自然获得的抗体对合成的疟疾抗原AS202.11产生反应

摘要

背景。疟疾疫苗开发的一个主要挑战是鉴定保护性表位和各自的保护性免疫应答。客观的。研究自然获得免疫球蛋白G (IgG)对合成肽AS202.11(一种疟疾疫苗候选)的反应。方法。这项以社区为基础的横断面研究招募了320名1岁及以上的参与者。通过访谈记录人口统计信息。检测恶性疟原虫采用镜检、疟疾快速诊断试验和聚合酶链反应进行感染。ELISA法检测IgG抗体。数据采用STATA进行分析。结果。AS202.11 IgG血清阳性率为78.8% (73.9)- - - - - -82.9)。血清阳性率按年龄分类为≤12岁[74.3%(67.4-80.2)]、13-40岁[85.3%(76.5-91.1)]、>40岁[82.6%(68.7-91.1)]。与≤12岁组相比，其他各组的aORs为2.22 (1.14-4.32)， ， 1.87 (0.81-4.35)， ，对于13 - 40岁的人群和>40岁的人群。13 - 40岁组比≤12岁组有更多的血清阳性者。结论。我们报道了field引起的IgG对AS202.11的高度识别恶性疟原虫表明其与本地菌株非常相似恶性疟原虫抗原和作为未来疟疾疫苗候选肽的可能适用性。

1.介绍

控制疟疾感染的努力主要以蚊虫病媒控制为基础，其中包括使用驱虫蚊帐和室内残留喷洒，以及使用抗疟药物进行治疗，主要是以青蒿素为基础的联合疗法。尽管作出了所有这些努力，疟疾仍然是发病率和死亡率的主要原因。在非洲主要疟疾病媒以及青蒿素衍生物中，对杀虫剂的耐药性迅速发展和蔓延[1- - - - - -5这就证明了加强努力开发对抗疟疾的替代性新药和疫苗的理由。

疟疾疫苗开发的早期工作主要侧重于寄生虫的preerythrocytic阶段，进入人体红细胞，但最大的挑战一直未能确定与保护疟疾相关的特异性免疫应答之前。众所周知的是对症疟疾是由血液阶段寄生物血症引起的，在人类中该获取的保护性免疫的主要靶向血液阶段抗原[6,7]。这为开发基于血期寄生虫抗原的疫苗提供了强有力的理由[6]。目前，最主要的候选血期抗原是位于裂殖子表面或顶端细胞器内的裂殖子蛋白，超过30种恶性疟原虫疟疾候选疫苗正处于晚期临床前或临床评估阶段[8- - - - - -11];然而，只有红细胞前期杂交重组蛋白疫苗RTS, S/AS01完成了3期评估。主要障碍之一是难以识别保护性表位和理解保护性免疫反应的性质和靶点[6]。这是合理的，因此，更多的研究应针对发展中的血液阶段疫苗。

在寻找抗疟疾保护性免疫的表位的过程中，科学家们已经开发出许多与寄生虫抗原密切相关的合成肽，用于开发未来的疟疾疫苗。α(α)疟疾抗原中的螺旋状螺旋基，如MSP3和MSP6，是重要的寡聚化亚基和疟疾保护性抗体的靶点[12]。什么时候α-螺旋螺旋结构从整个蛋白质中分离出来，它们很容易折叠成同样稳定的低聚体结构[13]。合成肽AS202.11（QLEEKTKQYNDLQNNMKTIKEQNEHLKNKFQSMGK)，已在其他地方详细描述[14,15),是一个α螺旋盘绕的主题。先前关于抗体对该肽反应的研究表明，在肯尼亚和西非的Kilifi地区的儿童中，该肽与临床疟疾风险降低有一定的相关性[9,11,16]。目前的研究评估了自然获得的IgG抗体反应的程度恶性疟原虫在坦桑尼亚疟疾高传播位点识别合成肽AS202.11，并对研究社区中不同年龄组的个体进行血清阳性检测。

