文摘

脓毒性休克(SS) -相关multiorgan功能障碍与氧化损伤有关,但对颞损害概要及其严重程度的关系。目前工作前瞻性调查21 SS患者。血液样本得到诊断,24,72小时、7天,和3个月。在承认,硫代巴比土酸活性物质(TBARSs),血浆蛋白质羰基,血浆蛋白质蛋氨酸亚砜(女士),铁/降低抗氧化能力(收紧),总红细胞谷胱甘肽(RBCG)、尿酸(UA)、和bilirrubin水平增加( )。radical-trapping总抗氧化潜能(陷阱)和维他命e是类似于控制,和维生素c下降( )。在进化过程中,TBARS RBCG增加( ),维生素e水平保持稳定,而血浆蛋白质羰基和MS,陷阱,维生素c,减少谷胱甘肽和UA水平下降( )。3个月后,血浆蛋白质羰基和女士持续升高。更严重的患者表现出更高的TBARS,陷阱,收紧,维生素c, UA, bilirrubin水平。我们的研究结果表明早期和持续的氧化应激在感染性休克和lipoperoxidation水平的增加与脓毒症严重程度之间的相关性。

1。介绍

炎症,败血症,特别是感染性休克与全球和本地hypo-perfusion相关联,缺血再灌注事件,内皮损伤有一个关联的促凝血的状态,和monocyte-macrophage系统激活。所有这些过程导致的生产和发布不同的细胞因子和其他炎症介质1]。他们也产生大量的自由基的生产监管的方式与high-oxidative潜在的损害(2]。事实上,几个来源的活性氧(ROS)已发现在脓毒症和脓毒性休克,包括线粒体呼吸电子传递链,免疫细胞和黄嘌呤氧化酶激活由于缺血和再灌注和呼吸爆发NADPH氧化酶(3]。

几项研究表明氧化应激在脓毒症的存在4- - - - - -9]。早期生产活性氧(ROS)实验研究已经证明了在脓毒症10),和过度释放超氧化物阴离子已被证明有助于postreperfusion氧化损伤在几个缺血器官(11,12]。硫代巴比土酸增加活性物质(TBARSs),这是一个标志lipoperoxidation,一直在观察危重病人与multiorgan衰竭(MOF)发展(7,13]。

大多数研究氧化应激在脓毒症看着一个时间点,通常在入学。此外,这些研究很少有专门看着脓毒性休克患者(14,15]。但脓毒性休克特色可能显著区别不太严重的败血症形式。它有一个非常动态的同时与多个变化发生在短短几小时。因此,更全面的研究的时间演化脓毒性休克患者的氧化应激是必需的。这是一个关键的步骤定义windows干预旨在调制这种反应的机会。

我们的主要目的是评估广泛颞抗氧化剂和氧化损伤在感染性休克的进化。次要目标是确定氧化损伤标记和抗氧化水平与感染性休克严重程度和评价蛋氨酸亚砜,小说的标志蛋白质氧化损伤。

2。材料和方法

这是一个前瞻性研究,包括诊断感染性休克患者承认大学医院的外科ICU从2004年5月到2005年8月。这项研究是Facultad伦理委员会批准的药物的智利天主教大学,圣地亚哥,智利,一个从所有病人或其家属知情同意了。

2.1。病人和管理

患者注册如果他们满足以下条件:(1)感染性休克的诊断根据共识会议(16),(2)不到24小时运行自进入急诊室,和(3)年龄超过18岁。排除标准:(1)患者极其生病,在人生存时间间隔不到48小时,(2)使用任何外部维生素补充登记前一周内,(3)onco-hematological,(4)慢性肾功能衰竭患者。所有患者根据标准的血流动力学和呼吸管理算法(17]。

2.2。数据收集

人口数据、诊断、急性生理和慢性健康评估(APACHE) II评分,sepsis-related器官衰竭评估(SOFA)得分,血流动力学和呼吸参数,最大作用于血管的药物剂量,一般生物化学(肾、血液和肝脏功能)和C反应蛋白(CPR)水平在入学注册、24和72小时,以及进化的第七天。

