文摘
客观的。评估CD64的表达式和CD163中性粒细胞和单核细胞在众位/没有败血症和比较CD64的诊断准确性和CD163分子表达坚定(1)平均荧光强度(MFI) CD64 CD163;和(2)比(指数)的荧光信号线性化MFI标准化的珠子。患者和方法。56危重新生儿和儿童与全身炎症反应综合征(SIRS)和可疑脓毒症,分为两组:先生们与脓毒症(和先生们没有脓毒症)。结果。CD64和CD163 MFI以中性粒细胞和单核细胞在众位与脓毒症患者升高。诊断精度指标等于诊断的准确性MFI CD64的中性粒细胞(0.833和0.854 0和0.975和0.983天1)和单核细胞(0.811和0.865 0和0.825和0.858天1),和CD163中性粒细胞(0.595和0.655 0和0.677和0.750天1),但不是CD163单核细胞。结论。CD64 MFI、CD163 MFI CD64指数中性粒细胞和单核细胞和中性粒细胞CD163指数都可以用于歧视SIRS危重新生儿和儿童的和败血症。然而CD64指数中性粒细胞,优于所有其他标记。
1。介绍
CD64的高亲和性和限制isotype-specificity FcγRI受体表达在巨噬细胞,单核细胞,中性粒细胞,嗜酸性粒细胞1,2]。有一些报告关于脓毒症的诊断评估其潜在效用或感染成人(3- - - - - -8和新生儿9- - - - - -12),但只有少数儿童(13,14]。在一个成年人的研究中,高强度CD64的表情已经发现中性粒细胞的全身炎症反应综合征(SIRS)患者和脓毒症比只从SIRS患者中性粒细胞(3]。高CD64表情中性粒细胞单核细胞伴随高CD64表情一直在报道一些成人的研究(5,15,16]。
CD163单核细胞/ macrophage-associated抗原,最近被确认为血红蛋白清道夫受体(17]。除了间隙的血红蛋白,它也抗炎作用和免疫调节作用[18]。人们已经发现,CD163表情单核细胞表面的浓度负相关可溶性形式(sCD163)在随机选择的病人19]。在人类实验endotoxinemia迅速崛起在等离子sCD163观察一起减少表面CD163表情后分离出单核细胞脂多糖(LPS)的管理,这表明LPS诱导的CD163脱落分离单核细胞的表面。24小时在人类有限合伙人管理后,CD163表面表达持续增加在基线表达式(20.]。可溶性CD163已经发现成人高架在脓毒症(21- - - - - -23),而膜的表面表达CD163 (mCD163)败血症尚未评估。
研究的第一个目的是评估CD64的表达和CD163中性粒细胞和单核细胞与SIRS危重新生儿和儿童脓毒症和发现是否能区分传染性和非传染性的先生们。先生们通常由感染引起,但其他条件,如低心输出综合症,呼吸窘迫,出血可以引发新生儿和儿童。人们已经发现,有多达82%的儿童承认儿科重症监护病房有两个或两个以上的众位的迹象24]。
研究的第二个目的是比较CD64的诊断正确率平均荧光强度(MFI) CD163小额信贷机构,使直线化MFI CD64指数标准化的珠子,CD163指数使直线化MFI标准化珠子以中性粒细胞和单核细胞。最近可用软件进行数据分析和指数计算,技术来源错误和主体性,它们存在于手动方法,减少和比较不同实验室之间的结果是可能的(25]。
2。患者和方法
2.1。病人和设置
