文摘

地震有促炎作用和参与先天和适应性细胞和体液免疫。的单核苷酸多态性影响地震生产中发现的基因启动子区域。我们调查了协会的snp在地震子 607年和 137年地震-蛋白质的水平从西伯利亚西南部生产健康的捐赠者的PBMC。这些snp在启动子的基因分布站点建立了PCR。地震-蛋白的生产是由ELISA。我们的结果表明,PBMC从捐赠者携带137 c等位基因低水平的自发和LPS-stimulated地震生产。相比之下,PBMC从捐赠者携带607等位基因显示显著的自发和地震刺激生产与野生型相比。我们的研究表明,单核苷酸多态性 607年和 137年地震-基因的启动子区域影响的水平地震-蛋白质生产的PBMC健康的捐赠者西伯利亚西南部。

1。介绍

地震是一种多向性的促炎细胞因子,刺激生产干扰素-γ肿瘤坏死因子-αil - 1, - 2,粘附分子和细胞凋亡因素,增加t淋巴球增生,增强nk细胞的溶解性活动。它参与细胞和体液免疫反应1),先天和适应性2]。它已经表明,地震-参与各种疾病包括i型糖尿病的发病机制3),类风湿性关节炎4),克罗恩病(5)、肝硬化(6]。细胞因子基因的等位基因变异与基因启动子区多态性不影响蛋白质的氨基酸序列,但会导致细胞因子生产的变化。结果是,他们可能会改变免疫反应介导的细胞因子问题,可以与各种免疫性疾病有关。三个单核苷酸多态性(snp)在地震-基因启动子的立场−656 G→T−607 C→一、−137 G→C两种,−607 C→−137 G→C,位于分子转录因子的结合位点(cAMP反应元件结合蛋白)和H4TF-1核因子,因此突变分别在这两个网站可以影响地震-表达和改变生产的细胞因子7]。最近的研究调查地震-基因多态性之间的关系和各种疾病的倾向。它已经表明,个人携带607 c−−在风湿性关节炎病例137 c单体型普遍人群中德国和苏格兰。女性携带C-allele−137有患卵巢癌的风险加剧8]。这种基因型的存在未分化类型的鼻咽癌患者的预后恶化疾病和与早些时候转移(9]。G-allele−137与支气管哮喘的发展和相关皮肤过敏反应(10]。从中国人口乙型肝炎患者,137 gg和607−−ca等位基因变异的地震-基因启动子始终更频繁;相反,乙型肝炎是遇到一直很少在人与C-allele−13711]。然而,一个或其他地震-等位基因变异的影响蛋白质生产的水平还没有充分的研究。

因此如下:我们的研究的目的是调查地震的分布位置−607 c等位基因变异→−137 g→C在人口健康的捐赠者从西伯利亚西南部,和这些等位基因变异的影响水平地震-生产的外周血单核细胞(跨国公司)。

2。材料和方法

2.1。研究的对象

获得的DNA来自PBMC成年人(20 - 50岁)健康献血者( )多态性研究启动子区域的地震-基因和蛋白质生产的地震。所有科目给书面知情同意报名在这项研究中,经当地伦理委员会批准。

2.2。基因型的地震的定义

由一组基因组DNA提取PBMC Test-NA (DNA技术,俄罗斯)。Allele-specific放大进行实时PCR荧光检测的产品。四个引物用于放大,两个具体为每个多态性在607和137−−位置。放大控制了特定于特定基因的引物配对网站。产品置入发现使用染料SYBR-green i PCR进行使用iQ4周期计(美国Bio-Rad)。反应混合物(15 包含0.3 l最终体积) 具体和控制引物;PCR缓冲(16毫米Tris-HCl, pH值8.9,2.4毫米德国 65毫米(N 年代 );0.2毫米核苷酸; SYBR-green我;1单元聚合酶;和5 ng DNA。PCR条件如下:变性(95°C, 3分钟)5周期放大95紧随其后°C 10秒钟,57°C 10秒钟,72°C 10秒;然后在95年30个周期°C 3秒钟,59岁°C 3秒钟,72°C 3秒钟,78°C 10秒钟(板读),82年°C 10秒钟(板读)。熔解曲线分析被执行:60周期在65年开始°C温度增量为0.5°C,读在每个周期的板。获得的数据与荧光的增加解释的基础上,和融化曲线是用来评估特异性。所使用的特定的引物137 C -TAATGTAATATCACTATTTTCATGAAATC - 137克 -AATGTAATATCACTATTTTCATGAAATG - 607 C -GTTGCAGAAAGTGTAAAAATTATTAC - 607年,一个 -GTTGCAGAAAGTGTAAAAATTATTAA - 。

