聚乙二醇第八凝血因子的长期安全免疫缺损罗维特裸体老鼠

文摘

Turoctocog阿尔法pegol (N8-GP)是人类重组glycoPEGylated VIII因子治疗血友病a rFVIII的安全性,和聚乙二醇(PEG)的技术,是行之有效的。进行长期毒性研究在动物身上使用人类蛋白质可以复杂禁毒抗体(ADA)的发展。评估长期安全N8-GP, 26岁,52周毒性研究对拥有大鼠进行每四天前静脉注射与0,五十,150,500,或1200 IU /公斤N8-GP。包括临床观察,观察体重、检眼镜检查、血液学、化学、凝血、尿液,毒性动力学、抗体分析和宏观/微观器官检查。免疫组织化学染色法检测了大脑中分配挂钩。没有看到不良的测试item-related发现挂钩并没有检测到大脑中。暴露了~ 75%的动物与500和1200 IU /公斤N8-GP给;高下限的量化生物分析法分析防止暴露在低剂量的确认。少数发达ADAs的动物,和动物生存的比例,直到预定终止> 80%。N8-GP耐受性良好,拥有老鼠证明适合测试人类的长期毒性蛋白免疫原性的动物。

1。介绍

替代疗法与静脉注射plasma-derived交付或重组因子(rFVIII)集中管理血友病a的基石预防性FVIII替代按需治疗是首选,因为它减少了出血的频率,防止长期慢性关节病的发展。目前rFVIII集中与血浆半衰期延长需要静脉注射预防(至少每四天1]。Turoctocog阿尔法pegol (N8-GP,诺和诺德公司/ S, Maløv,丹麦)是一本小说,glycoPEGylated,延长半衰期rFVIII产品开发患者出血的预防和治疗血友病A附件40 kDa的支化聚乙二醇(PEG)的分子rFVIII延长半衰期,提高槽水平的本地FVIII可用来提供安全有效的预防。PEGylation是一种行之有效的制图技术,用于10多个授权产品的循环半衰期延长蛋白质(2]。然而,长期使用40 kDa挂钩的知识是有限的3),和液泡的形成在不同的组织一直在报道前动物聚乙二醇化合物(4- - - - - -7]。

新的治疗药物的临床前安全性评价应该包括repeat-dose毒性研究的六个月的时间在啮齿动物中,根据国际会议上统一技术要求注册药品对人类使用指南(8,9]。人类凝血因子高免疫原性动物,这会导致禁毒抗体(ADAs)的发展。ADAs人类凝血因子可以改变间隙和/或中和的药理效应给凝固因子(10- - - - - -12]。此外,与动物的内源性凝血因子ADAs交叉反应可能导致获得性血友病的动物(13]。这种免疫反应排除了可能性进行慢性毒性研究在正常健康的动物。

为了执行长期接触研究N8-GP没有ADAs的干扰,一个拥有大鼠模型被选中。罗维特裸体鼠(Crl: NIH -Foxn1^rnu)没有胸腺,因此不提高T-cell-dependent对外国蛋白质抗体反应(14]。由于缺乏一种有效的免疫反应,这些动物必须安置在无菌条件下减少暴露于病原体。在正常情况下,罗维特裸体鼠会活在只有四个月,但是当安置在无菌环境中其寿命可能增加到两年(15]。

当前研究的目的是评估的长期毒性N8-GP当管理静脉注射一次第四天罗维特裸大鼠为52周(12周的恢复期)紧随其后。挂钩的免疫组织化学染色法(包含IHC)具体是用来检查挂钩是否出现在脉络丛和被选为主要组织这次调查基于报道脉络丛上皮细胞是40 kDa的目标挂钩分布(4,16,17]。此外,40 kDa挂钩已被证明是与液泡的形成(3,5]。