这三世多学科水平进行了前瞻性研究新生儿和儿科重症监护病房2006年1月至2006年9月。连续56 SIRS患者和临床疑似感染有资格报名。众位定义根据国际儿科败血症共识会议定义(26]。临床疑似感染被定义为一个显式声明的医生记录,表明感染的嫌疑,结合诊断排除感染的起始和经验性抗生素治疗的处方。患者不包括如果他们收到了抗生素治疗超过24小时前承认,如果他们在上周做了手术,或如果他们证明病毒感染。脓毒症的诊断证实了阳性血培养或气管吸入物当胸片显示肺炎的迹象。没有其他文化(尿液、脑脊髓或穿刺通常无菌体液)积极的在我们的病人。患者临床脓毒症的诊断成立于消极的文化,但随着强烈怀疑败血症,接受一个完整疗程的抗生素治疗。集团没有脓毒症包括疑似感染患者在随后的临床过程,实验室数据,和微生物测试排除感染,抗生素治疗几天后停止的是谁。与脓毒症患者分为两组:先生们和先生们没有脓毒症。分类是由主治医生知道流式细胞术的结果。我们分析的数据分别为两个年龄组:新生儿年龄小于28天,和孩子年龄超过28天,革兰氏阳性和革兰氏阴性脓毒症。 Patients’ characteristics are summarized in Table1。病原体从血培养分离葡萄球菌epidermidis ,链球菌agalactiae ,脑膜炎奈瑟氏菌 ,链球菌引起的肺炎 和链球菌 ,而病原体分离气管吸入等流感嗜血杆菌 ,链球菌引起的肺炎 ,莫拉克斯氏菌属复活 ,大肠杆菌 ,金黄色葡萄球菌 ,铜绿假单胞菌 。
两组类似的关于性别(测试中,),儿童死亡率的风险评分(棱镜)第三得分(方差分析,)、年龄(方差分析,和新生儿和儿童resp),胎龄(方差分析,)和出生体重(方差分析,)。
这项研究是通过国家卫生部医学伦理委员会,斯洛文尼亚共和国,书面同意之前从父母获得血液样本。
2.2。样本收集和流式细胞术
血液样本(0.5毫升)得到的疑似败血症(0)和24小时后(第一天)一起为常规实验室检测样品。全血EDTA-anticoagulated样本立即运往流式细胞仪实验室在工作时间或存储冷藏(4˚C)在夜间或周末(36小时)。CD64的表达和CD163中性粒细胞,单核细胞,淋巴细胞测量通过定量流式细胞术FACSCalibur流式细胞分析仪(美国纽约Becton Dickinson)使用Leuko64化验(Trillium诊断,LLC我,美国)。分析仅供研究使用,由三个抗体与特异性CD64(克隆22和32.2,异硫氰酸荧光素(FITC)共轭)和CD163(克隆mac2 - 148, phycoeritrin (PE)共轭),和一个荧光珠悬架有三个荧光信号(由于FITC绿色荧光,橙色荧光类似于体育,和红色荧光的星火红色)珠子的唯一标识,用于仪器校准和白细胞CD64的标准化和CD163表达在人类血液。样品制备和流式细胞分析仪的设置是根据制造商的指示。简单地说,50μL(全血或稀释全血白细胞浓度小于调整/ L,孵化15分钟在黑暗中在室温下的鼠单克隆抗体与ammonium-chloride-based其次是红细胞裂解红细胞溶解溶液(Trillium溶解)。荧光珠被添加和流式细胞分析仪分析了至少50 000白细胞。数据分析的荧光强度是由CellQuest软件(美国加州,正欲)(表2)。MFI测量线性对数尺度的价值在淋巴细胞(红色、负控制测量CD64表达式),单核细胞(绿色,积极控制,测量CD64、CD163表达式),中性粒细胞(蓝色,测量CD64表达式),珠子(水蓝、测量FITC和PE表达式)(图1)。指数计算是由Leuko64 QuantiCalc软件(美国我Trillium诊断)。指数测量导出了线性化的比率MFI FITC信号的细胞群的珠子。内部负控制提供的化验是淋巴细胞的自动测量CD64指数小于1.0,和一个内部积极控制自动化提供的试验是测量的单核细胞CD64指数,必须超过3.0。流式细胞术进行血液取样后36个小时。之前的开始研究延迟样本分析的影响并无显著差异水平CD64 CD163表达式中检测出第一个取血样后36个小时。Isotype-control抗体是在每个实验中检测非特异性染色;然而CD64的计算和CD163 MFI没有对照组isotype-control MFI为了准确地比较线性化的比率(索引)MFI独自MFI。
(一)
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2.3。统计分析