内部控制引物LTM 1 tgggtgctagaggtataatcgLTM 2 ttagaggaagctgggtaagag。

当我们使用两对allele-specific引物,我们研究了在四个试管反应同时为每个样本检测的四种可能的单。

2.3。从PBMC条件培养基的制备

PBMC从使用Ficoll-Urografin肝素化血液密度梯度分离和培养( 细胞/毫升)48小时48-well板(Beckton Dikkinson,美国)存在与否的有限合伙人(美国055 / B5σ)的最终浓度10 克/毫升。

2.4。地震级别的定义

的地震-蛋白质水平条件培养基是由ELISA (Bender医疗系统、奥地利)。

2.5。统计分析

所有单核苷酸多态性在哈迪温伯格平衡人口调查。对于数据的统计分析,我们使用非参数Mann-Uitni的测试采用Statistica 6.0程序。确定定量地震生产水平的差异,我们使用分位数排名分类根据Mosteller-Tewkee算法(12]。分析地震的浓度,我们确定的概率限制经验分布分位数(X(气))。分位数范围(K),总振幅的变化的地震水平分割,计算从最小样本量(Nmin)斯特奇斯的公式。 标准(P )和费舍尔的精确方法对于小样本(Ptmf)被用来判断的可靠性ofoccurrence定性特性和频率在不同范围的地震事件的变化(13]。

3所示。结果

3.1。地震-基因启动子基因型分布

敏感性的分布/耐药基因的等位基因负责抵抗或免疫病理疾病的风险是独特的人口。这可能是一个原因的多样性抗原的免疫反应。这两个地震-基因的单核苷酸多态性的研究对一群健康的人( )。的相对频率C / C, C / A, A / 607 C的变体→多态性分别为39.2%、44.7%和16.1%,分别。C等位基因频率发生在64.5%和35.5%,分别。分析地震- 137−基因多态性→G的位置给了以下结果:纯合子的频率变体(G / G)为45.5%,与杂合的变体G / C是42.7%;C / C基因型被发现在11.8%的情况下,和G和C等位基因频率分别为66.8%和33.2%,分别。交流电的频率(137−607 /−)单体型,22% AG) 14.6%, CG 55.9%, CC 7.5%。

3.2。地震相关生产−607 c→多态性

我们接下来研究的地震集中在媒体受制于PBMC健康的捐赠者。地震-蛋白质的平均水平是21.86 pg / mL (9.83;57.60(四分位数)]自发生产和72.44 pg / mL (32.96;103.07(四分位数)]LPS-stimulated生产。我们进一步研究了地震-生产和多态变量之间的相关性−607 c→一个地震-基因启动子(见图2)。

地震-生产LPS-stimulated PBMC明显更健康的捐赠者携带CA基因型比那些607−CC基因型启动子的位置。我们分析了基因型频率分布和地震生产之间的关系,将细胞因子浓度划分为“低”,“媒介,”和“高”类。在15 - 85%分位数浓度范围(3.5 - -93.5 pg / mL)自发生产被列为“媒介。“生产水平外这些限制被列为“低”或“高”(见表1)。我们发现更高频率的等位基因携带者与高水平的人自发的地震生产。

表1
基因启动子基因型分布频率的地震- 607−→C的位置相对于自发的地震-分泌水平。
3.3。地震相关生产−137 g→C多态性

我们研究了地震-生产之间的相关性PBMC地震-健康的捐赠者和变异的基因型137−位置,我们得到以下数据(见图1)。


图1
影响地震-基因启动子区多态性变异的−137 G→对地震-蛋白质生产的C PBMC(数据表示为中位数和25和75百分位数)( )。

图2
多态变量的影响在地震-基因的启动子区域−607 A→C在地震生产PBMC(数据表示为中位数和25和75百分位数)( )。

地震-生产LPS-stimulated PBMC明显少人携带的CC基因型比GG基因型137−位置。为了进一步研究这个问题,我们分析了基因型频率分布之间的关系和地震生产水平。三个主要的限制范围的地震-生产水平的变化是由分位数排名分析宽容的随机统计的“激增”,关键偏差从正态分布的一个标志。按照惯例,所有的经验获得浓度的细胞因子被归类为“低”,“媒介,”或“高。“浓度范围15 - 85% (25.6 - -114.3 pg / mL) LPS-stimulated生产被列为“媒介。“浓度这些分位数的限制外,也就是说,小于25.6 pg / mL和超过114.3 pg / mL,被列为“低”和“高,分别”。

