Cell-Type-Dependent甲状腺激素对神经胶质瘤肿瘤细胞株的影响

文摘

目的。本研究调查长期T3的潜在影响治疗神经胶质瘤肿瘤细胞系。甲状腺激素作用在细胞生长、分化和生存在开发过程中可能的治疗相关性方法和结果1321 n1细胞系,星形细胞瘤的II级,U87MG,胶质母细胞瘤等级IV,暴露2和4天在介质中剥夺T3和包含1 nM T3。T3提升re-differentiation细胞系。然而,T3细胞增殖增加1321 n1(2天),拒绝之后(4天),而在U87MG导致抑制细胞增殖。在分子水平上,增加2.9折TR的表达α1受体在U87MG与1321 n1,P< 0.05。TRβ1受体是无法觉察的。这些变化与T3-induced激酶信号激活的不同的模式;T3没有影响ERK活化两种细胞系但显著增加phospho-Akt水平1321 n1。结论。总之,T3 re-differentiate胶质瘤肿瘤细胞,而其对细胞增殖的影响似乎依赖于类型的肿瘤细胞与恶性肿瘤的T3更敏感。TRα1受体可能,至少部分,涉及此响应。

1。介绍

现在认识到,甲状腺激素(TH)可能有重要作用的发病和进展疾病由于其监管措施在细胞分化、增殖和生存(1]。实验和临床研究提供了越来越多的证据表明TH信号可能改变心脏衰竭的重要生理和治疗结果(2]。同样,改变在信号一直在观察恶性肿瘤(3,4),甲状腺功能减退是显示增强肿瘤的侵袭性和转移发展(5,6]。此外,在1896年,甲状腺素(马甲状腺提取)是第一个成功的激素产品用于对暴发性的乳腺癌[7]。类似的结果之后的一系列报道1954年乳腺癌患者(8]。然而,直到现在,TH作为癌症治疗的潜力尚未充分探讨。

神经胶质瘤是最常见的原发性脑瘤和癌症的最积极的。神经胶质瘤通常在一年内复发患者的早期诊断(9]。虽然神经外科切除、放射和化疗提供明显的好处,预后仍令人失望。TH神经胶质瘤患者显示较低水平但这个响应的相关性疾病的病理生理学基本上仍未知(10]。然而,最近的实验研究提供证据表明,急性,短期TH治疗可能会增加细胞增殖和生存通过nongenomic行动11- - - - - -13]。相比之下,长期TH治疗似乎抑制细胞增殖在神经母细胞瘤细胞5]。在此基础上的证据,在目前的研究中,我们进一步探讨了长期T3对神经胶质瘤的影响与肿瘤侵犯的程度和潜在甲状腺激素核受体(TR)表达的改变可能描述不同类型的神经胶质瘤细胞系。这个问题虽然没有以前的临床和治疗相关性解决。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

1321 n1细胞系,星形细胞瘤的II级,U87MG,胶质母细胞瘤等级IV,被用于这项研究。神经胶质瘤细胞系U87MG得到来自美国文化类型集合(写明ATCC)(马纳萨斯,弗吉尼亚州)和神经胶质瘤细胞株1321 n1是来自欧洲的细胞培养(ECACC)(英国威尔特郡索尔兹伯里)。细胞系都保持在150厘米²细胞培养瓶(康宁)。U87MG是维护在鹰的必不可少的最低介质(MEM)与厄尔的盐补充10%胎牛血清(GIBCO), 1毫米丙酮酸钠、青霉素和链霉素(5% v / v)、0.1毫米不重要的氨基酸,2毫米谷酰胺,两性霉素B (5% v / v)。

1321 n1是维护在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)与葡萄糖和碳酸氢钠补充10%的边后卫,2毫米谷酰胺,两性霉素B青霉素和链霉素5%,和5%。

