和1由流仪(b)),量化分析(图1(c))。流式细胞术还证实,高级的表面表达amphoterin仅限于PBMC的分组人口高向前散射对应于单核细胞/巨噬细胞人口(估计在3%和12%之间休息PBMC在捐助者测试)。超过一半的这些amphoterin-expressing细胞释放HMGB-1在TSST-1刺激( 7 。 3 ± 3 。 6 9 刺激与之前% 3 。 3 ± 1 。 3 2 % TSST-1治疗后;P< . 05,成对的学生的t -从4种不同的捐赠者测试)。流仪分析,据我们所知,尚未利用量化HMGB-1的表面表达之前,我们发现它是一个有用的工具来评估细胞外HMGB-1表达的变化。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图1
分泌细胞外环境的膜相关HMGB-1 TSST-1后治疗。在附着PBMC细胞外表达HMGB-1完成生长培养基(a)或TSST-1治疗后。(b) Anti-HMGB-1:绿色荧光(Alexa488);核:蓝色(赫斯特3342年核染料);anti-CD3:红色(Alexa594)。特写视图从代表字段描述在左边的面板。(c)流式细胞术分析surface-expressed HMGB-1在PBMC TSST-1刺激后24小时。左面板,休息或PBMC治疗;正确的小组,24小时后TSST-1刺激。表面HMGB-1 TSST-1刺激后表达明显降低(12.0%比4.3%捐赠所示; 刺激与之前% % post-TSST-1治疗从4个不同的捐赠者; ,成对的学生的t以及)。
(一)PBMC
(一)PBMC
(b) TSST-1刺激PBMC
(b) TSST-1刺激PBMC
(c) T细胞
(c) T细胞
(d) TSST-1刺激T细胞
(d) TSST-1刺激T细胞
(e)
(e)
图2
核易位HMGB-1 TSST-1刺激后人类PBMC。人类PBMCs服用1 nM TSST-1或10小时RPMI媒介,与细胞内的表达HMGB-1被共焦荧光显微镜检测。特写视图从代表字段描述正确的面板。(一)休息(RPMI) PBMC细胞内HMGB-1(绿色)被认为是本地化主要在细胞核(蓝色)。(b)在10小时后刺激1 nM TSST-1 HMGB-1被认为可能促使到细胞外空间。(c)荧光显微镜图像的T细胞,休息和(d) TSST-1刺激T细胞的过程中积极地把细胞内HMGB-1毒素治疗后10小时。与反人类的T细胞被染色检测CD3抗体共轭Alexa594(红色)。(e)的免疫印迹检测HMGB-1人类PBMC的文化上层清液治疗后24小时1 nM TSST-1或RPMI媒介。
3.2。易位和分泌细胞内HMGB-1从人类PBMCs 10小时Post-TSST-1刺激

调查潜在的变化在细胞内表达HMGB-1 TSST-1曝光,人类PBMCs 1 nM TSST-1治疗,疗程10小时,然后随后评估细胞内HMGB-1易位的荧光显微镜(图2)。先前报道(19),HMGB-1休息PBMC预计将本地化主要在细胞核(图2(a))。然而,治疗后10小时1 nM TSST-1,相当一部分PBMCs降低了细胞内存储的HMGB-1(图2(b))。之前的研究使用有限合伙人或炎性细胞因子干扰素γ或肿瘤坏死因子α(6,7]兴奋剂发现只有巨噬细胞,但不是T细胞,核HMGB-1转移并随后分泌。然而,我们发现,T淋巴细胞在人类PBMCs也经历了一个变化在细胞内表达HMGB-1 TSST-1治疗(数字1(c)和1(d))。

