文摘

的内皮血管硬化的发展中扮演着重要角色,其炎症和增殖状态影响动脉粥样硬化的进展。本研究的目的是比较两个的影响β受体阻滞剂如nebivolol和阿替洛尔在基因表达在人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)之后一个氧化剂刺激。HUVECs孵化了nebivolol或阿替洛尔(10 micromol / L) 24小时和氧化应激诱导的氧化低密度脂蛋白(牛)。Ox-LDL调节粘附分子(ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3、E-selectin P-selectin);炎症蛋白质(il - 6和TNFalpha),血栓性状态(组织因素,PAI-1和uPA),高血压等endothelin-1 (ET-1)和金属蛋白酶等血管重建(MMP-2 MMP-9)和蛋白酶抑制剂(TIMP-1)。nebivolol HUVECs的接触,但不是阿替洛尔,这些基因调节降低氧化应激方面的蛋白质和RNA表达。已知的抗氧化性能的第三代β-受体阻滞药nebivolol似乎解释观察到的差异相比,看到阿替洛尔和支持特定的潜在保护作用的β-受体阻滞药在许多基因的表达参与了动脉粥样硬化的发生和发展。

1。介绍

Nebivolol,第三代β受体阻滞剂具有高选择性肾上腺素能受体(1)和释放的能力从内皮一氧化氮(NO)2],被证明能显著影响的活性氧(ROS)释放人类内皮细胞氧化应激(下3- - - - - -6]。看来这种效应产生,至少在某种程度上,内皮NADPH氧化酶的抑制(7),一个关键酶在eucariotic细胞内的活性氧的形成8),也由直接ROS清除效果的药物(3,4,6,9]。

心血管系统的氧化状态的细胞是依赖ROS和内源性抗氧化剂之间的平衡和最近的研究表明,增加活性氧的胞内信号和标志是他们的条件10,11]。细胞外的因素,如高胆固醇血症增加氧化低密度脂蛋白(ox-LDL),高血糖与增强先进的糖化最终产品的生产,高血压与高水平的血管紧张素ⅱ、内皮素、和细胞因子可以移动的平衡向prooxidant状态改变的细胞氧化还原形式和增强活性氧的形成(10,11]。氧化还原的变化形式的细胞诱导激活一系列的蛋白质和细胞内酶(表皮生长因子受体、c - src p38增殖蛋白激酶,Ras,一种蛋白激酶/蛋白激酶B)以及转录因子redox-sensitive (NF -κB, AP-1)和随之而来的基因的诱导内皮功能(粘附分子,凝血因子)和细胞外基质的变化,参与动脉粥样硬化疾病的形成和发展。

鉴于以前的观察nebivolol明显抑制活动ROS形成(3- - - - - -6),目前的工作的目的是评价药物的潜在影响redox-sensitive基因参与了动脉粥样硬化斑块的形成。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和实验设计

获得人类脐静脉内皮细胞(通过传代形成细胞的方法Jaffe et al。12),用于使用从通道2到4。这些细胞被种植在75厘米²,正欲培养瓶(猎鹰,林肯公园,新泽西,美国)满10毫升的m - 199 (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)含10%胎牛血清(Seromed,柏林,德国),2毫米谷氨酰胺(Seromed,柏林,德国),30岁克毫升⁻¹内皮细胞生长补充(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),100年克毫升⁻¹肝素(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),100 U mL⁻¹penicillin-streptomycin (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),100年克毫升⁻¹链霉素(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),和2.5克毫升⁻¹两性霉素(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。烧瓶在37孵化^°度,湿度100%,5%的有限公司₂。每2天中被刷新。在每个实验的开始,细胞被胰蛋白酶化收获,用0.05%胰蛋白酶(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和0.537毫米的乙二胺四乙酸(EDTA)在磷酸缓冲盐钙和镁(Seromed,柏林,德国)。胰蛋白酶被稀释灭活,细胞被清洗和统计。细胞被镀在40000个细胞的浓度多井板(9.6厘米²好吧⁻¹,正欲)(猎鹰,林肯公园,新泽西,美国),已经2天,然后用于孵化项目。

HUVECs收获,描述为乙酰化低密度脂蛋白绑定和VIII因子表达式,根据建立和先前描述的技术(13]。评估细胞生存,己糖胺酶,胞质稳定酶释放的细胞进行裂解时,根据测定的方法Landegren [14]。

Dl-nebivolol(柏林化学,Menarini集团,佛罗伦萨,意大利)和阿替洛尔(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)被溶解在乙醇,然后在最后的浓度稀释培养基M199。相同的稀释溶剂的制备和作为控制。自nebivolol以前显示浓度的方式减少,细胞内活性氧的增加,超氧化物和10点减少50%米(3),这个浓度选择整个研究和相同的曝光时间(24小时37岁^°使用C)。

