文摘

肾上腺的毒性是药物开发的一个主要问题。endocrine-active化合物的定量理解影响肾上腺类固醇生成和评估人类肾上腺小说药品毒性,我们开发了一个数学模型,在人类肾上腺皮质癌NCI-H295R类固醇生成细胞。模型包括细胞增殖,细胞内胆固醇易位,扩散运输类固醇,肾上腺类固醇生成的代谢途径,连续涉及steroidogenic蛋白质和酶等明星,CYP11A1, CYP17A1, HSD3B2, CYP21A2, CYP11B1, CYP11B2 HSD17B3, CYP19A1。在实验的动态重构胆固醇和14的类固醇在体外类固醇生成试验使用NCI-H295R细胞。动态灵敏度分析结果表明,HSD3B2中扮演最重要的角色在肾上腺类固醇生成的代谢平衡。基于微分代谢分析12 11肾上腺类固醇激素和有毒化合物,我们可以估计这steroidogenic酶受到影响的数学模型。肾上腺steroidogenic抑制剂,据预测行动网站大约匹配目标酶。因此,我们的计算机辅助系统基于系统生物学方法可能是有用的了解endocrine-active化合物的作用机制和评估人类肾上腺药物毒性的小说。

1。介绍

因为类固醇激素发挥重要作用在一个广泛的生理过程,可能扰乱内分泌的影响是一个主要关注小说发展的药物如依托咪酯和氨鲁米特(1]。肾上腺是最常见的内分泌系统毒性的目标在活的有机体内,因为合成类固醇激素主要是通过酶促反应在肾上腺皮质2- - - - - -5]。事实上,在这些研究基于化学诱导内分泌病变观察在活的有机体内最常见的网站报道,影响肾上腺。因此,人类肾上腺毒性的预测机制的基础上,在药物开发的早期阶段或不相干的行动是很重要的。

NCI-H295R人体肾上腺皮质癌细胞系被用来阐明机制肾上腺steroidogenic干扰化合物(1,6]。H295R细胞系的建立了Gazder和他的同事在1990年(7],它表达了所有关键steroidogenic酶和steroidogenesis-related蛋白(7- - - - - -9]。H295R细胞纬向未分化的人类胎儿肾上腺细胞的生理特点和产生的能力发现成人肾上腺皮质类固醇激素(1,7,9]。在体外生物人类使用H295R细胞系能够评估化学品对类固醇激素的影响生产(10- - - - - -15),steroidogenic酶活性(11,16,17),和steroidogenic基因的表达11,18]。在转录组研究中,许多steroidogenic干扰化合物的作用机制已经定性评估肾上腺毒性。然而,基因表达并不总是反映类固醇激素的生产(19]。此外,测量一些特定的类固醇激素可能不是一个有用的方法来研究steroidogenic干扰效应的机制在复杂肾上腺类固醇生成等途径。系统地了解外源性化合物如何影响肾上腺类固醇生成,同时测定的检测类固醇激素和综合分析这些复杂的数据很重要。作为一个探索性的方法来分析复杂的数据,ToxClust由张先生和他的同事在2009年能够可视化浓度响应关系的特征化学诱导毒性效应(20.]。然而,这种探索性的方法无法提供一个定量的理解肾上腺毒物的作用机制或揭示每个酶反应的影响,系统的信息交互,在肾上腺类固醇生成途径和反馈。

