Pituranthos珠兰油作为基于抗氧化剂的辅助疗法对抗顺铂诱导的肾毒性

抽象的

由于顺铂在正常组织中的不良副作用，其治疗效果有限。尽管顺铂有强大的抗肿瘤作用，但它也有相关的附带作用，例如急性肾衰竭。本研究的目的是评估Pituranthos珠兰(PC)精油对顺铂诱导的Balb/c小鼠的毒性作用。采用顺铂急性肾损伤(AKI)标准小鼠模型，腹腔注射顺铂20 mg/kg 1次。小鼠腹腔注射PC(5、10 mg/Kg b.w) 1周。顺铂引起肾功能和肝功能的改变，血清生物标志物(肌酐、谷丙转氨酶和谷草转氨酶)水平的升高证明了这一点。通过降低血清生物标志物水平和减少肝脏和肾脏的DNA损伤，证实了顺铂诱导的毒性显著缓解。PC还恢复了氧化应激标志物和促炎细胞因子IFN-的改变γ.等级。总体而言，本研究首次提供PC可以作为抗氧化剂辅助治疗来施加，以减轻顺铂诱导的肾功能衰竭。

1.介绍

顺铂是临床肿瘤学中越来越感兴趣的选择之一，因为它已经显示出对各种类型癌症的有效性[1］．然而，一些报道显示它有严重的副作用，包括肾毒性、耳毒性、骨髓抑制和胃毒性。特别是顺铂诱导的肾毒性可导致急性肾损伤(AKI)，发生在20-30%的患者[2］．肾毒性主要表现为近管外髓质外部条带的损伤[3.］．顺铂诱导的肾毒性的机制是涉及氧化应激，遗传毒性和炎症的复杂过程。顺铂浓缩在肾小管上皮细胞的水平高于血液中的水平，诱导，因此，肾细胞中的细胞死亡[4.］．此外，顺铂的dna结合活性不是特异性的，可能会对一些非靶细胞产生不利影响[5.］．一些建议的策略已经被实施以减少或防止顺铂的肾毒性。预防顺铂诱导肾毒性的标准方法是在给药前和给药后给予小剂量的顺铂联合充分静脉水化[6.］．通过天然抗氧化剂化合物可以防止肾脏中的顺铂诱导的氧化胁迫。Amifostine是一种细胞保护佐剂，是唯一用于减少顺铂诱导的肾毒性的FDA批准的治疗剂[7.］．然而，由于其副作用、成本和可能干扰顺铂抗肿瘤活性的担忧，氨磷汀的应用受到限制[8.］．相反,天然抗氧化剂已经知道传授保护前提下的潜在抗肿瘤化疗药物副作用,因此,研究筛选潜在的植物化学物质来增强化疗药物的疗效,减少其不良副作用极大的兴趣。北方特有的植物，Pituranthos珠兰（PC），当地名为Guezzah，是一家小型芳香植物。进行了几项研究作品Pituranthos珠兰精油，特别是在其植物化学含量，抗毒性活动[9.]和抗微生物潜力[10］．因此，本研究旨在研究预处理的可能保护作用Pituranthos珠兰关于顺铂诱导的遗传毒性、氧化应激和炎症，在活的有机体内。

2.材料和方法

2.1。化学试剂

顺铂(CP)以顺铂迈兰(Oncotec Pharma production GmbH, Germany)的商标从当地药店购买并腹腔注射。

２.２.动物处理和护理

健康无病原体的BALB/c雄性小鼠(20-22 g)从巴斯德研究所(突尼斯，突尼斯)获得。老鼠被喂食商品颗粒饲料和水自由在实验期间。所有实验均按照国家健康研究所发表的实验动物的照顾和使用指导方针进行。

２.３.剂量的选择

通过一种腹腔注射顺铂（20mg / kg）的顺铂诱导的Aki标准小鼠模型[11］．在顺铂注射之前，通过不同剂量的PC（5或10mg / kg B.）预处理小鼠，并评估了顺铂诱导的毒性的可能减轻。

