文摘

客观的。澄清时间是否会出现发烧的脓毒症的迹象可能表明单核细胞释放的力量支持和抗炎介质。方法。单核细胞分离得到51败血症的患者和9健康献血者的血液。单核细胞是未孵化和患者的血清和肿瘤坏死因子-α(TNF浓度)、白介素(IL) 6、IL - 10,丙二醛(MDA)在上层的估计。患者分为三组:A组:12小时;B组:12 - 24小时,C组:24小时之间开始出现发烧和血液采样。结果。肿瘤坏死因子B和C组高于上层清液的控制,也il - 6 A和C, A和B, il - 10和MDA的il - 6组后增加的病人血清。之间的负相关性被发现时间从起始症状和il - 6的单核细胞上清液中孵化患者血清的存在。中值高于nonsurvivors il - 6的幸存者。结论。单核细胞是强有力的支持和抗炎介质的释放在第一个24小时后出现发烧与脓毒症;血清刺激进一步释放il - 6在第一12个小时。

1。介绍

尽管知识的提高脓毒症的发病机制,其死亡率仍居高不下使脓毒症第九死因在北欧和美国1]。脓毒性综合征的发病率的上升主要集中关注各种策略的管理。在这些策略中,免疫疗法已经进化。这些由抗体针对肿瘤坏死因子-α(TNF)和木糖醇,可溶性受体等离子体血液透析,一氧化氮合酶抑制剂和激活蛋白c,而他们中的大多数在二期临床试验成功的使用时,他们要么失败或证明问题当应用于III期临床试验(2,3]。提出了各种假设来解释失败的免疫疗法。最重要的似乎是脓毒症的发病机制的缺乏深入了解4]。目前发病机制的理论是基于生产促炎和抗炎细胞因子刺激后血液单核细胞的细菌产品和免疫疗法往往是针对这些介质。然而,在所有的临床试验,治疗管理在满足特定条件的报名没有完全了解宿主的免疫状态的时间开始的任何临床实验的产品4]。

免疫疗法在时间管理的重要性,强调了促炎介质达到峰值时实验研究[5]。实现在临床领域,它是强制性的能够相关症状的存在与免疫系统的功能。单核细胞的败血症的患者往往是无效的,也就是说,他们生产数量有限的促炎介质由细菌刺激产品(6]。然而,没有数据可用如果脓患者单核细胞能够产生促炎和抗炎介质转移到体外。本研究试图提供此类信息和单核细胞的体外释放介质与起始的时间会发热脓毒症的迹象。

2。患者和方法

2.1。病人的特点

招生发生在此期间9 2003年第四届内科位于“Sismanoglion”雅典综合医院。协议是Sismanoglion综合医院的伦理委员会批准;书面知情同意被病人或一级亲属。所有连续招生研究急诊科是合格的。

入选标准是(a)的存在热定义为体温超过38^°C作为第一个潜在的感染的症状,(b)存在的潜在的感染:下呼吸道感染,intrabdominal感染或急性肾盂肾炎,和(C)败血症,严重脓毒症或脓毒性休克。排除标准:艾滋病毒感染(a)、(b)嗜中性白血球减少症定义为1000中性粒细胞/更少L, (c)摄入的糖皮质激素剂量大于或等于1毫克/公斤相当于强的松超过一个月。

下呼吸道感染定义为以下所有的存在(7]:(a)核心温度> 38^°C, (b)增加新的或咳嗽,(C)新的或增加脓性痰生产;和(d)新的渗透胸部x光片。

Intrabdominal感染定义为以下所有的存在(8]:(a)核心温度> 38^°C (b)的痛苦深触诊(C)放射性发现兼容腹腔感染,白细胞和(d) > 12000 /L或< 4000 /L或> 10%的乐队形式。

急性肾盂肾炎被定义为以下所有的存在(9]:(a)核心温度> 38^°C, (b)腰椎压痛或放射性的发现符合急性肾盂肾炎,和(C)超过10白细胞公积金离心机的尿液。

脓毒症定义为感染的存在伴随着至少两个以下的10]:(a)体温超过38^°C, (b)呼吸速率高于20次/分钟< 32嗯,(c)心率90次/分钟以上,和(d)白细胞> 12000 < 4000 /L或者乐队10%以上。

严重脓毒症急性功能障碍定义为脓毒症复杂的至少一个器官由于潜在的感染,也就是说,急性的至少一个以下的10]:

(我)急性呼吸窘迫综合征(ARDS):阿宝₂/ FiO₂低于200与扩散双边在肺部x射线阴影;(2)急性肾功能衰竭:尿液生产小于0.5毫升/公斤体重/ h提供至少两个小时-液平衡病人的恢复;(3)代谢性酸中毒:pH值< 7.30或任何基础赤字大于5毫克当量/ L和血清乳酸至少超过2 x正常价值;(iv)急性凝血障碍:血小板计数< 100.000 /L或者INR > 1.5。