数据表现为中间值和95%置信区间中值。比较组间使用未配对Mann-Whitney试验和方差分析(方差分析)。比例的患者相比测试。接受者操作特征(ROC)曲线被吸引到定义最佳的敏感性,特异性,截断值,和诊断的准确性,由ROC曲线下的面积(AUC)研究了表面抗原(27,28]。截止值的敏感性和特异性的最大金额是获得由统计程序。羽根和麦克尼尔的诊断精度进行比较。CD64的得分(两个变量的组合:CD64 MFI对中性粒细胞和单核细胞或索引CD64中性粒细胞和单核细胞)计算CD64 MFI和CD64指数,分别描述的其他地方(29日]。当CD64荧光强度或CD64指数中性粒细胞和单核细胞被截止,0被分配的得分。1的得分被分配当标记在一种类型的细胞和其他类型的标记细胞在截止水平和2的得分被分配当标记两种类型的细胞在截止的水平。ROC曲线分析CD64的得分被执行。的差异被认为是显著的。统计分析使用Medcalc窗户,版本5.0 (Medcalc软件、Mariakerke比利时)和社会科学统计软件包为Windows,版本12.0 (SPSS Inc .)、芝加哥、生病,美国)。
3所示。结果
CD64小额信贷机构、CD163小额信贷机构和CD64指数对中性粒细胞和单核细胞显著高于在SIRS患者脓毒症患者与非传染性的众位,而CD163索引显示统计差异只在中性粒细胞在0天(表2)。统计上显著的增加()从0到天第一天被发现只有CD163 MFI中性粒细胞与众位儿童脓毒症和CD163 MFI和索引非传染性的SIRS患儿的单核细胞。儿童CD64指数中性粒细胞高的中位数比在新生儿败血症和脓毒症,虽然没有显著差异()的时候疑似败血症和24小时后(图2)。我们没有发现任何显著差异CD64 CD163索引,中性粒细胞和单核细胞和CD64 CD163小额信贷机构,在革兰氏阳性和革兰氏阴性脓毒症(对于所有的比较,数据未显示)。最佳诊断截止水平,auc,敏感性和特异性CD64 CD163索引,CD64和中性粒细胞和单核细胞CD163小额信贷机构,和CD64得分众位与脓毒症的时候疑似败血症和24小时后展示在表3。设置灵敏度ROC分析CD64指数在95%以上为中性粒细胞显示截点1.15 0天(敏感性96.6%,特异性40.7%)和1.71(敏感性100%,特异性75.0%)1天。诊断精度没有明显差异的小额信贷机构和相应的指数参数,CD64 CD163,中性粒细胞和单核细胞在疑似败血症和24小时后的时间(比较),除了诊断准确性CD163 MFI的单核细胞,这是在24小时内显著高于CD163指数的诊断准确性为单核细胞()。中华民国曲线不同的索引的时候疑似败血症和24小时后呈现在图3。诊断精度CD64指数的中性粒细胞和单核细胞的时候疑似败血症都明显高于与诊断精度CD163指数中性粒细胞(和、职责)和单核细胞CD163指数(和、职责)。诊断的准确性CD64指数明显高于中性粒细胞在24小时相比,诊断精度CD64指数单核细胞()、中性粒细胞CD163指数(单核细胞)、CD163指数()。两个变量的组合:CD64 MFI与CD64 MFI中性粒细胞单核细胞或CD64指数中性粒细胞单核细胞与CD64指数(CD64得分点)无关紧要的增加诊断的准确性CD64 MFI ()或CD64指数(),中性粒细胞在0天,而有一个微不足道的诊断准确性下降(和、职责)1天(表3)。
(一)
(b)
(一)
(b)
4所示。讨论
据我们所知,这是第一个研究评价白细胞抗原的表达CD64和CD163 SIRS危重新生儿和儿童脓毒症。在这项研究中,我们已经表明,CD64的表达和CD163中性粒细胞和单核细胞升高患者脓毒症患者与非传染性的先生们。我们还表明,诊断的准确性于索引对中性粒细胞和单核细胞和中性粒细胞CD163 CD64比率(索引)的基础上的荧光信号线性化MFI标准化珠子,等于手动确定MFI的诊断准确性,如果同样的流式细胞分析仪。因此,我们的研究结果表明,测试的成本效益,基于多个抗体(CD64和CD163)和标准化的珠子应该评估。