2。材料和方法

2.1。实验设计

两个长期毒性研究罗维特裸大鼠(Crl: NIH -Foxn1^rnu),符合良好实验室规范,进行了在Envigo,亨廷顿,英国,由诺和诺德公司/ S。制定分析、毒性动力学分析和评估,抗体分析,和包含IHC在诺和诺德公司/ S, Maløv,丹麦。的人生阶段研究进行了2013年4月至2014年8月。第一项研究(以下简称26周的研究)包括一段26周的计量(计量阶段)其次是26周没有管理测试项目评估恢复从任何潜在的不良事件(恢复阶段)。第二项研究(以下简称52周研究)包括一段52周剂量(计量阶段),后跟一个为期12周的恢复阶段。研究设计如表所示1。26周的持续时间被选自这项研究持续时间符合监管要求的慢性毒性研究。52周的持续时间被选中PEGylation相关评估任何潜在的结果,因为这被描述为其他聚乙二醇化合物(5]。剂量水平选择覆盖预期的临床剂量(50 IU /公斤)及其倍数:150(×3),500(×10)和1200 (×24)IU /公斤。生活中实验程序都按照规定英国动物(科学程序)法案1986(行为)在一个合适的项目动物许可证号码。

2.2。N8-GP PEGylation

PEGylation过程(18rFVIII[的]和制备19描述了其他地方。

2.3。动物和住房

罗维特裸体老鼠(Crl: NIH -Foxn1^rnu)是由查尔斯河(美国和德国),剂量≥12天前开始服水土。货到后,所有的动物被随机分配到组单独的性别。以减少感染,动物们被安置在一个隔离啮齿动物设施和消毒的笼子里。此外,他们的饮食是辐照,床上用品,环境浓缩、水消毒。进一步降低感染风险,动物从美国和德国是不居住在一起在同一个笼子里。开始时的剂量、动物的年龄在7 - 11周的时间为26周的研究(男性重216 - 380克,女性156 - 242克);52周的研究分裂到8 - 16个星期岁(男性重221 - 395克,女性159 - 240克)。

2.4。管理测试物质

静脉注射丸进行所有的动物在每一个第四天,左和右尾静脉之间的交替。剂量计算的最近记录体重和体积和剂量范围从1到5毫升/公斤。

2.5。在生活中观察

动物视觉检查疾病的证据或反应测试项至少每天两次nondosing天,每天至少五次剂量天。任何偏离正常当时记录关于性质和严重程度,日期和时间发作,持续时间和观察到的进展状况,适当的。注射部位是每天检查,所有的动物都有至少每周一次的体检。每周体重和食品消费记录。检眼镜检查是执行双目间接检眼镜使用Mydriacyl®(得克萨斯州沃思堡爱尔康实验室,Inc .)、美国)扩张的学生。眼睛检查治疗前在所有的动物研究和定量阶段各主要阶段的最后一个星期动物组1和5。

血液采样毒性动力学评价,抗体分析,从舌下静脉和临床病理学,而动物们使用异氟烷麻醉。尿液收集~ 16个小时,而动物是单独消毒代谢笼住一夜。抽样时间表毒性动力学评价,抗体分析和临床病理学表所示2。

2.6。临床病理学

临床病理学参数临床化学、血液学、凝血和尿液。血液样本的收集临床化学锂肝素管和等离子体是存储在环境温度,直到分析。血液样本为血液学稳定了乙二胺四乙酸(EDTA)和存储在一个环境温度,直到进行了遗传分析。凝固的血液样本是由柠檬酸(3.2%)和稳定也存储在一个环境温度,直到进行了遗传分析。临床化学参数由碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶,肌酐激酶,总胆红素、尿素、肌酐、葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯,钠(Na),钾(K)、氯(Cl)、钙、无机磷、总蛋白和白蛋白。包括血液学比容、血红蛋白浓度、红细胞计数,绝对的网织红细胞计数,意味着细胞血红蛋白,意味着细胞血红蛋白浓度,意味着细胞体积、红细胞分布宽度、白细胞总数、微分白细胞计数和血小板计数。凝固参数包括局部血栓形成质激活时间(aPTT)、凝血酶原时间。收集血液样本~给药后12小时。尿液检查以体积、外观、pH值、比重、葡萄糖、酮、胆红素、蛋白质,Na, K Cl,任何沉淀物是使用显微镜检查。血液学测量使用拜耳ADVIA®120设备(德国西门子医疗GmbH,埃朗根)、凝血分析仪使用ACL™系列(仪器实验室、贝克曼库尔特、迈阿密湖,佛罗里达州,美国),和临床化学使用罗氏P模块化仪器(罗氏诊断北美,印第安纳波利斯,印第安纳州,美国),和尿液进行使用CLINITEK®500 MULTISTIX®(德国西门子医疗GmbH,埃朗根)和罗氏P模块化仪器。