我们评估了生产者之间的等位基因变异频率不同级别的地震。结果如表所示2。

表2
基因启动子基因型分布频率的地震- 137−G→C位置与LPS-stimulated水平地震-分泌。

137−C等位基因的频率明显高于在较低的捐助者LPS-stimulated地震生产比中等或高产量。因此,LPS-stimulated地震较低的生产人员与CC基因型比捐助者GG基因型137−启动子的位置。C等位基因频率更大刺激组与低水平的地震-生产。

3.4。生产能力由单核细胞的地震与地震相关多态性

这两个多态性,C和−−137 G / 607 C / A,在强大的连锁不平衡(14),等位基因−607 C的所有可能的组合→−137 G→C进行了调查。已被证明有增加自发生产的地震与haplogenotypes−607 cn /−137 gn相比,607 aa / gn 137−−−607 cn /−137 cc。因此等位基因c和−−607与137克增加自发生产的地震。增加LPS-stimulated生产的地震与haplogenotype−607 cn /−137 gn相比,607 cn /−−137 cc(见图3)。


图3
生产能力由单核细胞的地震与137−607 /−地震多态性(数据表示为中位数和25和75百分位数)( )。

本研究表明,地震-基因型的频率健康的捐赠者来自新西伯利亚市(西伯利亚西南部的)如下:−607 cc, 32.2%;−607 ac, 44.7%;−607 aa, 16.1%;−137 gg, 45.5%;−137 gc, 42.7%;−137 cc, 11.8%。单,价值观如下:AC (137−607 /−), 22%;AG) 14.6%;CG, 55.9%;CC, 7.5%。 LPS-stimulated production of IL-18 was lower in persons with the CC genotype than in donors with the GG genotype at the −137 position of the gene promoter. IL-18 production by LPS-stimulated PBMC from healthy donors carrying the CA genotype was significantly higher than from those carrying the CC genotype at the −607 position. Alleles −607C and −137G are associated with increase of spontaneous production of IL-18, allele −137G increases spontaneous and stimulated production.

4所示。讨论

遗传因素在所有主要的人类疾病的发病机制十分重要,众所周知,人类基因多态性,不同免疫反应的影响方面。不同的细胞因子基因多态性变异可能诱发高或低水平的蛋白质产量。在地震-基因启动子单核苷酸多态性−607 C→−137 G→C影响这个启动子的功能活跃的部分,也就是说,分子转录因子结合位点和H4TF-1核因子,分别。因此,突变在这两个网站可以影响地震-表达式和改变地震-生产的水平7]。

考虑到地震-基因等位基因的分布在不同人群健康的捐赠者,我们发现不同的频率。日本人口中,基因型GG, GC,发现和CC 137−位置启动子的频率为75.4%,23.1%,和1.2%,分别;基因型AA、交流和CC 607−位置频率43.9%,39.2%,和16.9%,分别为(15]。中国人口137−gg基因型频率,67.3%;−137 gc, 30%;−137 cc, 2.7%;−607 aa, 24.7%;−607 ac, 53.3%;−607 cc, 22%11]。从瑞士(欧洲人10)和意大利(9)的特征频率137 gg基因型−−137 gc,−137 cc的分别为54.1%和48.3%,38.7%和43.8%,7.2%和7.9%,分别。地震- 607−基因启动子的位置被发现在意大利人口以下利率:AA, 23.6%;交流,47.2%;CC, 29.2% (9]。

我们发现以下地震-基因型频率在健康献血者来自新西伯利亚(西伯利亚西南部的):GG, GC,和CC 137−启动子的位置被发现在45.5%,42.7%,和11.8%的情况下,分别;AA、交流和CC 607−位置被发现在16.1%,44.7%,和39.2%,分别。因此,基因型频率在西伯利亚西南部的人口类似于欧洲国家(意大利和瑞士)。然而,一些基因型分布差异的居民西南西伯利亚和中国和日本的人口。