2.2。低密度脂蛋白氧化隔离和

全血,静脉穿刺获得的健康志愿者(与知情同意)禁食12小时后,收集到真空采血管管(法国),正欲Meylan包含EDTA毫升(1毫克⁻¹),低密度脂蛋白和加工分离1天的连续浮选NaBr溶液中含有1毫克毫升⁻¹EDTA (15]。铜^{2 +}改性低密度脂蛋白(1.7毫克蛋白毫升⁻¹低密度脂蛋白)是由接触5M CuSO₄18小时37^°C, LDL氧化的程度是由硫代巴比土acid-reactive物质,如前所述[16]。蛋白质被皮尔斯BCA测量测定试剂(13]。在内皮细胞氧化应激诱导的ox-LDL 50浓度g蛋白毫升⁻¹正如之前报道的(16]。

2.3。Macroarray

评估了基因活化cDNA阵列技术(17在准备膜(SuperArray生物科学公司)与化学发光检测。

以下的表达基因已经被研究。

粘附分子
CDH5、ICAM1 ICAM2, ICAM3、ITGA5 ITGAV, ITGB1, ITGB3, OCLN (Occludin) PECAM1 (CD31),希利(E-selectin)、销售(L-selectin) SELPLG (P-selectin) VCAM1。

炎症的蛋白质
CCL2 (MCP-1) CCL5(咆哮),CCL20 (exodus-1) CSF2 (gm - csf), CSF3 (g - csf) CX3CL1, IFNB1, IL1B, IL3,白细胞介素6、IL7, IL8, IL11, IL14, IL15, TNF。

蛋白质与血栓形成或血栓性状态
ANXA5(膜联蛋白V) CPB2 (TAFI), F3(组织因子),平台(tPA) PLAU (u-PA) SERPINE1 (PAI-1)活性,TFPI2, THBD (thrombomodulin)、VWF。

金属蛋白酶
MMP1 (collagenase-1), MMP2(白明胶酶),MMP3 (stromelysin-1) MMP7 (matrilysin) MMP8(中性粒细胞胶原酶),MMP9。

蛋白酶抑制剂
TIMP1、TIMP2 TIMP3。

内皮素
EDN1 (ET-1) EDN2 (ET-2) EDN3 (ET-3) EDNRA (ETA)、EDNRB (ETB)。

2.5。蛋白质测量

蛋白质参与氧化应激相关基因已经被试验测量了在中固相包基于ELISA系统。量化的工具用于ICAM-1后,E-selectin, P-selectin,白细胞介素6、tnf, MMP-2, MMP-9, TIMP-1,和ET-1研发系统工具包(美国);ICAM-2和ICAM-3本德MedSystems工具包(维也纳,奥地利);组织因子、u-PA PAI-1美国Diagnostica工具包(Pfungstadt,德国)。

2.6。统计分析

结果表示为。统计分析是由方差分析之后,图基的测试因果分析。所有的数据进行了分析使用Macintosh的“SPSS 11”计划。

3所示。结果

在macroarray基因检查,只有ICAM-1、ICAM-2, ICAM-3, E-selectin, P ligand-selectin, il - 6、tnf,组织因素,PAI-1, uPA, TIMP-1, MMP-2, MMP-9,和ET-1调节HUVECs ox-LDL和接触的,因此,他们测量相关的蛋白质。粘附分子的表达研究(ICAM-1、ICAM-2 ICAM-3, E-selectin, P ligand-selectin)显著增加曝光后HUVECs ox-LDL既是RNA(图1)和蛋白质含量(表1)。Nebivolol,但不是阿替洛尔,能够显著减少增加对RNA(图1),对蛋白质(表1)ICAM-1,通过对RNA(图1),对蛋白质(表1)ICAM-2,通过对RNA(图1),由对蛋白质的ICAM-3,分别。同样,只有nebivolol显著降低selectins ox-LDL引起的表达和对RNA(图1),由和对蛋白质(表1),分别E-selectin P-selectin。

两个RNA(图的表达2(表)和蛋白质1)的分子参与炎症如il - 6和tnf被ox-LDL暴露显著增加。Nebivolol,但不是阿替洛尔,能够减少增加对RNA(图1),对蛋白质(表1)il - 6,通过对RNA(图1),由对蛋白质(表1tnf的),分别。

如图2和表1,蛋白质的表达参与血栓形成和血栓形成的过程如组织因子、PAI-1 uPA显著增加ox-LDL HUVECs暴露的。Nebivolol,但不是阿替洛尔,至少在一定程度上减少了这些值如下:组织因素RNA,对蛋白质,PAI-1和对蛋白质,uPARNA,对蛋白质。