细胞系都保持在37°C湿润孵化器有限公司为5%₂。对所有实验中,每一个神经胶质瘤细胞系使用段落20 - 30之间。一旦细胞汇合的70 - 80%,他们使胰蛋白酶化使用1 x胰蛋白酶。细胞定居24 h剥夺中(使用木炭的边后卫,GIBCO)启动前的治疗。细胞培养48 h和96 h在剥夺了介质只在剥夺(参与)或介质1海里的T3是补充道。

2.2。细胞形态

细胞形态是用来评估细胞分化。细胞被固定在,之前认为倒置光学显微镜光学配备相衬。五个随机领域,每个都包含不超过50个细胞,在每个检查,和细胞的总数以及扩展的总数大于两个胞体直径的长度都被记录下来。每组数据来自大约100个细胞。细胞形态学不能可靠地评估在96 h由于超过80% confluency摘要细胞。

2.3。细胞增殖

为了测量细胞增殖,BrdU标记试剂(RPN20设备,通用电气医疗集团,皮斯卡塔韦,NJ)被添加到培养基中。细胞培养30分钟,然后用4%多聚甲醛固定15分钟。主要抗体(anti-BrdU单克隆抗体稀释1:100)在室温下是申请1 h。样本与PBS洗3×5分钟。二次抗体(过氧化物酶anti-mouse IgG2a)在室温下申请了30分钟,其次是洗3×5分钟。最后,BrdU-immunostained文化可视化使用轻拍照片和数码相机(蔡司Axiovert)连接到一个倒置显微镜光学配备相衬。BrdU-positive核数占总核。扩散数据来自450年到600年之间细胞以每组。

2.4。总细胞数的测量

在2和4天治疗后,细胞与PBS洗两次,100年μL胰蛋白酶0.25%添加到每个盘子和孵化37°C,直到细胞被分离。10%的边后卫在PBS溶液添加到每个板抑制胰蛋白酶的动作。细胞被收获,细胞数量确定后几项在纽鲍尔hematocytometer一定体积。

2.5。细胞凋亡

凋亡细胞核被评估隧道使用原位染色细胞死亡检测设备,根据标准协议根据制造商的指示(罗氏,猫。11 684 795 910)。细胞培养与Hoeschst 33358(5复染色μg / mL),所有的细胞核染色。众所周知,阿霉素诱导细胞凋亡和被用作积极控制为了证明所选择的方法。

2.6。细胞损伤

细胞损伤评估了LDH酶释放在培养介质。培养基收集的实验测量的乳酸脱氢酶(LDH)活性(IU / L)使用酶联免疫试剂盒(Quantichrom LDH装备,dldh - 100,生物测定系统,美国)。进行测量与Tecan Genios系统。在每组LDH释放表达各组的百分比。

2.7。甲状腺激素受体的蛋白质分离和测定

与PBS洗两次后,这些细胞被刮到400年μL裂解缓冲包含20毫米玫瑰,pH值7.9,10毫米氯化钾,1毫米EDTA、10%甘油、0.2% NP-40,德勤0.5毫米,0.5毫米PMSF, 5μg / mL抑肽酶和5μ克/毫升亮抑酶肽。少量的总溶解产物一直和其余离心机在12000 g在4°C为1分钟。核部分准备的再悬浮颗粒在缓冲区包含20 mM玫瑰,pH值7.9,0.42 M氯化钠,MgCl EDTA 0.2毫米,1.5毫米₂德勤,25%的甘油,0.5毫米,0.5毫米PMSF, 5μg / mL抑肽酶和5μg / mL亮抑酶肽和孵化搅拌1小时在4°C离心10分钟12000 g。收集得到的上层清液,用于蛋白质分析的核分数。BCA蛋白质浓度测定的试验方法。煮5分钟后(4% SDS、巯基乙醇2%和0.004%溴酚蓝),15的数量μg蛋白核或总分数在7.5% sds - page分离使用Bio-Rad Mini-Protean胶装置。西方墨点法,蛋白质被转移electrophoretically硝化纤维素膜(Hybond ECL)在100 V和4°C, 1.5 h使用Towbin缓冲区。免疫印迹后,过滤器被探测与特定的抗体TRα1 (Abcam兔多克隆TRα1、ab53729稀释1:1000年,o在4°C / n)和TRβ1(亲和Bioreagents ma1 - 216,稀释1:1000年,o在4°C / n)。过滤器与适当的anti-mouse孵化(Amersham)或anti-rabbit(细胞信号)合二次抗体。免疫反应性被发现使用Lumiglo增强化学发光试剂(新英格兰生物学实验室)。化学发光是图像分析系统检测到的FluorChem HD2(αInnotech公司,14743年,卡特琳娜街,圣莱安德罗,CA)配备了CCD相机和分析软件。每组5个样本被装载在同一凝胶。朱红色染色是为了规范化的轻微变化蛋白质加载。