2.方法

2.1。研究设计，研究地点，和人口

目前的研究是以社区为基础的横断面研究。该研究于2016年3月至12月在坦桑尼亚东北部Tanga地区的Bondo和Kwamgwe村庄进行，该地区距离达累斯萨拉姆约300公里，沿达累斯萨拉姆-阿鲁沙公路进行。该研究地点有稳定和常年的疟疾传播，虽然多数病例恶性疟原虫感染发生在一年中的长雨(3 - 6月)和短雨(10 - 11月)之后。它离Moshi-Dar es Salaam高速公路7公里。研究区域每年有两个雨季，是疟疾传播的高峰。2016年疟疾患病率为20.5% [17]和每人100个传染性叮咬每年大约昆虫接种率（EIR）（未发表数据）。该地区位于309米的海拔，5°22'60''N和38°34'60''E，根据2012年的人口普查坦桑尼亚，其中大部分是农民（国家统计局的7970人口，2013年）。这项研究是嵌套在被设计为IgG抗体的子类的保护作用和变化的市场动态评估一个更大的研究中恶性疟原虫关于加强大学建设计划(第二阶段)和医学教育伙伴关系倡议(MEPI)下的临床疟疾发病率。该研究招募了320名1岁及以上的参与者，他们都是研究地区的居民。研究地点选择方便，而参与者是从100个随机选择的家庭中随机挑选的。这些家庭的成员被要求前往病房研究卫生机构进行样本收集。一份简短的问卷被用来从参与者那里获得人口统计信息。

2.2。实验室程序和分析

用于疟疾显微镜的厚的和薄的血液涂片按其他地方所述制备[17]。Briefly, a blood sample of 0.5–1 mL was taken by venipuncture from all consenting participants and about 10 ul of whole blood was subjected to rapid diagnostic test for malaria diagnosis (SD BIOLINE Malaria Ag P. f/Pan). Children under the age of 5 who were found to be malaria positive by rapid diagnostic test were immediately treated with antimalarial according to national and WHO guidelines. Remaining whole blood was centrifuged at 700 ×g for 5 min to obtain plasma which was stored at −20°C till when serological (enzyme linked immunosorbent assay) test was performed. Adults with fever and positive by MRDT were treated with Artemether-Lumefantrine (ALu), the first-line antimalarial drug in Tanzania.

2.3。酶联免疫吸附试验(ELISA)

采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测AS202.11的免疫球蛋白G (IgG)。简单地说，96孔平底微滴板(MaxisorpNunc, Roskilde, Denmark)在4℃下用纯化his-tag生产的重组AS202.11抗原(0.5 g/ml)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释过夜。在pH值为7.4和0.1% Tween-20的条件下，用3%的脱脂奶粉-磷酸盐缓冲盐将板封住1小时。将检测样本的血浆稀释至1:200，而阳性和阴性对照样本(一抗)在稀释缓冲液(含1%奶粉和0.1% Tween-20的PBS)中稀释至1:50。一百微升被重复地加到盘子里。板块被孵化在室温下摇臂平台上一个小时,然后100 uL peroxidase-conjugated山羊反人类免疫球蛋白,稀释至1:8000年,增加了各自的井和孵化在室温下在暗处一小时30分钟。在以上步骤之间用洗涤缓冲液(含0.1% Tween-20和0.5 M NaCl的PBS)洗涤4次，用过氧化物酶标记的山羊抗人抗体孵育6次。结合的二抗通过50染色定量μl的准备使用TMB(3,3 '， 5,5 ' -四甲基联苯胺)，在室温下黑暗中孵育20分钟。加50使反应停止μ取l = 0.2 M H2SO4，在450 nm处用ELISA读板器(BioRad, Chi, USA)， Gene5软件读板。根据阴性对照计算各板的截止光密度(OD)值。当检测样品的光密度(OD)值大于阴性对照的平均OD +2SD时，判定为阳性;当OD值小于阴性对照的平均OD +2SD时，判定为阴性。