2.3。氧化应激评价

氧化应激标记采用硫代巴比土酸活性物质(TBARSs),索引的脂质过氧化作用,加上金属羰基合物,蛋氨酸亚砜在血浆蛋白标记的蛋白质氧化损伤。抗氧化活性是通过测量评估:(a)总抗氧化能力(TAC)决定有两个方法:(1)总激进-捕获的抗氧化潜力(陷阱)和(2)铁/降低抗氧化能力(收紧);(b)不涉及酶作用的抗氧化剂,维生素C和E,β-胡萝卜素、番茄红素;(c)酶促抗氧化代数余子式:减少和总红细胞谷胱甘肽;和(d)特异性的抗氧化剂:尿酸、胆红素、白蛋白。血液样本是在获得诊断(T0)、24小时(T1)、72小时(T3),在进化的第七天(T7)。延迟测量在所有3个月后幸存者。正常的每个参数的值从一群获得17健康志愿者与脓毒性休克患者年龄和性别匹配。

2.4。实验室技术

所有样品都是储存在−20°C和10天内进行了分析,但对谷胱甘肽分析,样本存储在ACD 4°C和10天内也进行了分析。

2.4.1。总抗氧化能力(TAC)

陷阱(Total-Trapping激进(过氧化氢)的抗氧化潜力)
鲁米诺的混合物(60毫升之一 )-AAPH(10毫米),甘氨酸缓冲50 mM pH值:9.40,保存在冰和黑暗,preincubated 37°c .混合物倒入试管的聚苯乙烯(Clinicon)和放置在一个光度计(BioOrbit 1250年,芬兰)保持在37岁°c当光发射达到稳态条件,10 L(等离子体或标准(Trolox)补充道。发光是绘制时间。诱导时间(tsample)是化学发光强度等同于所需的时间达到一个水平等于40%的强度测量样本之外(前18]。发光的猝灭被记录在Kipp & Zonen BD 111记录器。这个测量的变异系数是4,04%。

收紧(铁/降低抗氧化能力)
减少在低pH值的铁tripyridyltriazine (FeIII-TPTZ)复杂的亚铁形式,通过电子基抗氧化剂(19]。样本混合物的孵化TPTZ FeCl3和醋酸缓冲(1:1:10)5分钟37岁°在593 nm C和量化。这个测量的变异系数是2,5%。

2.4.2。维生素E (α生育酚),β胡萝卜素、番茄红素

脂溶性抗氧化剂浓度测定高效液相色谱法与电化学检测(20.]。血浆样品用甲醇沉淀并提取己烷和离心机。有机相是干,残渣再溶解在甲醇:乙醇。一个权力平等主义的阶段执行反向色谱使用Supelcosil 8列,LiClO和20毫米4甲醇:H2O(97.5: 2.5)作为流动相。电化学检测的测量电流的BAS LC4C检测器(分析系统公司,印第安纳州西拉斐特市,美国)是使用一个+ 0.6 V的应用潜力。维生素E的变异系数为1 8%β胡萝卜素是9,3%,番茄红素是8,2%。

2.4.3。抗坏血酸

决定是由一个方法基于减少由抗坏血酸氯化铁与亚铁离子结果量化,添加2 - 4 -,6-tripyridyl-s-triazine [21]。肝素化血浆样本与三氯乙酸沉淀。管是离心机在20800克,持续30秒。上层清液的整除与TPTZ和FeCl孵化3在醋酸缓冲5分钟25°在595 nm C和量化。这个测量的变异系数是3,4%。

2.4.4。谷胱甘肽

红细胞谷胱甘肽
红血球细胞溶解和沉淀加上高氯酸0.28新鲜血液实际上与澳洲牧牛犬。上层清液的整除,中和K3PO4 1.75米,与磷酸盐缓冲剂孵化0.1毫米(EDTA 1毫米)和5.5′-dithiobis (2-nitrobenzoic酸)0.5毫米(柠檬酸钠1% p / v) 7分钟25°在412纳米(C和量化22]。

降低红细胞Gluthatione
这些细胞被冲洗3毫升的冰冷PBS的四倍。收集细胞被稀释在磷酸缓冲包含diethylenetriaminepentaacetic酸1.34毫米pH值7.8。一个整除derivatized的N -乙腈(1-pyrenyl)马来酰亚胺1.0毫米。解决方案是在室温下培养5分钟,然后用盐酸酸化,pH值2.5。一个权力平等主义的阶段执行反向色谱使用Supelcosil C-18列和65%乙腈:35% H2啊,1毫升/升醋酸,1毫升/升O-phosphoric酸作为流动相。荧光分光光度计探测器(Darznstadt Merck-Hitachi f - 1000年,德国)是用于检测 330海里, 375海里(23]。