2.7。抗体分析

抗体分析血液样本被前剂量在适当的时候尽量减少药物干扰测定。放射免疫检定法是用来检测anti-N8-GP抗体在柠檬酸盐浆样品在这两项研究。总之,anti-N8-GP抗体在动物样本绑定到放射性标记N8-GP由随机标签酪氨酸残基的i - 125到一个特定的放射性浓度约为15µCi /µg。随后,免疫球蛋白和免疫复合物被绑定到蛋白质G-Sepharose 4,离心沉淀。沉淀的放射性anti-N8-GP抗体的量成正比的样本。样本和兔多克隆抗体免疫球蛋白G(免疫球蛋白),IgM, IgA(内部产品),桥IgG、IgM,和IgA N8-GP G-Sepharose蛋白质,从而确保IgM抗体和IgA的样本也沉淀。一只羊多克隆抗体针对N8-GP VIII因子的部分(产品编号ab20946, Abcam PLC,剑桥,英国)作为一个积极的控制。结果表示为一个百分比的总放射性具结。对于每一个试验,减少点值计算均值+ (t(0.05;1-sided;df)18 SD)血浆样本未经处理的健康罗维特裸体老鼠。这种方法计算对应于大约5%的假阳性样本化验。样品的结果上面剪点值筛选试验中重新分析存在过剩的无标号N8-GP确认anti-N8-GP的特异性抗体(确认试验)。样本-如果筛查结果是小于或等于割点。样品是积极的,如果上面的筛选结果是减少点和确认试验的结果积极实现预定义的标准样品。工作是依照内部部门程序和以前的试验验证。

2.8。生物分析法

单程aPTT-based活动试验(SynthASil,仪器实验室)FVIII-deficient人血浆被用来检测FVIII rat-citrated凝固活动(3.8%)血浆样本。凝血时间计算在浊度变化的速度。商用正常人血浆(批号503231[德国西门子医疗GmbH,马尔堡])与已知FVIII活动被用来形成一个校准曲线,,,未知样本的凝血活性。在这两项研究,量化的下限(LLOQ)被计算为2.50国际单位/毫升+最高测量nondosed内生活动或初始剂量研究样本。质量控制样品组成的N8-GP飙升到FVIII-deficient等离子体包含在所有运行分析。

2.9。毒性动力学和接触

完整的毒性动力学概要文件被第一剂量和在26周后26周的学习和另外52周的52周的研究。概要文件包含9个采样时间点(剂量和0.25之前,1、4、8、12、24、48、96小时后剂量)使用稀疏采样计划。确认连续暴露在整个研究中,血也从三个动物采样每组每4周,给药后4个小时。

血浆浓度时间数据被noncompartmental评估分析在凤凰城WinNonlin®6.2版。构建6.2.0.495 (Pharsight®,圣路易斯,密苏里州,美国)复合意味着数据的概要文件(n每个时间点= 3)。

2.10。尸体剖检和组织学

所有的动物(计划内和计划外死亡)受到详细验尸(即在每个研究。,一个fter the main study and recovery periods of the 26- and 52-week studies), including a full macroscopic evaluation, weighing of organs (scheduled deaths only), and microscopic examination of tissues listed in Table3。动物是被使用二氧化碳窒息和随后的放血的序列允许组间比较。

从每个动物组织,除了睾丸和眼睛,适当固定≥24小时(10%中性缓冲福尔马林)。睾丸和眼睛被固定在修改戴维森的流体和戴维森的液体(20.),分别。大脑,包括脉络丛、处理和评估是否存在先前描述包含IHC挂钩的方法(21]。

在26周的研究中,预定终止给药后阶段进行两到四天之后最后剂量和预定终止后恢复阶段进行最后剂量后26周。在52周的研究中,预定终止给药后阶段进行四到六天之后最后剂量和预定终止后恢复阶段进行12周后最后剂量。