2.8。测定激酶信号激活

探讨了过滤器与特定的抗体。膜与总蛋白提取被封锁在TBS-Tween 60分钟5%脱脂牛奶,然后探讨了特定的抗体总和phospho-ERK(细胞信号技术,稀释1:1000)和总phospho-Akt(细胞信号技术,稀释1:1000),在一夜之间在4°C。过滤器与适当的孵化anti-rabbit合二次抗体(细胞信号,1:4000年,1 h保留时间),和免疫反应性检测到使用Lumiglo增强化学发光试剂(新英格兰生物学实验室)。免疫印迹是量化使用FluorChem HD2系统(αInnotech公司,14743年,卡特琳娜街,圣莱安德罗,CA)。得到的数据每组样品。

2.9。统计数据

值意味着(S.E.M.)。数据分析和单因素方差分析方差分析跨组织。一个未配对的独立样本t以及执行或非参数Mann-Whitney测试,合适。一个双尾检验值小于0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。细胞形态

T3诱导细胞再分化两个细胞系研究显示的数量显著增加perisomatal丝状伪足探明。因此,1321年n1细胞总数的比率预测细胞总数是1.04(0.14)摘要和1.9(0.11)在T3处理,。U87-MG细胞,总数的比率预测细胞总数是1.16(0.14)参与和1.83(0.19)在T3处理,。(图1)。

3.2。细胞增殖

在1321 n1细胞培养,两天,BrdU-immunostained细胞核被发现是23.6%(3)摘要在T3和30.5%(3)治疗,。在4天,细胞增殖是摘要(5)45.2%和40%(6)在T3处理,(图2)。

在U87MG细胞培养2天,BrdU-immunostained细胞核是48%(5)在T3的参与和23.6%(4)治疗,。此外,4天后,细胞增殖是36.5%(6)在T3的摘要和16.3%(4)治疗,。(图2)。

3.3。LDH释放和细胞凋亡

没有观察到变化LDH释放1321年n1或U87MG细胞培养(图2)。细胞凋亡没有检测到1321年n1或U87MG细胞(数据未显示)。

3.4。总细胞数

在1321 n1细胞培养,两天,发现总细胞数为207183(2145)摘要与232366(2390)在T3处理,。在4天,总细胞数是381105(4100)摘要与372433(2595)在T3处理,(图2)。

在U87MG细胞培养2天,发现总细胞数为211300(2078)186166年非治疗与T3处理(3122),。此外,4天后,总细胞数是396866(5791)摘要与331133(11652)在T3处理,(图2)。

3.5。甲状腺激素受体表达

增加2.9倍TR的表达α1受体在1321 n1 U87MG细胞相比,。TRβ1受体在两个细胞系(图中无法3)。

3.6。Phospho-Akt和Phospho-ERK T3治疗后

在两天,p44的比例和1321年第42页phospho-ERK总ERK n1细胞增加了2.0倍T3-treated文化(摘要细胞相比)。此外,phospho-Akt Akt总比被发现是1.4高T3处理细胞摘要细胞相比,。在4天,没有差异的比值p44和第42页phospho-ERK总ERK和phospho-Akt总Akt观察两组之间(图4)。