2.4.5。TBARS

该方法是基于加合物的形成TBA-MDA (2: 1)。血浆样品,稍后通知溶液(0.67% /氢氧化钠0.05 n),和50%柠檬酸溶液被放置在这个顺序为螺旋帽试管和孵化,享年90岁°C 45分钟。水相量化在532海里。TBARS原生质的微摩尔的表达水平相当于MDA (24]。

2.4.6。金属羰基合物

血浆蛋白质样本的反应与dinitrophenylhydrazine然后吸附ELISA板的井,一夜之间在4°C,在探索商业protein-conjugated DNP)引起的抗体。biotin-conjugated主要抗体(anti-DNP多克隆免疫球蛋白)然后反应streptavidin-conjugated辣根过氧化物酶与三甲量化。酸性停止的解决方案是添加,吸光度测量在450海里。该方法校准使用氧化和减少白蛋白(25]。这个测量的变异系数是16,2%。

2.4.7。蛋氨酸亚砜

蛋白质蛋氨酸亚砜含量是衡量HPLC-fluorometric检测,使用一个修改的方法,摩根等等。(26),表示为总蛋氨酸氧化蛋氨酸亚砜的分数:蛋白质从10 L等离子整除与60沉淀 L冰冷的乙腈和离心20分钟10000克;蛋白质颗粒水解使用甲磺酸为150°C 90分钟derivatized o-phthaldialdehyde /β巯基乙醇溶液。Derivatized HPLC-fluorescence氨基酸检测的分光光度计检测器(Merck-Hitachi f - 1000), 340海里, 455海里,量化使用标准含蛋氨酸,蛋氨酸亚砜和蛋氨酸砜。分析是由反相高效液相色谱使用协同4 融合列连续梯度的流动相75毫米醋酸钠缓冲pH值4.5:甲醇:四氢呋喃(80:19:1)初始(20:80:0)最后,在40分钟。这个测量的变异系数为9.2%。

2.5。统计分析

沿着时间的变化为不同的氧化应激标志物与线性混合效应模型进行了分析。此外,测量在脓毒性休克患者在每个时间点都比正常的价值观从健康的匹配对象t以及独立样本(样本表现出正态分布)。严重程度之间的相关性参数和氧化应激标记是用皮尔森。线性混合效应模型,调整按性别和年龄,也用于确认参数和氧化应激严重程度之间的关系。结果表示为均值±SD, 被认为是显著的。proc混合使用的SAS统计项目进行分析。

3所示。结果

共有21个病人实现包含/排除标准进行了研究。所有感染性休克患者平均年龄为60±20年,APACHE II和沙发在录取分数 分别和11±4.2。感染性休克的主要原因是呼吸道和腹部。只有4个患者死亡(19%)。病人的人口统计特征总结表1。

表1
病人的特点。
3.1。氧化损伤

在承认,所有感染性休克患者脂质和蛋白质氧化损伤的证据,提出测量通过羰基或蛋氨酸亚砜(图1)。TBARS水平增加了双重的承认而正常价值和增加进一步进化的第一个星期期间( )(图1(一))。3个月、TBARS各级标准化在感染性休克的幸存者。在蛋白质氧化损伤也出席。羰基增加4.5倍,蛋氨酸亚砜2.1倍比正常的值(数据1 (b)和1 (c))。之后,两个标记倾向于减少进化的第一个星期期间( 两个),然而他们没有达到正常水平,甚至三个月后。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图1
氧化损伤的演化脓毒性休克患者(a) lipoperoxidation (TBARS)、羰基(b)和(c)蛋氨酸亚砜。正常的值(平均数±标准差)获得匹配的健康受试者连续和虚线所示。p:反映了变化时间计算线性混合效应模型。*显示正常的价值观和病人之间的显著差异在不同的时间点(t以及独立样本)。
3.2。抗氧化活性
3.2.1之上。总抗氧化能力(TAC)

TAC的陷阱是正常入学,第一天(354±123和361±50 EqTlx正常的值),但降低后第三天(246±110 EqTlx, )。在三个月内,陷阱水平下降(279±48 EqTlx, )。TAC水平衡量收紧提升在入学(1656±498和1120±47 EqFe2 +对于正常的值, ),在整个研究期间增加。

3.2.2。个人抗氧化剂

维生素C、β-胡萝卜素和番茄红素水平明显下降,承认并继续逐步减少在进化的第一个星期( )(图2(一个)维生素C)。相比之下,维生素E水平保持正常的时间点(图2 (b))。在3个月,维生素C和番茄红素水平恢复正常,但尚未β-胡萝卜素。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图2
进化所有感染性休克患者的抗氧化水平(a)维生素C,维生素E (b)(α-生育酚)和(C)减少和氧化谷胱甘肽。正常的值(平均数±标准差)获得匹配的健康受试者连续和虚线所示。p:反映了变化时间计算线性混合效应模型。*显示正常的价值观和病人之间的显著差异在不同的时间点(t以及独立样本)。

