文摘
背景。通过toll样受体细胞信号通常会导致在类风湿性关节炎(RA)滑膜炎症。我们旨在评估TLR2和TLR4刺激对促炎细胞因子的影响生产的外周血单核细胞(PBMCs)最近研究RA患者,骨关节病(OA)和健康的控制(HC)。方法。PBMCs与LPS刺激,实验和细胞因子组合。细胞因子进行了分析与ELISA上层清液。toll样受体信使rna的表达在白细胞使用实时qPCR进行了分析。结果。PBMCs RA患者自发地产生更少的il - 6和TNF比细胞OA和HC科目。有限合伙人增加了所有组的细胞因子的生产。在RA患者增加戏剧性(30 31-fold 48-fold和17,各自的细胞因子)相比,中度(2到8番)在其他组。LPS诱导15-HETE代PBMCs RA(平均251%)和OA患者(平均43%),尽管只在OA组,增加是很有意义的。TLR2和TLR4基因表达降低细胞因子组合,而有限合伙人增强TLR2表达式在HC和沮丧的OA患者TLR4的表达。结论。从最近研究RA患者overresponsive PBMCs与细菌脂多糖刺激。TLR表达式是不同监管在健康和关节炎的科目。
1。介绍
类风湿性关节炎(RA)是一种复杂的疾病的发病机制不明。几个因素已经被提议作为潜在的触发与风湿性关节炎风湿性关节炎相关的炎症反应,包括微生物及其产品(1,2]。产品的入侵微生物可能通过toll样受体激活炎症细胞(通常),导致免疫和炎症反应。通常激活与类风湿性关节炎的发病机理和TLR-2和地都是潜在的重要受体在炎症性周期的起始及延续关节炎(3]。也已经表明,内生TLR4配体(例如,热休克蛋白和额外的域纤连蛋白)是高度表达的类风湿性关节炎患者的关节4- - - - - -6]。toll样受体存在于组织synoviocytes还外周血单核细胞,被雇来的炎症和参与滑膜炎症的发病机制(7- - - - - -10]。最近的研究描述的高表达TLR4强直性脊柱炎患者的白细胞和增加TLR2和TLR4受体的表达在OA软骨病变发生表明异常TLR信号也可能参与了疾病的发病机制条件以外的类风湿性关节炎(11,12]。
il - 6和TNFα以及il - 1家族细胞因子和趋化因子显著升高风湿性关节炎患者滑液和滑液膜,但不是在OA患者(13- - - - - -15]。此外,在自发的il - 1 RA患者血清,6,8,-18年,TNFα产量明显高于健康个体和anti-TNFα治疗减少本地和系统性TLR2和TLR4受体的表达16,17]。
早期的研究证明,从RA患者外周血单核细胞产生更多的炎性细胞因子和趋化因子,尽管新发病患者之间的差异,建立了类风湿性关节炎不能清楚地确定(18- - - - - -21]。
我们旨在评估toll样受体2和4的影响刺激生产的炎性细胞因子和代15-HETE PBMCs从新诊断RA患者相比,骨关节病的患者和健康对照组。此外,我们试图确定以何种方式的刺激通常(在我们的实验以TLR4刺激)对白细胞表面可能会影响toll样受体的表达自己在mRNA水平。最后,我们研究了影响白细胞的刺激强烈的促炎细胞因子的表达TLR2和TLR4在mRNA水平。
2。方法
2.1。病人
20一个受试者招募了研究,其中包括7类风湿性关节炎(RA)患者,7例骨关节病(OA)和7健康控制(HC)科目。RA和OA诊断根据美国风湿病学院指南(22]。严重类风湿性关节炎的评估采用复合28-joint疾病活动得分(DAS28)。虽然没有黄金标准的评估RA活动存在,DAS28分数一直采用欧洲风湿病专家作为日常实践工具(23,24]。DAS28评分提供了一种数值指标,分数> 5.1意味着高疾病活动,得分< 3.2意味着低疾病活动,和得分< 2.6表明缓解。RA患者新诊断和之前没有收到疾病修饰治疗风湿病的药物(DMARDs)纳入到研究和提供温和的疾病活动根据DAS28(平均指数±标准差;4,31±1、32)。额外的参数用于病人的临床特征包括anti-cyclic citrullinated肽抗体(aCCPs)以及血清c反应蛋白(CRP)浓度测量。血清aCCP存在早期RA的一个标志。他们是更具体的比射频作为诊断工具,被认为是一个很好的预测严重腐蚀的疾病(25]。CRP升高是最有用的指数被特定的急性期反应,敏感,迅速增长在6到10小时后炎症过程的启动(26]。