2.11。免疫组织化学

大脑组织(包括脉络膜丛)处理先前描述包含IHC挂钩的存在的方法(21]。

2.12。统计分析

统计分析如前所述[21]。总之,男性和女性分别进行了统计分析,使用单独的动物;例外的是食品消费,笼子里的基础上进行了分析。组平均值,标准偏差,偏差百分比控制计算体重,食品消费、临床病理学参数,和器官重量。以下参数进行统计分析分别在每个时间点比较下列每组与对照组:体重增加和食品消费在适当的学习时间;临床病理学参数;和器官重量。一个1测试是用来分析参数数据,除非只有两组,在这种情况下以及使用。使用一个非参数的数据进行了分析1测试;只有两组,Wilcoxon rank-sum测试使用。对一些临床病理学参数,> 75%的跨组织的数据是相同的,因此使用确切概率法分析。

3所示。结果

3.1。在生活中观察

没有测试item-related观察中发现的人生阶段的研究。相关迹象剂量注射过程被认为在这两项研究的所有组。迹象包括充血、肿胀、红斑,瘀伤,提高地区的尾巴在注射部位出现的。

计划外动物死亡发生在所有组在这两项研究并没有考虑相关测试项目由于分配组和组织病理学结果/死因(表4)。大多数这些计划外的死亡被认为与非特异性炎症过程和感染,因此符合预期结果在一个拥有动物容易受到感染。有11个计划外的死亡26周的研究:在定量阶段八,三个在复苏阶段。有45个计划外死亡52周研究:42在计量阶段和两个在复苏阶段。26周的学习和生存的百分比是95% 83% 52周的研究。

3.2。临床病理学

没有测试item-related副作用明显临床化学或血液学参数,或尿液,26 -或52周的研究。组之间的差异只是观察到与预期缩短的aPTT凝固参数。在26周的研究中,在13周和26日有剂量相关的缩短意味着aPTT剂量在男性,尽管缩短尚不具备统计学意义在两组男性在26周(50 IU /公斤)(表5)。缩短的aPTT也在13周雌性接收1200 IU /公斤,剂量水平的150和500 IU /公斤(尽管这不是统计学意义在这些剂量)。没有响应的雌性在26周。26周的恢复期后,aPTT在雄性和雌性都类似于控制。

在52周的研究中,缩短aPTT在雄性和雌性收到500和1200 IU /公斤,边际缩短的aPTT也发生在周13日,30日,48在雄性和雌性接受150 IU /公斤;统计学意义是实现女性在13周和48(表5)。12周后恢复阶段,意味着aPTT在雄性和雌性以前收到1200 IU /公斤是类似于控制雄性和雌性。

3.3。抗体分析

Anti-N8-GP抗体检测在5 157(3.2%)26周的学习和测试动物183年7(3.8%)测试动物在52周的研究。集团分布anti-N8-GP抗体阳性的动物在给药阶段可以在表中找到6。Anti-N8-GP没有检测到抗体在动物的复苏阶段。

3.4。生物分析法

26日,52周研究LLOQ分别为6.51和6.17国际单位/毫升,分别。LLOQ被定义为2.50国际单位/毫升+最高内生活动在每个测量研究。由于生物多样性最高的测量两个研究不同的活动,这就解释了LLOQ的差异之间的研究。质量控制样品的结果展示了良好的分析精密度和准确度性能研究。总体变异系数在4.37%和7.94%之间,−15.56%和5.36%之间的相对误差。

3.5。毒性动力学和接触

系统性接触N8-GP LLOQ被证实在26周以上组5 (1200 IU /公斤)在13 14雄性动物和10的15雌性动物。动物在四组(500 IU /公斤),暴露了在26周九15雄性动物和四15雌性动物。150 IU /公斤集团几个样本LLOQ上面,而对于50 IU /公斤,所有样本LLOQ以下。500和1200 IU /公斤的剂量水平,增加曝光剂量水平。每月的4小时postdose暴露样本(确认的暴露在不断研究),星期1和星期26之间,0到2 6在三组样品,四到六6个样品在四组,和五到六6 LLOQ以上五组样本。FVIII活动低于LLOQ在所有分析血浆样本控制动物。有一个迹象表明男性比女性更高的曝光在26周的血浆浓度时间曲线下面积(AUC)和AUC(从0到24小时),尽管数据是有限的。