谷胱甘肽水平降低是正常入学,但24小时后下降,在进化的第一个星期( )。相反,总红细胞谷胱甘肽含量增加三倍在入学和显著增加在进化的第一个星期( )。在3个月,这两个参数值(图恢复正常2 (c))。

尿酸水平增加录取( 与5±0.5 mg / dL正常的价值观, ),但第一周内逐步值恢复到正常。胆红素水平也增加录取( 与 mg / dL正常的价值观, ),在演化过程中并没有改变。尿酸水平之间的正相关和陷阱和收紧水平观察(r:0.83和0.47,分别地。 )(图3bilirrubin水平和收紧水平(之间),也r:0.75, 收紧, )。


图3
相关峰的收紧和陷阱的水平峰值尿酸水平。 对相关性暴露出来。
3.3。氧化应激和严重程度的分数

沿着在幸存者沙发上得分显著降低,主要是由于快速减少心血管和呼吸道的组成部分沙发的分数。病人去世了更高水平的APACHE II和沙发在录取分数峰值和乳酸的水平也会升高峰值剂量的血管活性的药物( 对于所有)。c反应蛋白(CRP)水平升高在录取( mg / dL和 对于正常的值, )和在脓毒性休克进化有所下降,但仍持续升高在第七天。在3个月的水平是正常的。

3.4。在入学

入学沙发的正相关与收紧(图4)、维生素C和尿酸入学水平观察(r:0.63,r:0.48,r职责:0.48, 对于所有)。APACHEⅱ评分与收紧,陷阱,β-胡萝卜素,尿酸入学水平(r:0.5,r:0.6,r:0.5,r职责:0.56, 对于所有),而乳酸水平与收紧(图的承认4)和胆红素入学水平(r:0.48和0.64, 两个)。观察氧化(PaO之间负相关2/ FiO2比)和收紧,陷阱,维生素C,在入学和尿酸水平(r:−0.44,r:−0.68,r:−0.58,r职责:−0.48, 对于所有)。之间没有明显的相关性观察脂质或蛋白质氧化损伤和疾病的严重程度入学。


图4
承认相关性的沙发分数峰值和峰值乳酸水平与收紧峰值水平。 暴露的相关性。
3.5。在冲击的进化

TBARS最高水平表现出正相关,沙发分数峰值和峰值乳酸水平(r:0.52,r:0.46, )(图5(一个))。TBARS峰值也呈正相关,峰值收紧(r:0.57, )。之间没有关联或关联观察蛋白质氧化损伤和抗氧化剂消费或疾病严重程度在入学和脓毒性休克时进化。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
进化相关性的沙发分数峰值和峰值乳酸水平(a)峰TBARS水平和(b)峰收紧的水平。 所有暴露的相关性。

峰沙发得分也与收紧的最高水平(图5 (b))、陷阱、胆红素、和维生素C水平(r:0.82,r:0.82,r:0.6,r职责:0.56, 对于所有)。APACHEⅱ评分与峰值水平的收紧,陷阱,尿酸,维生素C水平(r:0.67,r:0.66,r:0.45,r职责:0.6, 对于所有)。乳酸峰值水平与收紧(图5 (b))和胆红素最高水平(r:0.66,r:0.65, 两个)。所有上面提到的相关性被确认为积极的关联线性混合效应模型。

4所示。讨论

我们的研究前瞻性评价抗氧化剂和氧化损伤标记的时间剖面在进化的第一个星期的脓毒性休克和与严重程度的相关性。我们发现的证据在蛋白质和脂质氧化损伤与早期严重的维生素C,β胡萝卜素、番茄红素和减少谷胱甘肽耗竭,但不是与TAC或维生素E水平降低有关。早期活性氧的生产已经被记载在内毒素模型(14),临床研究也发现,危重病患者已有证据表明氧化应激在入学2,7- - - - - -9,27,28]。因此,氧化损伤是一个系统性炎症反应的早期现象,包括脓毒性休克,甚至发生败血症的病人到达之前重症监护单位。这个概念可能部分解释为什么干预措施已被证明是有效的防止氧化(29日)可能不是有效的回复已经建立了氧化损伤在ICU的设置。