aCCPs RA患者中发现,没有一个病人没有RA。血清中c反应蛋白(CRP)浓度的增加在RA与OA患者。对照组由年轻健康的志愿者。病人的临床特征是呈现在表1。
所有参与者把他们的书面同意后充分了解研究的目的,这是以前当地生物伦理委员会批准的罗兹的医科大学。
2.2。外周血单核细胞的纯化
每个病人血液样本(27毫升)收集的外周静脉穿刺。外周血单核细胞被离心纯化histopaque - 1077(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)。简而言之,外周血与磷酸盐缓冲盐水稀释并仔细分层到histopaque - 1077和离心机在400 g在室温下30分钟。不透明的接口是洗了三次,终于resuspended 10的密度6rpmi - 1640细胞/毫升介质(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)补充10%热灭活胎牛血清(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)、抗生素(青霉素、链霉素)和抗真菌的(amphothericin B)解决方案(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)。
2.3。细胞刺激
PBMCs被孵化与LPS浓度的10和100 ng / mL,实验(BGN)浓度的0.1,1,10 ng / mL和细胞因子组合(包括10 ng / mL的il - 1、10 ng / mL il - 6,和100 ng / mL TNFα)24小时。离心后,上清液被收集并分析il - 6和TNFα用ELISA试剂盒(Bender MedSystems Inc .,伯林盖姆,加州,美国。
2.4。RNA隔离和反转录
总RNA从白细胞分离使用总RNA迷你包(授权生物技术、格丁尼亚、波兰)按照制造商的指示。总rna被转换为互补DNA(互补)通过随机启动M-MLV逆转录酶(美国威斯康星州麦迪逊Promega)。反转录后,cDNA存储20.°C进行进一步分析。
2.5。定量实时聚合酶链反应
使用ABI棱镜7000序列执行定量实时PCR检测系统(美国应用生物系统公司,加州福斯特城)。我们使用iTaq SYBR绿色Supermix火箭(Bio-Rad实验室,Inc .,赫拉克勒斯,加利福尼亚州,美国)按照制造商的建议。总之,反应进行了20l包含1l cDNA、10l 2SYBR绿色supermix,每个特定的引物的200海里。95年的循环参数3分钟°C 45变性的周期95紧随其后°C 15秒和60退火/扩展°C为45秒。相对量化的n阶微分表达式计算方法。每个目标基因的扩增(TLR2和TLR4)是标准化的β肌动蛋白(管家基因)。放大产品检查正确的大小通过琼脂糖凝胶电泳。特定的引物用于TLR2、TLR4和β肌动蛋白放大被Gutierrez-Canas前面描述的et al。27)和它们的序列如下:TLR2 5′GGA AGA ATC CTC CAA柠檬酸GGC 3′;TLR2反义5′结论CTG TGA GCC CTG gg GA 3′;TLR4感觉5′AGC CAC GCA TTC ACA GGG 3′;TLR4反义5′猫GGC TGG手枪CAG AGT CC 3′;β肌动蛋白有5′AGA gg ATT有条件现金援助ATG TGG GCG 3′;β肌动蛋白反义5′猫GTC GTC CCA GTT GGT广汽3′。