将三十六只小鼠随机分配到六组（每组六只动物）：(我)第一组(对照组):小鼠腹腔注射PBS，连续10天，不给予任何药物治疗。(2)第二组(pc5mg /kg):腹腔注射pc5mg /kg b.w，连续10 d。（iii）第3组（PC 10 mg / kg）：注射I.P的小鼠。使用PC10 mg / kg b.w.每天10天。（iv）第4组（顺铂控制）：注射了小鼠I.P.每日PBS 10天。在第7天，施用单剂量的顺铂（20mg / kg，i.p.）以诱导肾损伤。（v）第5组:腹腔注射PC 5 mg/kg。第7天给予顺铂单剂(20 mg/kg，静脉滴注)。接着，PC管理持续到第10天。(vi)第6组:腹腔注射。用PC 10 mg / kg b.w.日常。在第7天，给予单剂量的顺铂（20mg / kg，i.p.）。接着，PC管理持续到第10天。

在顺铂注射后72小时处死小鼠。将血液样品收集到EDTA Vacutainers中以进行生物化学分析。彗星测定和不同的测试在相同组动物中进行。

２.４.体重和身体指数的变化

在实验结束时记录每只小鼠的体重，随后确定体重的百分比变化。在处死小鼠之后，取出来自动物的肾脏和脾脏，称重，计算器官重量和动物体重之间的比例。体细胞指数的数据表示为器官重量超过体重的比率。

2.5。肝功能测试（LFT）和肾功能测试（RFT）

评估LFT，检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性的变化。测定肌酐水平以评价肾功能(RFT)。使用临床化学分析仪Cx72 (COBAS)进行生化参数的测定。

2.6。基因毒性测定

碱性彗星试验是按照[12]微小修改。从每个器官获得的细胞悬浮液包含在琼脂糖凝胶中并进行裂解，然后电泳。通过以下等式计算DNA损伤的总分。

总DNA损伤=类中细胞百分比（0）X0 +课程中的细胞百分比（1）X1 +百分比的类别（2）X2课程中的2个百分比（3）X第(4)类细胞的3%X4。

2.7。ELISA

血清肿瘤坏死因子(TNF-α.)水平的测定使用Quantikine ELISA试剂盒(生物供应商研究和诊断产品)，根据制造商的方案。

2.8。氧化应激的生化标记

肾和肝组织用10体积的冰点生理盐水PBS均质，4℃，4000 rpm离心15分钟，上清置于- 80℃保存，用于丙二醛水平、过氧化氢酶活性和SOD活性的测定。

2.9。丙二醛(MDA)含量测定

通过监测肾和肝提取物中丙二醛(MDA)水平的形成来评估脂质过氧化，方法如下[13与修改)。简单地说,50μ.将匀浆的L与三氯乙酸（1mL）和硫酰比脲酸（1mL）混合。加热反应混合物（60分钟。在95℃）中，然后在室温下冷却1小时。冷却后，在532nm处测量粉红色的吸光度。该水平表示为Nmol / mg蛋白。

2.10。超氧化物歧化酶活性分析

在不同器官（肾脏和肝脏）的提取物中测定超氧化物歧化酶（SOD）活性。Nitroblue四唑（NBT）还原用作SOD活性的指示剂[14］．反应混合物由50μ.L肝脏或肾脏，2mM NBT，10mM甲硫氨酸，2.4mM核黄素，末端体积为1.7mL。将反应物进行15分钟并用UV荧光灯照射。然后在560nm下测量吸光度。酶单位定义为抑制50％反应所需的细胞溶质的量。

2.11。骨髓细胞中反应性氧物种水平的测量

从动物血管中骨髓用PBS冲入离心管中。通过以1500rpm离心10分钟通过离心收集细胞。用1×PBS重悬细胞粒料。在氧化荧光探针DCFH-DA的帮助下测量细胞内ROS生产。细胞（5×10^5.)染上10μ.M DCFH-DA，在黑暗中孵育30分钟，使荧光二氯荧光素(DCF)形成，然后使用荧光微板阅读器(Biotek, Winooski, USA)进行分析，其发射波长为538 nm，激励滤波器为485 nm [15］．