2.4。数据处理和统计分析

使用设计良好的数据抽象形式进行数据收集。收集的数据包括人口统计学、临床和免疫学(IgG to AS202.11)。数据录入Microsoft Excel 2007。数据分析采用Stata 14 (College Station, Texas 77845, USA)。被试年龄分为≤12岁、13-40岁、>40岁三组。采用卡方检验检验比例差异，确定分类变量之间的关系。测定抗as202.11 IgG浓度(OD)与年龄的相关系数。使用Logistic回归来确定与AS202.11 IgG血清阳性独立相关的因素。小动物——一张长有值小于0.05为有统计学意义。

3.结果

共有320名参与者参与了分析，其中210名(65.6%)为女性。其中179人(55.9%)年龄在12岁及以下。320人中252人(78.8%)对AS202.11肽的IgG抗体血清呈阳性。101例(96.2%)疟疾感染是由于恶性疟原虫。疟疾感染测试了320个人，57（17.8％）为阳性用显微镜疟疾，而155（48.4％）为阳性疟疾由MRDT（表1)。

进行IgG浓度与AS202.11 IgG血清阳性率的相关性分析，结果如图所示2。IgG对AS202.11的浓度(光密度)与AS202.11的IgG血清阳性率呈正相关，具有相关系数= 0.031。二元线性回归分析显示，年龄每增加1年，AS202.11 IgG的血清阳性率增加0.0047 (95% CI: 0.0020-0.0080)， 。

测定了不同年龄组研究参与者的AS202.11 IgG血清阳性率(表)2)。AS202.11 IgG总血清阳性率(95% CI)为78.8%(73.9-82.9)。年龄类别的血清阳性率分别为≤12岁74.3%(67.4-80.2)、13-40岁85.3%(76.5-91.1)、>40岁82.6%(68.7-91.1)。

进行回归分析，以确定和定量的IgG血清阳性和与其他变量AS202.11之间的关联（表3.)。以≤12岁的最年轻组作为分析参照组。13-40岁参与者中AS202.11 IgG的未调整或(95% CI)血清阳性率为2.0 (1.04-3.87)， >40岁的OR (95% CI)为1.64 (0.71-3.78)， ，与≤12岁的青少年相比。13-40岁参与者的校正OR (95% CI)为2.22 (1.14-4.32)， ，而40岁>的OR (95% CI)为1.87 (0.81-4.35)， 。未经调整或通过显微镜参与者疟疾正中（95％CI）为AS202.11的IgG抗体阳性为2.62（1.07-6.40）， 与镜检阴性的疟疾患者相比。镜检疟疾阳性参与者的校正或(95% CI)为3.03 (1.23,7.49)， 与镜检阴性的疟疾患者相比。虽然在单变量回归中，体温、MRDT和PCR是AS202.11 IgG血清阳性的有统计学意义的预测因子，但不足以进行多变量logistic回归。≤12岁与>40岁组、13 - 40岁与>40岁组血清阳性率无统计学差异。然而，13 - 40岁组与≤12岁组相比，具有较高的血清阳性者比例。

4.讨论

在本研究中，约四分之三(78.8%)的参与者血清中AS202.11肽IgG抗体总呈阳性。血清阳性率的统计差异分析显示，最年轻(≤12岁)与其他年龄类别有统计学差异;因此，最年轻组的血清阳性率明显低于年长组和整体血清阳性率。中年(13-40岁)和年龄较大(>40岁)的血清整合率无显著差异。这可能解释了疟疾免疫的年龄依赖性发展，这被认为是针对免疫原性较差的保守决定因子的免疫反应的积累[17]。