脓毒性休克被定义为脓毒症复杂与收缩压低于90 mmHg超过一个小时,要求政府提供的升压,病人的负面流体平衡校正(10]。

25毫升的全血从每个病人样本外周静脉穿刺后在无菌条件下启动之前任何抗菌疗法;20毫升收集到一个heparin-coated和无菌管(,正欲Coskeysville,医学博士,美国),其余为无菌管。后者是离心机,血清是保持在-70人^°C直到化验。

为每个病人以下记录:年龄、性别、发烧和血液开始之间的时间间隔采样、以及APACHEⅱ评分结果。确切的时间提供的演示发烧的病人的历史。Nonreliable患者不被认为是合格的。

2.2。实验室技术

隔离的外周血单核细胞(PBMCs),肝素化静脉血是分层聚蔗糖Hypaque (Biochrom,柏林,德国)和离心机。分离单核细胞被洗了三次PBS (pH值7.2)和resuspended RPMI 1640补充谷氨酰胺的2毫米(Biochrom)的100 U /毫升的青霉素G和0.1毫克/毫升的链霉素(美国小姐Sigma-Aldrich)。孵化后1小时37岁^°C在5%股份有限公司₂不依从细胞被移除,而附着单核细胞被洗了三次与汉克的解决方案。细胞被收获0.25%胰蛋白酶/ 0.02% EDTA (Biochrom)和计算后纽鲍尔板台盼蓝排斥。在单核细胞纯度超过95%的定义与anti-CD14孵化后单核细胞抗体在fluorocolour FITC (Immunotech,马赛,法国)和分析由史诗/ XL流式细胞分析仪(美国贝克曼库尔特公司、迈阿密、Fl)使用IgG-FITC-stained细胞作为消极的控制。

一半的细胞治疗与一个冰冷的细胞裂解缓冲(50 mM消息灵通的,0.1%的皮套裤,德勤5毫米,0.1毫米EDTA, pH值7.4)。离心10分钟后在10000 g 4^°C、活动caspase-3估计在胞质中提取的酶显色测定(BIOMOL研究实验室,普利茅斯,Pa,美国)。它是基于在37水解的速度^°C的基质释放对硝基苯胺加班,按顺序评估光度法在410海里。试验也在caspase-3抑制剂的存在。caspase-3的活性在细胞提取物被表示为pmol /分钟10⁴细胞。

剩下的一半的单核细胞分成两个井12-well板的体积为2.4毫升/与RPMI 1640补充谷氨酰胺的2毫米。他们在没有孵化或100年的存在血清L病人的血清,这样说代表好总量的4.1%。24小时后的孵化37^°C公司5%以下₂板是离心机和上层清液保持在-70人^°C直到化验。单核细胞分离出9个健康的捐赠者和孵化只有在缺乏血清应用控制。

的浓度、白介素6 (IL)和IL - 10在血清和估计上层清液的酶immunoabsorbent测定(Diaclone、巴黎、法国)。降低检测极限分析的1.5 pg / mL6.25 pg / mL, il - 6和12.5 pg / mL il - 10。他们的浓度在单核细胞上清液被表示为pg / 10⁴细胞。

脂质过氧化作用估计在血清MDA和上层清液的浓度,已经描述(11]。简单地说,一个0.1毫升整除的每个样本混合0.9毫升的20%三氯乙酸(默克公司)和离心机在12000 g和4^°C 10分钟。上层清液被除去,孵化2毫升的硫代巴比土酸为60分钟(默克公司)90年的0.2%^°c .离心后,10卷L上层清液的注入高效液相色谱系统(高效液相色谱法,安捷伦1100系列、Waldbronn、德国)洗脱的以下特征:Zorbax Eclipse XDB-C18 (4.6150毫米,5在37米)列^°C;流动相组成的50 mM K₃阿宝₄(pH值:6.8)和甲醇99%在60/40比例的缓冲区1毫升/分钟的流量;荧光检测信号的激发在515 nm和发射在535 nm)。MDA的保留时间为3.5分钟,估计通过创建一个标准曲线1,1,3,3-tetramethoxy-propane(默克公司)。所有的决定都是在重复执行。浓度被表示为摩尔/毫升的血清和摩尔/ 10⁴细胞上清液。

2.3。统计分析

结果表示为值和95%可信区间(CI)或四分位范围(差)。为了分析,患者分为三组根据起始发烧和血液采样之间的时间间隔:A组:< 12小时,B组:12到24小时,和C组,> 24小时从开始发烧。对比组由Mann-Whitney U与Bonferroni调整测试;比较了浓度之间血清的缺失和存在Wilcoxon的测试。时间间隔采样和细胞因子的浓度之间的相关性进行据枪兵的等级秩序。任何价值P低于0。被认为是重要的。