验证HMGB-1积极分泌从TSST-1 PBMCs治疗,我们进行了免疫印迹分析细胞培养上清液收集24小时post-TSST-1治疗(图2(e))。

3.3。要求激活T细胞在TSST-1-Induced核易位和人类PBMC HMGB-1分泌

未分化和不依从单核细胞悬浮不表达cell-surface-associated HMGB-1。然而,在第一步分化,单核细胞主动运输这个分子细胞表面,并HMGB-1随后被分泌到细胞外环境在进一步刺激(17]。进一步调查的要求核易位和T细胞的分泌HMGB-1 TSST-1刺激后,我们对待人类单核细胞的细胞系,THP-1,与TSST-1(1纳米)有限合伙人(500 ng / mL),或让他们未经处理的RPMI媒介。THP-1细胞表达水平基底MHC II级所需TSST-1所需的激活和CD14 LPS-induced激活(20.]。如图3TSST-1治疗未能诱导未分化THP-1细胞表面表达HMGB-1,相比之下与LPS刺激。我们证实了这一观察的主要细胞使用人类PBMCs明显耗尽他们的T细胞池是刺激与TSST-1或有限合伙人(图3(a))。免疫印迹分析也证实THP-1细胞和T cell-depleted PBMC分泌检测大量HMGB-1 LPS刺激后,但不是TSST-1治疗(图3(b))。总的来说,这些结果证实了我们之前的研究成果,建立了单核细胞和T细胞所需的分泌TNFα和il - 1β从人类PBMC刺激与高纯度TSST-1 [13]。

(一)
(一)
(b)
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图3
TSST-stimulation后要求HMGB-1 T细胞的分泌。(一)THP-1细胞或T cell-depleted人类PBMCs刺激与TSST-1(1纳米)有限合伙人(500 ng / mL),或RPMI中24小时,表面的表达HMGB-1被荧光显微镜检查。(b)的分泌HMGB-1 THP-1上层清液的细胞(左面板)或T cell-depleted PBMC面板(右)与有限合伙人治疗后24小时,TSST-1或RPMI介质控制被免疫印迹检测。rHMGB-1 (15 ng)作为一个积极的控制。

4所示。结论

各种细胞类型最近被认定为导致细胞外HMGB-1池,包括人类脐静脉内皮细胞(21),血小板(18)、垂体细胞和巨噬细胞(3]。我们发现HMGB-1 TSST-1后T细胞分泌的刺激可能平行观测由Semino et al。22)发现,不同的NK细胞分泌HMGB-1子集,用来区分自体树突细胞,和这个事件受到环境刺激调制。HMGB-1显示诱导单核细胞分化成树突细胞,特别是极化T细胞给Th1反应(19),一个功能特征对人类PBMC TSST-1刺激的影响。我们之前证明人类的细胞因子分泌和costimulatory分子表达PBMC TSST-1刺激后遵循双峰模式(23),与第一阶段达到poststimulation ~ 3小时,和第二个破裂poststimulation ~ 24小时。HMGB-1的分泌到细胞外环境在这之后的时间点,这将是值得确定第二个炎症破裂,upregulation costimulatory分子,如CD86、CD40,以及HLA-DR(达到48小时)(23),在直接回应的分泌HMGB-1末被认为是中介的脓毒症(24]。

最好的学了细胞外配体HMGB-1是愤怒(晚期糖化终产物中的受体),这是调节激活巨噬细胞以及内皮细胞(25]。先前的研究旨在确定superantigen-activated T细胞坚持血管内皮细胞和诱导血管损伤26]。也表明rHMGB-1引起促炎反应内皮细胞(25]。因此,它将是进一步研究的角色感兴趣的HMGB-1和愤怒在炎症反应和血管内皮损伤由TSST-1。预计TSST-1-induced炎症模型,这需要V的桥接β2-specific T细胞和MHC II级分子抗原呈递细胞,将提供一个有用的方法来研究在T cell-monocyte HMGB-1交互的角色,Th1极化和随后的免疫反应导致组织损伤。最后,本研究还提供了一个理论基础探讨潜在目标HMGB-1 TSST-1引起的炎症性疾病的治疗,如中毒性休克综合征,是当前正在研究的革兰氏阴性脓毒症(9]。应该注意的是,不同的葡萄球菌外毒素的炎症反应变化(27),它将感兴趣的临床研究的作用和调节HMGB-1上下文中的其他超级抗原及其潜在superantigen-mediated疾病的主要目标。

确认

这项研究的部分资金支持从加拿大卫生研究院研究到a . w . Chow (mt - 7630)和迈克尔·史密斯医疗研究基金会美国Kalyan (MSFHR博士奖学金)。