过度金属蛋白酶(MMP-2和MMP-9)和蛋白酶抑制剂TIMP-1被ox-LDL HUVECs都显著诱导RNA(图3)和蛋白质含量(表1)。Nebivolol,但不是阿替洛尔,能够减少增加对RNA(图3),对蛋白质(表1)MMP-2,通过对RNA(图3),对蛋白质(表1MMP-9),对RNA(图3),由对蛋白质(表1)TIMP-1,分别。最后还ET-1的表达显著增加曝光后HUVECs ox-LDL既是RNA(图3(表)和蛋白质1)。Nebivolol,但不是阿替洛尔,能够减少增加对RNA(图3),由对蛋白质的ET-1(表1),分别。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们调查了nebivolol和阿替洛尔对基因表达的影响反应在培养HUVECs ox-LDL引起的氧化应激。Ox-LDL proatherogenic脂蛋白,已被确认为一种强有力的刺激血管ROS,建议调节血管细胞的基因表达(18通过一个特定的绑定到受体LOX-1 [16]。本研究的第一个结果是ox-LDL显著增加一些基因的表达在动脉粥样硬化斑块的形成和发展19]。依照最近的调查结果显示,我们的结果是ox-LDL移植和信息交互,炎症、生长、凋亡,止血基因在平滑肌细胞和巨噬细胞20.,21]。

在这项研究中,我们还发现nebivolol icam减少,P -和E-selectin信使rna,蛋白质水平表达HUVECs暴露于氧化应激,而阿替洛尔是无效的。我们的发现,即使在不同的实验条件,同意一个最近的研究表明nebivolol降低粘附分子基因表达在人类冠状动脉内皮细胞和血管平滑肌细胞(22]。粘附分子调节白细胞外渗的第一步,站在一开始的级联事件导致斑块形成19]。P - E-selectins,表示只有在激活内皮,已经证明发挥重要作用在早期和晚期动脉粥样硬化病变发展(23];没有P-selectin,事实上,已经发现推迟小鼠脂肪条纹的形成(24]。几项研究已经报道E-selectin等离子体水平的增加和ICAM-1患者高血压、糖尿病和高胆固醇血症(25- - - - - -28];此外在患者心血管风险,血浆浓度ICAM-1可以预测不良结果(27,28]。

本研究的另一个重要的结果是nebivolol的能力,但并不是阿替洛尔,显著减少氧化应激tnf、il - 6和HUVECs ET-1基因表达。这一发现与之前的研究一致表明nebivolol可以减少ET-1人类冠状动脉平滑肌和内皮细胞分泌30.]。炎症中扮演着重要角色在调解阶段的动脉粥样硬化是一个慢性炎性疾病(19]。促炎细胞因子tnf和il - 6都可以诱导内皮细胞的结构以及功能改变。这些细胞因子刺激内皮素和活性氧的生产,减少acetylcholine-induced血管舒张,负面影响内皮一氧化氮合酶的信使rna (31日]。

在我们的研究中,nebivolol也显著降低了组织因子基因表达的增加,其中一个关键形成血栓的刺激,PAI-1 ox-LDL uPA诱导。阿替洛尔相反是无效的。在这种情况下,它最近在高血压患者治疗nebivolol与良好的止血和纤溶状态的修改除了其降压效果(32]。纤溶酶原激活物(PA)系统在血管内稳态中发挥着关键作用,是一个关键反应心血管损伤的机制。它包括蛋白水解催化剂u-PA,纤溶酶原及其降解产物、物血纤维蛋白溶酶,加上这个系统的主要抑制剂,PAI-1and PAI-2。

额外的蛋白酶抑制剂,受体,和调节器直接相关,受到广播系统,各自基质金属蛋白酶及其抑制剂的最大TIMPs [33]。基质金属蛋白酶在动脉粥样硬化中发挥重要作用,降解细胞外基质和血管壁导致削弱。此外,TIMP-1表达增加了动脉粥样硬化斑块的cholesterol-fed兔(34]。

我们的研究结果显示,ox-LDL基质金属蛋白酶的表达增加HUVECs确认其他直接实验证据表明氧化应激激活基质金属蛋白酶转译后的(35]。目前研究结果显示,首次nebivolol显著降低基因表达基质金属蛋白酶和HUVECs TIMPs,而阿替洛尔治疗没有效果。这个结果可能是由于特殊的抗氧化活性nebivolol和似乎是独立以来的β受体阻滞剂活动心得安是无效的在减少基质金属蛋白酶表达在实验性动脉粥样硬化(36]。

结论我们的研究结果表明,在培养内皮细胞暴露于氧化应激nebivolol可以减少许多基因的表达参与了动脉粥样硬化的发生和发展。我们和其他人已经证明nebivolol减少ROS浓度影响的信号途径NADPH氧化酶激活内皮细胞(3)在实验性高脂血症(37,38)和血管紧张素II-treated老鼠(7]。因此,我们可以推测,我们的结果取决于nebivolol的能力,减少细胞内ROS浓度,从而恢复内皮细胞的氧化还原状态。

我们的研究结果表明,nebivolol,除了其降压效果,可能是有用的在预防动脉粥样硬化的并发症与氧化应激有关。