众所周知,基因启动子多态性可以影响蛋白的生产水平。我们研究了两个地震-基因启动子多态性之间的关系和LPS-stimulated水平地震生产。从人PBMC携带137−C等位基因启动子的位置显示低LPS-stimulated细胞因子的生产。同时,地震的水平生产由捐助者PBMC−607 ac基因型高于从捐赠者−607 cc基因型。相关的等位基因是同样大LPS-stimulated地震生产。似乎没有等位基因的剂量效应607−SNP和我们不能发现任何差异地震生产当杂合子137−SNP被认为是作为一个整体。然而,在根据他们的基因型杂合子分裂一个SNP在其他SNP,我们能够证明微分haplogenotypic地震生产。137−607 cn /−gn haplogenotype与更高的自发的地震生产。增加LPS-stimulated生产的地震与haplogenotype−607 cn /−137 gn相比,607 cn /−−137 cc。因此等位基因c和−−607与137克增加自发生产的地震、等位基因−137克增加自发和刺激生产。 It is possible to assume that only in case of presence of both alleles conducts to increase production of IL-18 protein. The increased frequency of allele −607A with high production IL-18 is connected with heterozygotes −607CA (16 donors from 19).

Arimitsu et al。16]表明,地震-基因的多态变量影响的地震生产由单核细胞。特别是,他们显示自发和LPS-stimulated生产的地震137年志愿者与−gg基因型高于137年那些−gc基因型,这与我们的结果一致。

地震是一种多向性的促炎细胞因子,主要影响1型辅助细胞的分化,从而参与细胞免疫反应和炎症反应。地震已被证明有抗肿瘤活性。地震-基因启动子多态性之间的关系的研究和开发肿瘤疾病的可能性表明,女性携带137年−C等位基因启动子的位置面临更大的风险,发展中卵巢癌(8]。我们的研究结果的基础上,从文献和数据,可以假设在137−C等位基因的存在位置地震-基因启动子在这类病人结果在一个低效率的抗肿瘤免疫反应,因为地震生产由细胞免疫活性的降低。

血清促炎因子水平的地震是过敏性哮喘患者显著升高在急性期(17]。地震-多态性和过敏性哮喘之间的关系的研究表明,G等位基因137−位置导致疾病的风险升高发展;此外,所有的74个病人检查了CC基因型(10),根据我们的数据与减少地震生产。此外,−之间的连锁不平衡是观察到的137年和105年的地震基因的多态性和105年的地震-基因的等位基因可能与哮喘的发病机理有关18]。

早产儿和新生儿体重降低的风险发展坏死性小肠结肠炎,地震也参与了该病的发病机制。疾病严重程度之间的关系的分析和基因型频率在607−地震-基因的位置表明,AA基因型频率显著高于患者第三、坏死性小肠结肠炎的最严重阶段,当肠道壁穿孔(19]。

的基础上目前的知识,或许有人认为地震-基因启动子的等位变异−607 c→−137 g→C位置,根据我们的结果,影响蛋白质生产的水平,可能导致条件的发病机制涉及到地震的重要作用。

总之,这项研究表明,健康的捐赠者之间的地震-基因型频率从新西伯利亚市(西伯利亚西南部的)如下:−607 cc, 39.2%;−607 ac, 44.7%;−607 aa, 16.1%;−137 gg, 45.5%;−137 gc, 42.7%;−137 cc, 11.8%。这是符合欧洲人口中的分布(意大利和瑞士)。等位基因变异在地震-基因启动子−607 c→−137 g→C位置影响生产水平的中介的免疫活性的细胞。LPS-stimulated生产的地震- CC基因型的人低于捐助者的GG基因型137−启动子的位置。C等位基因频率较低的组显著的高于LPS-stimulated地震生产。LPS-stimulated生产地震-从健康的捐赠者是PBMC大大增强在那些携带CA 607−基因型的位置。因此等位基因607 c和137克−−与自发生产的地震的增加和等位基因−137克增加自发和刺激生产。可以假定唯一的两个等位基因的存在进行地震-蛋白质的增加产量。

承认

这项工作是支持的俄罗斯基础研究基金会(项目没有。05 - 04 - 48649 a)。