先前的研究报告了类似的发现，年龄依赖性的IgG抗体的保护作用恶性疟原虫无性血液期抗原[16- - - - - -20.，这很可能代表了持续暴露于在当地人群中循环的许多寄生虫抗原的叠加效应。这一趋势还可能意味着抗疟疾保护性免疫反应成熟缓慢[13]。我们约五分之四当地社区的观察来响应AS202.11肽和老年人的AS202.11肽增加肽特异性抗体水平暗示肽构象上非常相似，那些天然寄生虫蛋白。这是预期的，因为AS202.11肽含有预测的α-螺旋，其折叠成相同的稳定的寡聚体结构的卷曲螺旋结构域分离的天然蛋白片段[14,16]。这也表明了合成肽的能力，以类似的方式引发IgG反应的本地寄生虫蛋白。

我们在这项研究中还表明疟疾阳性的个体比那些没有感染的个体对AS202.11肽的血清阳性率更高。这与Agak和他的同事之前在肯尼亚做的一项研究中报道的结果相似[16]。因为大多数感染是由于恶性疟原虫,血清对AS202.11肽段的阳性反应表明，该肽段与AS202.11肽段非常相似恶性疟原虫抗原。传统上，疟疾疫苗的开发重点是疟原虫不同阶段的各种候选表面抗原[6,16,17,19- - - - - -21]。不幸的是，迄今为止，与预防疟疾有关的免疫反应尚未得到精确的定义。在目前的研究中，我们确定了自然获得的IgG抗体是否能够识别合成的疟疾肽AS202.11，以及以血清亲和力的形式识别的程度，以扩大我们未来可能的疫苗候选分子的范围。我们的研究具有横断面研究的固有局限性，分析的样本量小，可能影响关联的统计效力。然而，我们的发现是有价值的，并提供了重要的线索，关于IgG抗体反应的合成肽作为疟疾疫苗的候选。

5.结论

我们的研究结果表明通过现场引起了高度认可的IgG的AS202.11的恶性疟原虫株。具体地，我们的研究结果已阐明了合成肽AS202.11的识别由天然IgG和相关抗AS202.11 IgG抗体浓度（ODS）和血清阳性之间跨越参与者的年龄。这些疫苗成分的初步和基本属性。这种推断AS202.11肽的进一步鉴定和类型，并以肽作为有力的候选疟疾疫苗的免疫反应保护作用的可能性。

信息披露

丽贝卡拿撒勒和庇护Horumpende分享第一作者。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

本研究由HRSA(美国国立卫生研究院)资助的MRTP资助。T84HA21123-02，道德证号以及丹麦政府的“加强大学建设计划”(BSU-2)。本研究中使用的AS202.11肽由Afro免疫分析联盟(aa -2)捐赠，该联盟由欧盟资助，KCMC作为联盟的合作机构。作者承认这种支持。