3所示。结果
3.1。PBMCs il - 6生产的响应与LPS刺激和实验
Nonstimulated PBMCs RA患者表现出显著降低生产il - 6与OA患者低(中值48倍)和对照组低(中值45倍(表)2)。与LPS刺激,TLR4受体的激动剂,导致显著增加在所有3组il - 6生产。然而,在细胞的RA患者,增加戏剧性(平均30、48和44折叠/基线后1,10,100 ng / mL的有限合伙人,resp)。相比只有温和(2到4折)增加从OA患者或健康受试者中观察到的细胞(图1)。
孵化的细胞实验,TLR2受体的激动剂,导致小而无意义的il - 6生产增加RA患者(毕竟实验浓度)和AO病人(只有在实验1 ng / mL)。在健康受试者,微不足道的增加后观察2浓度最高,和小减少(22%)被发现在实验浓度最低。
3.2。肿瘤坏死因子αPBMCs生产的响应与LPS刺激和实验
Nonstimulated PBMCs RA患者肿瘤坏死因子生成明显减少α相比OA患者(平均少12倍)和对照组(表(意味着少10倍)3)。孵化与LPS诱导肿瘤坏死因子的增加α生产3组。然而,同样的il - 6、TNF的增加α生产后被更强烈的有限合伙人在10和100 ng / mL(分别地。,31日和29日folds over the baseline) as compared to that observed in cells from patients with OA (mean 3 to 8 folds increase for different LPS concentrations) or healthy subjects (mean 4- to 7-fold increase for different LPS concentrations) (Figure2)。与实验刺激诱导肿瘤坏死因子的显著增加α生产只有在PBMCs健康受试者的反应浓度最高。
3.3。PBMCs 15-HETE生成的响应与LPS刺激和实验
15-HETE生成,如果PBMCs细胞来自RA和OA患者类似。与LPS刺激增加15-HETE代5 RA患者(27 - 320%范围),同时减少2例(32%和34%,resp)。在OA患者,LPS诱导显著(15-HETE)增产(平均增加43%;范围(图20 - 175%)3)。与实验并不影响孵化15-HETE一代。
3.4。细胞因子和有限合伙人在PBMCs TLR2和TLR4基因表达
在nonstimulated TLR2 mRNA的表达,细胞因子mix-stimulated,或者在RA LPS刺激细胞相似,OA和HC科目(表4(a))。意味着在nonstimulated地mRNA的表达以及在有限合伙人或cytokine-mix刺激细胞在RA和OA患者相似,尽管两组,但明显低于HC的细胞。
孵化与细胞因子组合倾向于减少TLR2和TLR4表达虽然减少重大的TLR4受体在OA患者和HC对象(表4(b))。TLR2基因表达显著增加了有限合伙人在健康对照组,而显著抑制LPS后观察TL4 mRNA表达中细胞OA患者。
4所示。讨论
本研究旨在调查的意义通常和他们的刺激对发展的贡献一个慢性炎症过程出现在类风湿性关节炎患者。我们已经表明,最新发现的RA患者外周血单核细胞自发生成的小得多的大量的白细胞介素- 6和TNFα比单核细胞从OA患者或健康受试者和与LPS刺激导致显著更高的类风湿关节炎患者细胞因子在细胞生产的增加与OA患者。Low-basal细胞因子的生产是一个意想不到的发现,因为这两个细胞因子被认为扮演了一个重要的角色在RA关节炎症的发病机制;肿瘤坏死因子α和il - 6可能刺激胶原酶的生产,增加骨吸收和抑制软骨再生成纤维细胞,破骨细胞和软骨细胞28,29日]。