系统生物学的基础上计算模型的生物过程和生物分子的综合测量是最强大的方法来定量地了解每个因素的影响在复杂的生物通路。最近的研究我们的合作者,肾上腺类固醇生成的计算模型已经开发的NCI-H295R细胞,包括steroidogenic扰乱CYP11B1甲吡酮抑制酶促反应的影响(21,22]。肾上腺类固醇生成的模型再现了动态NCI-H295R细胞和甲吡酮的影响。电流计算模型的肾上腺类固醇生成成立oxysterol合成反应的消费作为旁路细胞胆固醇(22]。此外,所有的反应在这个模型的一阶反应动力学方程描述(22]。很难定量评价复杂系统中的每个蛋白质的影响肾上腺类固醇生成使用报告模型,因为它很简单,任何生化和细胞生物信息是不够的。例如,要清楚地了解变化的原因从不同类固醇激素的动态模式,有必要考虑steroidogenic酶的底物抑制因为大多数steroidogenic酶酶底物识别多个类固醇。然而,steroidogenic酶的底物抑制不能所描述的数学模型一阶反应动力学方程的基础上,不考虑米氏常数表达底物的亲和力。steroidogenic干扰化合物的定量估计机制从综合实验数据NCI-H295R肾上腺类固醇生成的细胞,应该改进报道模型根据以下两点。首先,酶反应的动力学方程应该交换从一阶方程的稳态动力学方程基于酶反应的机理。因为数学模型由一阶方程在一个简单的structure-dependent运营方式,它不会显示复杂的行为基于分子相互作用,反馈,或法规。第二,细胞内胆固醇的本地化过程应该合并作为一个相当大的机制。因为细胞内胆固醇分子被存储为胆固醇酯或广泛分布的膜组件,只有少数胆固醇分子本地化的线粒体内膜可用肾上腺类固醇生成途径(23,24]。此外,cholesterol-trafficking过程从外到内线粒体膜,由steroidogenic急性监管监管(StAR)蛋白质,是肾上腺类固醇生成的病原反应步骤之一(24]。通过克服这些限制在报道类固醇生成模型中,系统分析H295R肾上腺类固醇生成的细胞可以定量估计steroidogenic干扰化合物的作用机制。

在目前的研究中,定量估计endocrine-active化合物的毒理学机制在肾上腺类固醇生成和预测人类肾上腺毒性新型药品在药物发现阶段,我们开发了一个新的计算模型NCI-H295R类固醇生成的细胞。它包括胆固醇运输到细胞内的地区从细胞外空间,胆固醇易位系统在细胞内的地区,包括oxysterol合成、肾上腺类固醇生成的代谢途径,和运输的类固醇激素。全局灵敏度分析的肾上腺类固醇生成模型可以评估每个steroidogenic酶和相关蛋白质的影响对于每个类固醇激素中观察到一个在体外类固醇生成NCI-H295R细胞的分析。此外,行动的机制steroidogenic类固醇生成干扰化合物的酶可以估计的优化方法解决逆问题从12类固醇激素的浓度变化来衡量类固醇生成的液相色谱/质谱测定NCI-H295R细胞在体外。使用这个发达的肾上腺类固醇生成模型和分析方法,在体外类固醇生成化验NCI-H295R细胞可以评估人类肾上腺毒性基于量化的一种新颖的制药药物肾上腺类固醇生成其毒理学机制的理解。

2。材料和方法

2.1。实验部分

2.1.1。细胞培养

NCI-H295R人体肾上腺皮质癌细胞从美国购买类型文化集合(猫# crl - 2128,马纳萨斯,弗吉尼亚州)和培养在37°C在湿润的气氛中有5%的公司₂。细胞被维护在一个1:1的混合物杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM, GIBCO,生活技术,卡尔斯巴德,CA)和F-12介质(MP生物医学Inc .,欧文,CA)补充15毫米玫瑰(Dojindo实验室、熊本、日本),0.00625毫克/毫升胰岛素(Sigma-Aldrich, Inc .,圣路易斯,密苏里州),0.00625毫克/毫升转铁蛋白(Sigma-Aldrich Inc .、圣路易斯、钼),30 nM亚硒酸钠(Wako纯化学工业有限公司,日本大阪),1.25毫克/毫升牛血清白蛋白(BSA Sigma-Aldrich Inc .,圣路易斯,密苏里州),0.00535毫克/毫升亚油酸(Sigma-Aldrich Inc .、圣路易斯、钼),2.5%ν血清(Becton, Dickinson和公司,富兰克林湖,新泽西州),100 U /毫升青霉素(明治精华制药、东京、日本),和100 mg / L链霉素(明治精华制药、东京、日本)。

2.1.2。肾上腺类固醇生成人类肾上腺Corticocarcinoma NCI-H295R细胞

NCI-H295R与促肾上腺皮质的细胞被刺激激素(ACTH)、forskolin,血管紧张素ⅱ发起类固醇生成。类固醇浓度随着时间的变化测量刺激后的细胞和培养基建立一个仿真模型。