参考文献

1. C.五A. EDI，B. G. Koudou，C. M.琼斯D.威特曼和H.兰森，“冈比亚按蚊的蚊子多抗药性，科特迪瓦南部，”新发传染病卷。18，没有。9，第1508至11年，2012。视图:出版商的网站|谷歌学术
2. A. Afonso, P. Hunt, S. Cheesman等人，“疟原虫可以对青蒿素产生稳定的耐药性，但在候选基因atp6(编码肌浆和内质网Ca2+ atp酶)、tctp、mdr1和cg10中缺乏突变。”抗菌药物和化疗第50卷，no。2006年，第480-489页。视图:出版商的网站|谷歌学术
3. E. A. Ashley, M. Dhorda, R. M. Fairhurst等，“青蒿素耐药性在恶性疟原虫疟疾中的传播”，新英格兰医学杂志，第371卷，第411-423页，2014。视图:谷歌学术
4. I. H. Cheeseman, B. A. Miller, S. Nair等，“疟疾青蒿素耐药性的主要基因组区”，科学卷。336，没有。6077，第79-82，2012。视图:出版商的网站|谷歌学术
5. H. Noedl, Y. Se, K. Schaecher, B. L. Smith, D. Socheat, M. M. Fukuda，“柬埔寨西部抗青蒿素疟疾的证据”，新英格兰医学杂志，第359卷，第2619-2620页，2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术
6. J. S. Richards和J. G.比森，《抗疟疾血液期疫苗的未来》，免疫和细胞生物学第87卷，no。5，第377-390页，2009。视图:出版商的网站|谷歌学术
7. D. T. Riglar, D. Richard, D. W. Wilson等，“疟疾寄生虫入侵人类红细胞期间协调事件的超分辨率分析”，细胞宿主和微生物卷。9，第9-20，2011。视图:谷歌学术
8. Y.吴，R. D.埃利斯，D. Shaffer等人，“第1个试验疟疾传播阻断疫苗候选Pfs25和PVS 25相MONTANIDE ISA 51配制，”《公共科学图书馆•综合》第3卷，no。7，文章ID e2636, 2008。视图:出版商的网站|谷歌学术
9. 疟疾快速诊断检测性能，世卫组织疟疾RDTs产品检测结果:第1轮(2008年)，2009年。
10. K.三浦，D. B.凯斯特，O. V.穆拉托娃，J. Sattabongkot，C. A.龙，和A.索尔，“传播阻断由疟疾疫苗候选Pfs25 / Pvs25诱导的活性是抗体滴度的直接和可预测的功能，”疟疾杂志，第6卷，第1号107年,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术
11. K. a . Bojang, P. J. M. Milligan, M. Pinder等，“RTS,S/AS02疟疾疫苗对冈比亚半免疫成年男子恶性疟原虫感染的疗效:一项随机试验”，柳叶刀，第358卷，no。1927-1934, 2001年。视图:出版商的网站|谷歌学术
12. 辛格，索，j.p。生物活性抗体靶向恶性疟原虫MSP3保守区域的鉴定以改进疫苗设计，Mejia等。传染病杂志卷。190，没有。5，第1010-1018，2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术
13. R. S.霍奇斯(R. S. Hodges)著，《设计的新创》(De novo design ofα-螺旋蛋白:医学应用基础研究，"生物化学及细胞生物学第74卷，no。2，第133-154页，1996。视图:出版商的网站|谷歌学术
14. V. Villard, G. W. Agak, G. Frank等，"疟疾候选疫苗的快速鉴定基于α-螺旋盘绕蛋白母题《公共科学图书馆•综合》卷。2，没有。7，文章没有。e645，2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术
15. B. Adu, M. K. Cherif, S. Bosomprah等，"抗GLURP R2、MSP1 block 2 hybrid和AS202.11的抗体水平与高流行(布基纳法索)和低流行(加纳)地区儿童疟疾风险"疟疾杂志第15卷第2期1,货号。123年,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术
16. G. W. Agak, P. Bejon, G. Fegan等人，"肯尼亚沿海地区恶性疟原虫衍生肽对新型血液期抗原免疫反应的纵向分析"疫苗第26卷，no。第16页，1963-1971,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术
17. 《疟疾流行与免疫球蛋白g亚型与恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1-19的相关性》，国际热带疾病与健康杂志，第19卷，第1-13页，2016年。视图:谷歌学术
18. B.阿杜，M. P. G.杰帕森，T.A。Gerds等人，“Fcγ受体3B（FCGR3B-C。233C> A-rs5030738）多态性修改在加纳儿童疟疾特异性抗体的保护作用，”传染病杂志第209卷第1期2，文章ID jit422，第285-289页，2014。视图:出版商的网站|谷歌学术
19. D. Dodoo, M. Theisen, J. A. L. Kurtzhals等人，“天然获得的谷氨酸丰富蛋白质抗体与对恶性疟原虫疟疾的保护有关。”传染病杂志第181卷，不。3，第1202-1205页，2000。视图:出版商的网站|谷歌学术
20. H. A. Giha, T. Staalsoe, D. Dodoo等人，"对不同恶性疟原虫感染的红细胞表面抗原的抗体与保护新型疟疾感染有关，"免疫学的信第71卷，no。2000年，第117-126页。视图:出版商的网站|谷歌学术
21. 《疟疾感染红细胞表面的抗原变异》，微生物学年报，第55卷，第673-707页，2001。视图:出版商的网站|谷歌学术

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