CD64表达在低浓度表面未激活的中性粒细胞(30.]。CD64表面upregulation引起粒细胞集落刺激因子(g - csf)和干扰素-γ(正γ在4 - 6小时内)的刺激(25]。我们的研究证实了研究结果的成年人CD64的表达水平明显高于在SIRS患者脓毒症患者与非传染性的众位(3]。在我们的研究中,对中性粒细胞CD64的表达明显高于在SIRS危重新生儿和儿童脓毒症与非传染性的SIRS组相比。到目前为止,CD64表情白细胞研究主要在新生儿人口。这些研究表明,CD64表情中性粒细胞是调节在早期新生儿感染9,10],late-neonatal感染[11,12早产儿,感染(11,13]。一些作者甚至建议,由于其灵敏度高,测量中性粒细胞CD64表达式允许临床医生停止抗菌治疗如果在24小时内疑似感染阴性,而不必等待明确的微生物结果(9]。我们的研究结果是根据其他研究的结果(9只有在某种程度上。这两项研究的auc是类似的,但在另一项研究[9),实现更高的灵敏度,可能是因为提前截止值测定,使更好的灵敏度,目的是识别所有被感染的病例。由于不同的流式细胞术方法用于测量CD64表达式的其他研究9),截止值不能相比。在我们的研究中统计的截止值测定项目获得最大的敏感性和特异性的和比较不同的标记。为了提高灵敏度,我们确定的截止值灵敏度为96.6%和100%,分别在0和1天。特异性是略低于第一天在前面提到的研究(9]。3例coagulase-negative葡萄球菌引起的败血症可能对中性粒细胞降低CD64的灵敏度表达式在我们的研究中,而在另一项研究[9没有这种情况。儿童,只有两个14婴儿和儿童的报道,和8个小孩,分别住院,因为不同的细菌感染(主要是肺炎和pyelonephritides)谁CD64表情中性粒细胞明显高于与未感染控制(13,14]。到目前为止,CD64表达式没有研究感染性重症儿童。在成人患者中,高表达CD64的中性粒细胞在革兰氏阴性脓毒症与革兰氏阳性发现脓毒症(15]。在最近的研究在新生儿31日),在我们的研究中,这种差异还没有得到确认。新生儿和成人之间的这种差异的原因可能是一个低表达与革兰氏阴性细菌感染新生儿中性粒细胞反应。事实上,我们发现新生儿败血症CD64指数低于在孩子,虽然差异无统计学意义。小说的标志感染,CD64的得分点,包含了CD64表达式的定量分析对中性粒细胞和单核细胞最近介绍了作为一个成年人的标志可以区分感染和健康状态(29日]。在我们的研究中,CD64得分能够区分先生们与脓毒症和非传染性的先生们,尽管其诊断准确性并不高于CD64表情中性粒细胞。
据我们所知,CD64表达单核细胞在新生儿和儿童此前还没有研究。有一些报道高架CD64的表情单核细胞在成年患者脓毒症5,15,16]。CD64的结果在我们的研究中,单核细胞和中性粒细胞可疑脓毒症时相似,但24小时后CD64的诊断准确性单核细胞显著低于中性粒细胞。这些数据可以表明,激活单核细胞比中性粒细胞(更快、更迅速地完成32]。
CD163表达的增加是一个成熟的一部分的单核细胞吞噬巨噬细胞(18]。CD163调节白细胞介素- 6和糖皮质激素的表达与白细胞介素- 10”,并通过有限合伙人和干扰素-表达下调γ(18]。虽然CD163的表达式中值的绝对值是低得多比在中性粒细胞单核细胞在我们的脓毒症患者,CD163两种类型的细胞上的表达可以区分SIRS患者脓毒症和非传染性的先生们在我们的研究中。动力学CD64的荧光强度和CD163中性粒细胞是诊断非常重要,这是极不可能的非特异性染色的原因。也代表流式细胞仪图成为可能相当锋利的细胞群之间的区别没有导致细胞控制严重的问题。因此,我们的研究结果表明,像单核细胞,中性粒细胞能够某种程度上表达CD163。