2.12。统计分析

通过单向分析（ANOVA）的单向分析评估从每个参数的分析获得的数据。具有重复措施的一般线性模型用于不同的参数。Tukey的测试用于多种比较手段。意义水平设定为P.< 0.05。采用SPSS (v. 18.0)软件进行统计检验。

结果

３.１.PC减轻顺铂引起的体重下降和器官-身体指数变化

为了确定顺铂给药对动物体重的影响，我们在实验结束时监测体重变化。车辆和PC处理的小鼠的重量（图1（a））.然而，顺铂喷射导致平均体重的剧烈损失，达到16％。为了确认顺铂对肾脏和脾脏的有害作用，还研究PC是否对这些器官发出任何保护作用，在实验结束时确定有机族指数。记录了顺铂治疗组中肾脏有机族指数的增加。然而，暴露于顺铂降低了脾脏 - 体细胞指数比率。得到的结果表明，PC以10mg / kg体重的剂量施用这种异常（图1（b）和1（c））.

３．２．PC可减弱顺铂对肝、肾细胞的遗传毒性作用

通过碱性彗星测定法通过碱性彗星测定进行由顺铂和肝细胞中顺铂诱导的遗传毒性的预防。用顺铂治疗的小鼠在肾病和肝细胞中显示出显着的DNA损伤，如总DNA损伤的百分比增加（图2）.用PC处理的动物显示平均DNA损伤的显着降低。

顺铂的遗传毒性与它与DNA上的嘌呤碱基交联的能力有关，从而导致恶性细胞中的DNA损伤[16］．然而，这种作用不是肿瘤特异性的，可能会影响正常细胞。

３．3.PC对肾功能(RFT)和肝功能(LFT)的保护作用

顺铂是一种有效的肾毒性药物。顺铂治疗肾功能损害，如血清肌酐水平的增加所示。顺铂治疗组该生物标志物显着增加了62％。然而，用PC的动物治疗恢复血清肌酐水平以正常值（表1）.

测量丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平以监测宿主中的肝毒性。单独的顺铂蛋白给药后，记录Alt和AST活动的显着增加。然而，与顺铂治疗组相比，伴随治疗显着减轻了ALT和AST活动。这种效果似乎是有关的剂量。

3．4．PC恢复促炎细胞因子IFN-的水平γ.

干扰素 - 伽马（IFN-γ.)是一种细胞因子，在细胞应激和细胞应激相关的病理生理学中起着关键作用[17］．量化IFN-γ.，以研究顺铂治疗组的炎症反应，并阐明PC的合理保护作用。IFN-显示，顺铂可诱导小鼠急性炎症反应γ.等级。PC预处理显着减弱了IFN-水平的增加γ.（ ）与顺铂对照组相比(图3.）.

3．5．PC改善自由基状态

为了证实ROS生成是否负责由顺铂诱导的病理生理学，进行DCF染色。ROS生产在小鼠骨髓细胞中荧光分析。在顺铂施用的动物中，过量的ROS产生是可以对应于大量超氧化物阴离子产生的。

与PC的处理导致ROS生产的显着降低（图4.）.不同剂量的PC单独对ROS积累没有贡献，荧光强度发现与未治疗的动物相当。

3.6。PC处理对氧化应激参数的影响

丙二醛(MDA)是细胞内多不饱和脂肪酸过氧化作用的最终产物之一，被认为是脂质过氧化的重要标志[18］．此外，超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶是保护细胞免受自由基攻击的酶[19］．在目前的研究中，顺铂激发的小鼠显示出显著的( ）MDA水平升高，抗氧化剂SOD和过氧化氢酶活性显著降低( ），与正常组相比。PC干预导致测试剂量下脂质过氧化的显着降低（图5.和6.）.与顺铂处理组相比，PC(5和10 mg/kg b.w.)处理组小鼠肝、肾细胞中SOD和过氧化氢酶水平显著升高。