52周的研究中,暴露于N8-GP LLOQ上面增加剂量(等离子体资料,见图1)。系统性风险确认13个15男性和10的15个女性在四组(500 IU /公斤),和14 15男性和15在9个女性在五组(1200 IU /公斤)。为150 IU /公斤剂量组(组三),只偶尔LLOQ以上样本,在50 IU /公斤(两组),所有样本LLOQ以下。暴露剂量增加,从500年到1200 IU /公斤。在每月评估在4小时后剂量(抽样),所有六个样品在两组(50个国际单位/千克),0到2 6个样品在三组(150 IU /公斤),四到六6个样品在四组(500 IU /公斤),6个样品的四到六组五(1200 IU /公斤)在LLOQ之上。有倾向的男性比女性更高的暴露最大血浆浓度和在五组(1200 IU /公斤)和男性43.6国际单位/毫升和453 h在第一天国际单位/毫升,438国际单位/毫升和36.3 h国际单位/毫升在52周,分别,而对于女性和28日国际单位/毫升和292 h在第一天国际单位/毫升,250国际单位/毫升和31.4 h国际单位/毫升在52周,分别。这种趋势并不明显组四(500 IU /公斤)。FVIII活动低于LLOQ分析等离子体控制动物样本,除了一个样本,略高于LLOQ。

3.6。尸体剖检和组织学

没有宏观或微观研究相关测试项N8-GP长达52周的剂量或12周的恢复期后,以前治疗的动物。

3.7。免疫组织化学

挂钩不是在脑组织中发现(包括脉络膜丛)或在大脑中的血液血管在26 -或52周的研究主要研究动物给1200 IU /公斤(图2)。包含IHC没有其他剂量组进行,或在复苏动物,因为缺乏积极包含IHC最高剂量的动物。

4所示。讨论

没有测试item-related不良结果观察到剂量跨越50到1200 IU /公斤每四天在两个26的毒性研究,52周的时间拥有大鼠进行评估的长期影响40 kDa PEGylation人类rFVIII。没有钉在脉络丛使用包含IHC染色,发现没有任何不利的结果在这些研究中,没有观察到的不利影响的水平罗维特裸体老鼠被认为是N8-GP 1200 IU /公斤,每四天前。

拥有罗维特裸体鼠模型已被证明是一个适合长期毒性研究在当前研究和N9-GP[在我们之前的研究21]。虽然这些结果不能直接外推到人类,值得注意的是,一项研究52周期间在鼠模型相当于人类(~ 30年22]。在26 -和52周的研究中,系统性接触N8-GP被证实在500 ~ 75%的动物和1200 IU /公斤。剂量水平较低,没有或只有偶尔LLOQ以上样本在第一天和最后的两个研究。这是由于高LLOQ,造成内源性FVIII活动和基体效应的组合。缺乏系统性接触低剂量组确认没有相关模型。

26周的生存比例较高(95%)较52周研究(83%)。计划外的死亡被观察到的是均匀分布在N8-GP剂量组。没有一个计划外的死亡在当前的研究中被认为是相关的测试项目。过早死亡的动物有感染的迹象,如泌尿生殖和皮肤损伤,符合缺乏免疫系统的功能。这使他们更容易受到感染,预计将在这个大鼠模型。

罗维特裸体老鼠使用因为它的能力受损免疫反应,从而产生ADAs山,可以改变N8-GP的间隙,减少N8-GP曝光。ADAs N8-GP被发现在一些动物研究和剂量组之间均匀分布。有证据表明,在某些T-cell-deficient裸体老鼠,“喜欢”细胞发展随着年龄增加功能(14),这是符合少数动物ADAs在这些研究中发展。然而,由于频率较低且一致的(即之间的研究。,3。2% in the 26-week study and 3.8% in the 52-week study), the model still appears to be a valuable tool when long-term exposure studies without interfering ADA are needed. Thus, based on the high survival rate and limited number of animals developing ADAs, the nude rat animal model appears to be appropriate as a long-term toxicity model and could be considered as an alternative long-term rodent model to test human proteins immunogenic in animals. However, the survival rate and tendency for ADA development in a small percentage of animals should be considered when planning the duration of the study and the number of animals to be included. In addition, compounds with a known effect on the immune system may not be appropriate to test in this model due to the lack of a functional immune system.