我们还发现lipoperoxidation沿着时间增加。这可能是一个初始的结果侮辱,最有可能缺血性,紧随其后的是一个独立的延续过程,可以解释为lipoperoxidation级联的催化性质,通过持续的免疫激活,通过连续的再灌注,或不足或无效的抗氧化作用。蛋白质氧化损伤,相比之下,显著减少长时间与沙发的降低分数。减少水平的蛋白质氧化损伤之前描述(30.]因为我们表达蛋白质氧化标记作为血浆蛋白总量的比例,羰基和蛋氨酸亚砜水平的变化不应受到全身蛋白质的变化在我们的研究中,可能真正反映蛋白质氧化损伤是最大的在腐败过程的早期。

Lipoperoxidation呈正相关感染性休克严重程度和器官功能障碍估计沙发,表明氧化损伤可能multiorgan发展的障碍。最近,Motoyama等等。(8在众位病人还发现,更高水平的TBARS在入学和时间与multiorgan衰竭(MOF)的发展。相比之下,我们并没有发现任何重要的蛋白质氧化损伤和脓毒性休克严重程度之间的相关性在任何时间点。因为描述了几个关键的蛋白质部分或完全灭活活性氧的作用在脓毒症,建议在蛋白质氧化损伤可能参与脓毒症(31日,32),可能是羰基和蛋氨酸亚砜,尽管敏感标记的蛋白质损伤(33,34),不能反映真正的氧化应激在关键的蛋白质和酶的影响。

TAC水平表现出不同的动力学以及时间根据使用的方法来估计。这些差异可以解释观察血清TAC的个人贡献者的水平,中呈现的不同比例根据方法估计TAC。尤其是在感染性休克,陷阱水平深受尿酸水平(r:0.83),解释标记沿着时间的平行的减少。相比之下,收紧不依赖尿酸水平,但也可能受到胆红素和其他nonidentified化合物,这或许可以解释收紧的增加水平入学,在研究期间35]。这两个参数,陷阱和收紧和他们的主要贡献者,尿酸、胆红素与脓毒性休克严重程度呈正相关。先前的研究已经表明,TAC水平可能更高更严重形式的脓毒症(15,35,36]。特别是,海拔的尿酸在脓毒症可以解释为增加尿酸生产与激活Xantine氧化酶(XO)在缺血性领土在脓毒症和脓毒性休克(2]。

维生素C含量低于正常价值在研究期间,可能解释为正在进行的消费。尽管我们将观察更大的消费最严重的病人,我们发现相反的;更严重的败血症的患者有更高的维生素C的水平。我们推测,低消费的维生素C中观察到的最严重的患者可能是由于更大的可用性的其他非酶的抗氧化剂在这些患者中,也就是说,尿酸、胆红素,两者都可以作为有效的抗氧化剂在等离子体37,38]。有趣的是,即使最严重的病人表现出更高的TAC和维生素C的水平,这些也呈正相关峰值TBARS表明lipoperoxidation可能发生尽管正常甚至增加抗氧化能力。

在3个月,在脓毒性休克幸存者lipoperoxidation规范化水平,而蛋白质氧化标记仍然居高不下。持续的海拔羰基和蛋氨酸亚砜是难以解释的。持续的氧化压力不太可能因为c反应蛋白水平正常三个月,在家和大多数患者已经做得很好。蛋白质周转缓慢将解释说,3个月不足以达到正常水平这些标记(34]。这一发现表明,这些指标可以作为标记的氧化应激情况。

我们的研究的一个限制是排除一些病人也重病,死前48小时内,从病房的病人,慢性肾功能衰竭患者。这些病人可能呈现出不同的antioxidant-oxidative场景。然而,在研究期间,连续从所有感染性休克病人承认我们单位只有5被排除在外。这些排除标准可能部分解释了19%的死亡率,这是低于预测从沙发和APACHE II评分。我们的报告感染性休克死亡率为33% (17]。

5。结论

我们的研究显示早期和持续的氧化应激在感染性休克,反映在非酶的抗氧化损伤和脂质和蛋白质表观消费。在入院早期蛋白质氧化达到高峰,但lipoperoxidation继续增加在进化的第一天。更严重的患者表现出更高水平的lipoperoxidation也更高水平的总抗氧化能力、尿酸、胆红素、和维生素c,我们首次展示了蛋氨酸亚砜水平是脓毒性休克患者的增加,因此,可以作为敏感标记的蛋白质氧化在脓毒症。