4。讨论

临床肿瘤学已经越来越多地面对顺铂的生理副作用，尽管它成功地对抗多种形式的癌症[5.］．该药物不是靶向特异性的，并导致对正常细胞，特别是增殖物的遗传毒性作用。鉴于顺铂的经过验证的肾毒性作用，减轻其对正常组织的氧化损伤是涵盖的问题。化疗药物和天然药物的组合策略已经发展，以减少顺铂的副作用[20.］．人们对天然抗氧化剂的兴趣日益浓厚，这对科学界提出了挑战，要求在传统癌症疗法的同时创新配套饮食。

本研究的目的是评估Pituranthos珠兰香精油逆转顺铂诱导AKI模型的恶化[21.］．顺铂治疗导致小鼠体重严重下降，可解释为食欲下降、脱水、消化障碍和肾小管损伤[23.］．

此外，顺铂治疗组的肾体指数和脾体指数均有所改变。急性肾水肿使肾-体指数升高，脾-体指数因脾细胞凋亡而降低[22.］．然而，PC治疗已被证明对这些异常是有效的。顺铂诱导的AKI的特征是肾功能严重下降，血清肌酐水平升高就是证据。此外，血清标志物ALT和AST升高显示肝功能障碍。

顺铂的高遗传毒性效力可能是对次级恶性肿瘤的负责，这些恶性肿瘤在用顺铂治疗的治疗患者中观察到[24.］．在目前的研究中，在肾病和肝细胞的顺铂治疗后，证明了这种致突潜力，支持其遗传毒性的早期证明。我们的数据显示，与对照组相比，CP治疗组总DNA损伤评分显着增加，而PC处理的动物揭示了肝脏和肾细胞中的得分降低。在遗传毒性和氧化应激状态之间证明了强烈的相关性。反应性氧（ROS）触发细胞组分，包括DNA，并破坏它们的结构。因此，ROS参与了顺铂诱导的肾损伤的发病机制[25.］．我们目前的研究表明，顺铂给药抑制抗氧化酶SOD和过氧化氢酶的活性并导致MDA水平的增加。同时，PC治疗恢复了SOD和过氧化氢酶活性，并在肝脏和肾细胞中显着降低MDA。抗氧化剂状态的不平衡可以通过ROS的过度积累来解释。过氧化氢和超氧化物自由基有助于顺铂诱导的毒性。如骨髓细胞中的DCFH-DA染色所示，顺铂暴露导致骨髓细胞中的ROS产生，PC可以减轻该积累。

一些证据支持ROS作为炎症介质的作用[26.］．促炎细胞因子IFN-γ.g是涉及包括肾损伤的各种病理学的脂肪脱胞细胞因子[27.］．Kimura al.2012报道IFN-γ.在顺铂注射液后提高了表达。我们的数据显示出血清细胞因子IFN的水平增加γ.实验小鼠暴露于顺铂，PC治疗成功地抑制了这种异常。从选定的植物中提取的一种精油可以抵消顺铂管理产生的促氧化状态，从而保护治疗过的动物。众所周知，具有抗氧化潜力的植物精油作为药物治疗的辅助疗法已引起人们的兴趣。由于精油的复杂性和可变性，很难将其抗氧化特性与特定的化合物联系起来[6.］．然而，目前的精油的抗氧化特性可以归因于特定的成分，如沙柏烯和柠檬烯，已证实具有抗自由基的潜力[28.］．我们之前的研究证明了PC可以有效地减弱红肉在高氧环境下潜在的促氧化作用。因此，被测试的精油被提名为保证食物保存的合适候选。

5.结论

通过加强氧化地位，小鼠在小鼠中的Cisplatin给药前的PC治疗可以最小化顺铂诱导的肾毒性，遗传毒性和炎症。目前的发现表明PC作为开发顺铂化疗佐剂处理的潜在代理的效率。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

伦理批准

所有实验都是按照美国国家卫生研究所(National Institute of Health, USA)公布的实验室动物护理和使用指南进行的。所有的实验都得到了突尼斯动物伦理委员会的明确批准。

利益冲突

提交人声明他们没有知道可能似乎影响本文报告的工作的竞争竞争金融利益或个人关系。

致谢

作者感谢“Ministère Tunisien de l ' enseignment supérieur et la recherche scientifique”对这项研究的资助。

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