膜CD163表达尚未临床评估。只有一个作者发现增加骨髓浸润CD163-positive后期的分析样本中巨噬细胞的患者死于严重脓毒症或脓毒性休克与控制(33]。相比之下,高浓度的可溶性CD163 (sCD163)中描述成人败血症的病人在几项研究[3,21]。它已被证明与单核细胞培养实验,CD163 LPS刺激后可以从细胞膜脱落(20.),交联Fc受体的免疫球蛋白G (34)或氧化应激(35]。CD163从单核细胞的膜的脱落与减少的表达膜CD163培养单核细胞(20.,34]。减少表达膜CD163可能是部分原因是脱落的CD163 [20.),部分原因是减少CD163信使rna合成(34,36]。在健康成人志愿者,CD163表面表达又增加了LPS刺激后24小时(20.]。增加表达的确切时间点尚未完全已知的,但估计0-24小时在成年志愿者(LPS刺激后20.)甚至在培养单核细胞(34]。结果表明,刺激与LPS诱导培养的短期CD163 mRNA表达的抑制单核细胞,而单核细胞的长期培养LPS处理显示intereleukin-10依赖恢复表面CD163表达式(34]。在我们的临床研究中,我们没有观察到过渡的膜CD163单核细胞上表达。CD163单核细胞和中性粒细胞的表达患者败血症的患者高于非传染性的先生们在疑似败血症和24小时后的时间。其原因可能是endotoxinemia后临床症状观察到有明显延迟。
过去的大多数临床研究使用手动确定荧光强度来描述CD64表情中性粒细胞。然而,这种方法是日常操作和仪器波动和不能用于比较不同实验室之间。新开发方法对于于索引使用校准珠子作为内部荧光强度标准,完全自动化的软件一起指数计算,消除了主体性在终端用户数据分析,最小化lot-to-lot变异提供了一个新颖的方法,在消除主观性由于不同范围的运营商的经验和技能25]。在我们的研究中,比较手动确定荧光强度和于指数显示,诊断精度的两个参数是平等CD64的中性粒细胞和单核细胞和中性粒细胞CD163,但不是CD163单核细胞。我们的解释是,自动索引计算最初开发评价CD64指数在不同临床条件下中性粒细胞(25),该方法可能不是普遍剧增评估所有其他抗原在不同细胞类型用于诊断目的。中性粒细胞CD64指数的计算,达到了最高的诊断准确性在我们的研究中,是最优的,我们建议这个参数应该被用于未来的评估。我们发现没有研究,除了一张海报在脓毒症2007在巴黎37指数计算),用于评价CD64表情中性粒细胞。
本研究的一些局限性值得考虑。首先,与culture-negative患者临床脓毒症的定义,特别是危重新生儿,仍然是一个问题的讨论。其次,患者的数量相对较少。需要更多的新生儿和儿童的诊断精度更精确的评估选择感染标记(CD64和CD163指数对单核细胞和中性粒细胞)和在未来比较经常使用感染标记。血液在我们的研究样本在36小时内处理。临床使用的方法应该是可用的每一天,特别是因为一些作者建议处理的血液标本进行分析的细胞表面标记后立即获得他们避免细胞凋亡(30.]。然而,其他作者声称为中性粒细胞CD64试验测量是稳定的30小时在室温和冷藏(72小时25]。正如我们已经提到的,没有显著差异水平CD64和CD163表达式得到前36小时后血液采样在我们的研究中。
5。结论
本研究的数据表明,CD64和CD163表达式对中性粒细胞和单核细胞升高与SIRS危重新生儿和儿童脓毒症。于诊断精度指标对中性粒细胞和单核细胞和中性粒细胞CD163 CD64比率(索引)的基础上使直线化的荧光信号MFI标准化的珠子是相当于手动确定MFI的诊断准确性,如果处理相同的流式细胞分析仪。因此,CD64 MFI、CD163 MFI CD64指数对中性粒细胞和单核细胞和中性粒细胞CD163指数都可以用于歧视SIRS危重新生儿和儿童的和败血症。然而CD64指数中性粒细胞,优于所有其他标记。
确认
本研究支持的斯洛文尼亚研究机构,批准号j3 - 6245。作者感谢Andreja NataKopitar进行流式细胞仪测量和医疗和护理人员的儿科重症监护室的有价值的合作。