因此,先前的研究表明血清浓度增加和增强代两种细胞因子由RA患者单核细胞(17- - - - - -21]。低基线循环单核细胞的细胞因子产量可能解释为我们研究发现早期RA患者;可能在这个阶段的疾病、细胞细胞因子生产了高潜力的炎症(滑膜),只有不活跃的末梢循环中是可用的。最引人注目的观察是一个戏剧性的差异之间的反应和脂多糖刺激单核细胞从RA和OA和健康对照组。尽管OA患者和健康对照组LPS诱导显著增加(2-7-fold)生产的细胞因子、单核细胞的增加RA患者显著:17日至31日为TNF折叠α对il - 6和30至48折叠。这些观察表明,从早期检测RA患者单核细胞,尽管有低基准细胞因子生成细胞因子的生产证明高潜力与LPS刺激后。有限合伙人被认为通过特定的TLR4受体激活细胞触发一个复杂的信号级联导致炎症介质的释放可能导致滑膜炎症的发展。之前它已经被证明TLR2和TLR4配体增强细胞因子表达在风湿性关节炎患者滑液巨噬细胞和从OA患者诱导软骨细胞的分解反应12,30.]。我们的观察是符合公认的TLR4受体的作用在风湿性关节炎炎症反应的发展,表明即使在最新发现的患者和没有药物治疗RA,循环炎症细胞(单核细胞)可以很容易地通过TLR4刺激触发生成促炎细胞因子。
15-HETE是花生四烯酸代谢物生成reticulocyte-type B synoviocytes人类风湿性关节炎与潜在的调节对炎症的影响(31日,32]。我们首次展示了TLR4的刺激而不是由单核细胞TLR2受体增加代15-HETE RA和OA患者。虽然有限合伙人不断增加15-HETE代细胞7 7 OA患者中,7例患者中4例RA,增强15-HETE代有限合伙人要高得多。进一步的研究需要阐明的潜在作用TLR4-triggered 15-HETE代RA和OA的发病机理。
高响应性单核细胞从RA对象有限合伙人从OA主题和健康对照组细胞相比可以解释为增加TLR4受体的表达在细胞表面。toll样受体表达增加synoviocytes源自风湿性炎症已经报道的网站(33,34]。然而,信息通常在外周血单核细胞表达不一致,研究使用cytofluorometry检测TLR2和TLR4蛋白质或rt - pcr检测受体转录报道结果变量(29日,30.]。
在这项研究中,我们使用了定量实时PCR技术驴在单核细胞TLR2和TLR4表达。表达这两个类型的通常是调查nonstimulated细胞以及刺激的条件下。我们选择LPS-a TLR4 agonist-and混合的有效的促炎细胞因子作为兴奋剂我们实验的一部分。尽管TLR2基因的表达水平没有明显不同的三组中,细胞TLR4 mRNA的表达明显减少RA和OA患者比健康对照组。然而,这些数据的解释必须谨慎,因为信使rna分离白细胞总人口及其测量可能不反映在单核细胞受体表达,主要是有针对性的toll样受体激动剂。此外,最近的研究证明离解的mRNA的表达toll样受体TLR-mediated调制的响应,这表明非受体表达因素可能是负责增加RA的响应性单核细胞TLR配体(26,35]。rt - pcr技术允许我们分析TLR mRNA表达与细胞因子组合在回应刺激(摘要意思,TNFα和il - 6)和有限合伙人。而细胞因子组合倾向于减少所有组的toll样受体基因表达研究,有限合伙人有更多的变量影响:增强观察TLR2受体在健康对照组显著萧条TLR4表达在骨关节炎患者注意到。这些观察确认toll样受体激动剂与内源性细胞因子可能调节toll样受体的表达在白细胞和表明,这种调制可能不同细胞来自患者不同形式的风湿病病理或从健康的人。
总之,我们的研究表明外周血单核细胞的一个重要overresponsiveness最近诊断类风湿性关节炎患者与细菌刺激产品,脂多糖。监管TLR表达的细胞因子和toll样受体激动剂可能在健康受试者和arthritides患者不同。
承认
这项研究是支持的研究资助。3从波兰研究委员会PO5B 12225。