凝固分析表明预期缩短的aPTT给男性在26周的研究中,男性和女性在接受500和1200 IU /公斤的52周的研究。这种效果是由于N8-GP的药理作用在这些不良没有考虑动物和发现。支持这个解释宏观和微观病理数据,没有发现被确定,否则表明缩短aPTT的体内效应。缺乏反应在女性26周的26周的研究可以解释postdose采样时间点的差异;临床病理之间的时间剂量和抽样调查两到四天在26周剂量女性后,12小时后剂量相比其他临床病理学调查。男性的倾向更高的风险敞口可能解释更多的雄性与雌性的aPTT显著缩短。

没有毒性端点(临床观察、身体体重增加和食品消费、眼科检查、临床化学、血液学、和尿液)是影响测试项目。

26日至52周后N8-GP剂量每四天,1200 IU /公斤,没有观察到测试item-related液泡的苏木精和伊红——或IHC-stained组织时,在大脑中检测到的和没有挂钩或脉络丛,或在大脑的血液在血管中。与N8-GP目前的研究相比,没有观察到盯住保留,我们之前评估N9-GP的长期毒性研究免疫缺损无胸腺的老鼠显示挂钩的增加存在剂量依赖的相关性在脉络丛上皮细胞在26周,虽然这并没有导致病变或测试item-related液泡的形成在这些细胞(21]。盯住保留两个分子之间的这种差异可能是由于小挂钩单位负载/公斤N8-GP与N9-GP:剂量50 IU /公斤N8-GP对应于一个挂钩的1µ克/公斤(21),而200 IU /公斤N9-GP对应µ克/公斤挂钩(21]。还有两个聚乙二醇FVIII候选人表示治疗血友病,由拜耳和Baxalta。拜耳的湾94 - 9027是一个B-domain-deleted rFVIII特定站点PEGylation,和一个60 kDa支钉(23]。Baxalta的批准Adynovate®(伯灵顿855)是一个长篇rFVIII,共轭20 kDa支钉分子,和基于Advate®(24,25]。尽管长期动物毒理学研究如我们目前的研究没有进行这些蛋白质,28天在老鼠和猴子的研究发现不安全隐患与临床相关的剂量水平的挂钩(23,24]。

无法提供证明低剂量的暴露水平是本研究的限制。然而,考虑到没有测试item-related发现被认为在任何剂量水平和暴露在高剂量水平,证实这种限制影响的整体解释也没人相信。女性的另一个限制是血液采样的时间在26周的26周的研究中,从12个小时被推迟后两到四天最后一次剂量。适当时机的血液抽样最有可能会增加女性aPTT的解释结果的一致性研究。

总之,拥有老鼠被发现一个合适的物种长期毒性研究的52周的持续时间,可以考虑在这种情况下,一个模型是人类长期毒性测试所需的蛋白质发现动物的免疫原性。总的来说,N8-GP是耐受性良好剂量从50到1200 IU /公斤每四天,没有测试item-related发现。挂钩没有观察到在脉络丛,基于测试item-related不良的没有发现标准毒理学评价的端点,没有观察到不利影响水平N8-GP在这些研究中被认为是每四天1200 IU /公斤。这些发现扩展我们的知识N8-GP分子,glycoPEGylation作为制图技术的安全性,和罗维特裸大鼠长期毒性研究的典范。预计延长半衰期FVIII产品,如N8-GP,人类可能修改目前血友病治疗方案,使更少的注入,从而减少治疗相关的负担。

的利益冲突

卡罗琳·e·拉斯穆森Jette诺瓦克,朱莉·m·拉森奶奶Skall索伦森,Wendela A . Kappers和托马斯•Krogh-Meibom Hanne Offenberg诺和诺德公司的雇员/ S。艾玛·摩尔,大卫·贝尔Envigo凯刘赵是员工,进行了研究。

确认

作者要感谢以下人员在临床开发在诺和诺德公司/ S为这项研究:海伦雅各布森从临床项目管理;琼Hummeluhr拉斯穆森调查病理学;从生物分析法和ADME Mette施密特;亨瑞特宅地Boesen和夏洛特Fjordager免疫原性评估;和艾伦·Broadmeadow Envigo。这项研究是由诺和诺德公司/ S, Maløv,丹麦。

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