3所示。结果

在报名期间,54岁的病人都有资格。50一个最后入学,因为只有在他们发烧是第一个潜在的感染症状。这些患者的人口学特征如表所示1。痰培养没有披露任何病原体。

13个病人属于A组,B组16个病人,22名患者组c的浓度,il - 6、il - 10和MDA的血清与时间间隔表所示2。没有发现差异群体之间的时间间隔。

的浓度,il - 6、il - 10和MDA的单核细胞上清液没有存在的病人的血清与起始发烧的时间间隔采样与控制如图1。B和C组高于控制,il - 6组A和C高于控制,il - 10 A和B组高于控制,和MDA组高于对照组。

血清对中介发布的效果如图2。il - 6的上层清液单核细胞分离后增加患者组的病人的血清(P= .018)。这是MDA的B组(P= .049)和C (P= .048)。il - 6的上层清液单核细胞生长在病人的血清的存在是更高的A组相比,B组(P= .037)和C (P= .048)。

中位数(差)的活动caspase-3为53.5 (295.5)pmol /分钟10⁴细胞为A组,200 (2020)pmol /分钟10⁴细胞为B组,99.6 (1642)pmol /分钟10⁴C组细胞(pn组之间的时间)。

之间的负相关性被发现时间从起始症状和il - 6的单核细胞上清液孵化的病人的血清(,P= .041,图3)。没有发现其他显著相关。

中位数(差)il - 6的上层清液单核细胞的幸存者是41.9 (149.2)pg / 10⁴细胞相比,1.9 (67.8)pg / 10⁴nonsurvivors细胞(P= .048)。各自在血清的存在价值是51.6(96.0)和37.8 (30.0)pg / 10⁴(pn)。没有发现差异的浓度、il - 10和MDA的单核细胞上层的幸存者和nonsurvivors之间。

4所示。讨论

败血症的病人的免疫功能承认不能对突发事件的预测和特异性尽管现有血清标记物提供的信息。这是最重要的,因为数据来源于动物模型强调了需要知道哪个免疫反应发生在哪个时间,管理适当的类型的免疫疗法(5,12]。尽管存在各种研究提供深入了解动物感染性的一系列事件级联(4),为人类存在的种种弊端的情况。本研究试图关联效力感染性单核细胞的宿主体外释放pro -和抗炎介质在不同时间间隔的出现发热的情况下发热的最初症状是潜在感染性的过程。据我们所知,一个类似的尝试以前从未被描述。

结果显示,单核细胞的脓毒血症患者最有效的体外释放,il - 6、il - 10和MDA相比健康的捐赠者后第一个24小时内出现发热(图1)。这些发现表明单核细胞的感染性主机时仍然能够释放多种介质放入一个体外环境。单核细胞可能会在他们的感染性,生产环境。

由单核细胞释放介质的模式不是无处不在的MDA主要分泌早期以来,晚,il - 6早期和晚期的关系开始发烧。也许可以得出安全结论只对il - 6的两个主要原因:(一)单核细胞刺激病人的血清产生进一步释放il - 6只对单核细胞分离第一12个小时内出现发热(图2),(b)之间存在着负相关的时间会从开始发烧和serum-stimulated释放il - 6的单核细胞(图3)。

什么可能的潜在机制诱导患者血清il - 6的是未知的,只有假设可以做到的。血清细胞因子似乎并不负责,因为他们的水平并不在不同血清样本在不同时间间隔的出现发热(表2)。此外,caspase-3活动单核细胞相似的相关性来时间重新出现发烧,所以它可能不是假设内生惯性的单核细胞是罪魁祸首。无论可能是潜在的机制、临床意义的观察是前12小时内发热、脓毒性主机的单核细胞是嵌入在一个环境促进释放il - 6(图2)。这个环境似乎是腐败的结果病人的主要决定因素。尽管登记病人的死亡率低,体外释放il - 6中幸存者nonsurvivors相比。区别不复存在在刺激显示血清的存在引起nonsurvivors的重要从单核细胞释放il - 6。这一发现就变得特别重要的考虑动物研究的数据。在实验小鼠腹膜炎,促使政府imipenem可以显著减少死亡率与动物的唯一例外非常高的血清il - 6的浓度(13]。

本研究的结果一般协议中描述与脓毒症的动物模型。早期脓毒症小鼠是伴随着高血清浓度促炎和抗炎细胞因子与低血清浓度发现脓毒症(年末14]。在相同的背景下,体外释放单核细胞、il - 6和il - 10的脓毒性是更大的第一个24小时内出现发烧。

总之,我们的数据显示,发烧可能构成症状预测感染性宿主的免疫功能。单核细胞是强有力的支持和抗炎介质的释放在第一个24小时后出现发烧;病人血清刺激进一步释放il - 6在第一12个小时。这些发现一般的协议与实验和临床结果,作为抗生素,应尽早在感染性主机(15,16),同样可能是必要的免疫调节治疗。