U87MG细胞,没有差异的比值p44和第42页phospho-ERK总ERK和phospho-Akt总Akt观察两组之间(图2或4天5)。

4所示。讨论

现在认识到,有着重要的监管行动超出了细胞代谢。TH至关重要的细胞分化,增殖和生存在开发期间,后来在成年生活可能再生/修复行动在病理条件下(14- - - - - -16]。这种独特的效应可能是癌症治疗的治疗价值17]。因此,在目前的研究中,我们探讨了TH治疗对细胞分化的影响,扩散,使用两种不同的神经胶质瘤细胞系和生存,1321 n1,星形细胞瘤二级,和胶质母细胞瘤U87MG等级IV细胞系。T3使用介质的浓度1海里在生理浓度和附近的范围是为了抑制细胞增殖在神经母细胞瘤细胞5]。这种治疗导致了两个细胞系细胞再分化研究的形态变化和神经突perisomatal丝状伪足的人数显著增加。这一发现是依照先前的报道显示转换T3在神经母细胞瘤细胞的影响5]。一系列的神经母细胞瘤细胞分化相关基因被证明为响应TH (18]。TH的注意,这种独特的效应也被证明在其他肿瘤细胞和可能的生理和治疗相关性(19]。

我们的研究进一步表明,这两个细胞系回应不同的TH治疗至于细胞增殖与更积极的肿瘤细胞更敏感。因此,在1321 n1, T3治疗导致细胞增殖增加两天拒绝之后,尽管T3没有对细胞损伤的影响。相比之下,U87MG细胞系,T3显著抑制细胞增殖不增加细胞损伤。这cell-type-dependent行动的潜在潜在机制的TH细胞增殖并没有完全理解。长期TH影响通过甲状腺激素受体介导(TRs)。TRs转录因子调节重要基因与细胞分化有关,扩散,和生存17]。现在认识到,TRs在病理条件下改变有重要的生理后果。因此,我们曾表明,TRs可以改变后的心肌缺血性心肌细胞暴露于增长的压力或刺激(20.,21]。同样,有越来越多的证据表明,改变在TRs是常见的癌症发生的事件4]。在这些证据的基础上,我们探讨是否改变了TR表达这两个细胞系可能构成微分T3对细胞增殖的影响。有趣的是,TRα1被发现在U87MG细胞系相比1321 n1, TRβ1受体在两种细胞系中无法检测。这一发现可能表明TR的潜在含义α1在T3受体作用对神经胶质瘤细胞肿瘤。事实上,几行证据支持这一观点。TRα1受体具有独特的双模式的功能取决于甲状腺激素的可用性。因此,TRα1在其unliganded状态(aporeceptor)而不是活动施加高压或诱导影响T3诱导或压制性基因的转录招聘辅阻遏物与组蛋白脱乙酰酶复合物22]。这是重要的生理相关性与TR在开发过程中α1在早期胚胎阶段中TH低,导致细胞增殖和下降之后随着TH的兴起导致细胞分化[1]。这胎儿的TR模式α1表达再度出现,在病理条件下,可能导致病理性肥大(20.,21)或促进细胞癌症扩散(5]。添加TH阻止病理性心肌肥大的发展(14和抑制肿瘤细胞增殖5]。综上所述,这些数据显示TR的一个重要的角色α1在神经胶质瘤细胞侵犯和响应TH。然而,这个问题值得进一步研究。

我们的研究进一步探讨是否TR的微分表达式α1有一个影响经济增长的活化激酶(ERK和Akt)引起的信号激活T3治疗。这些瀑布是肿瘤生长的重要监管机构和癌细胞的生存23- - - - - -25]。Akt和ERK都活跃在神经胶质瘤和与肿瘤侵犯有关26- - - - - -29日]。有趣的是,目前的研究表明,T3可以显著提高p-Akt水平在1321 n1和U87MG细胞系而没有影响ERK激活的细胞系。这是在与急性nongenomic T3对U87MG细胞系的影响,所涉及的激活ERK级联(12]。

总之,T3 redifferentiate胶质瘤肿瘤细胞。然而,T3对细胞增殖的影响似乎依赖于类型的肿瘤细胞与恶性肿瘤的甲状腺激素治疗更敏感。TRα1受体可能,至少部分,涉及此响应。

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