细胞被播种在6×10⁵细胞/在6-well盘子。经过3天的文化,改变了培养基组成的刺激中DMEM / F-12(1: 1)中补充0.00625毫克/毫升胰岛素,转铁蛋白0.00625毫克/毫升、30 nM亚硒酸钠,1.25毫克/毫升BSA, 0.00535毫克/毫升亚油酸,10%胎牛血清(GIBCO,生活技术,卡尔斯巴德,CA), 100 U /毫升青霉素、100 mg / L链霉素,50 nM ACTH (Sigma-Aldrich Inc .、圣路易斯、钼),20μM forskolin (Sigma-Aldrich Inc .,圣路易斯,密苏里州),和100 nM血管紧张素ⅱ(Calbiochem,默克密理博,达姆施塔特,德国)。培养基和细胞收集(0)8、24、48和72 h后刺激。100年收集细胞μL蒸馏水,用细胞溶解产物。进行了文化在四个井/时间点()。

12浓度的类固醇,孕烯醇酮(怀孕的),17岁α-hydroxypregnenolone (HPREG)、脱氢表雄酮(DHEA)、孕酮(食物),17岁α羟孕酮(HPROG),雄烯二酮(土卫四)、睾酮(服务),11-deoxycorticosterone (DCORTICO) 11-deoxycortisol (DCORT),皮质甾酮(CORTICO)、皮质醇(CORT)和醛固酮(奥尔多),介质和细胞溶解产物由LC / MS测定。浓度的雌激素酮(E1)和17β雌二醇(E2)的酶联免疫吸附试验(Wako纯化学工业有限公司,大阪,日本)。另外,胆固醇的浓度测量使用商业套装(Wako纯化学工业有限公司,日本大阪)基于胆固醇氧化酶的方法。

2.1.3。液相色谱法

一系列LC-VP(日本岛津公司,日本京都)组成的一个SIL-HTc autosampler, LC-10ADvp泵、CTO-10ACvp列烤箱,DGU-14AM脱气器被用来设置反相液相色谱条件。列是一个装饰乐段CD-C18列(100×2毫米身份证。3μm, Imtakt Corp .)、日本京都)用于45°C。流动相包括水/乙腈/甲酸95/5/0.05 (v / v / v,溶剂)和水/乙腈/甲酸35/65/0.05 (v / v / v,溶剂B),梯度洗脱程序是0% B(0 - 1分钟一个权力平等主义的梯度),0 - 40% B与线性梯度)(1 - 2分钟,40% B(2 - 7分钟一个权力平等主义的梯度),40 - 100% B(7 - 12分钟一个线性梯度),100%(12 - 14分钟与一个权力平等主义的梯度),100 - 0% B(14 - 15分钟的一个线性梯度),和0%的B(15 - 16分钟的权力平等主义的梯度)0.3毫升/分钟的流量。autosampler托盘被冷却到45°C和注射量是5μl .高效液相色谱级乙腈和甲酸和光。购买kouichi

2.1.4。质谱分析

三重四极质谱仪API4000(应用生物系统公司/ MDS Sciex,康科德,加拿大)加上一个电喷雾电离源是在正离子模式下操作。优化离子源条件如下:碰撞气体,6 psi;窗帘气体,40 psi的;离子源气体1、50 psi;离子源气体2、80 psi;离子源电压5500 V;离子源温度、600°C。氮作为碰撞气体在多反应监测(MRM)模式。declustering潜在的条件,能量碰撞,碰撞细胞退出潜在的被每一个优化的类固醇。MRM的转换如下:怀孕的317→299 HPREGm / z315→297、脱氢表雄酮m / z289→271,掠夺m / z315→109 HPROGm / z331→109,土卫四m / z287→97 DCORTm / z331→123 DCORTICOm / z347→161 CORTICOm / z347→100、CORTm / z363→309年,奥尔多m / z361→343和服务m / z289→109。质量光谱数据获取和量化使用分析师1.4.2软件包(应用生物系统公司/ MDS Sciex康科德,加拿大)。

2.1.5节讨论。评估细胞的体积

细胞体积估计数量的细胞和细胞的平均直径。细胞脱离井用0.025%胰蛋白酶(MP生物医学,Inc .,欧文,CA)在0.02% EDTA溶液(Dojindo实验室、熊本、日本)preculture开始,开始的刺激,在24日,48和72 h后刺激。细胞的数量和直径测量细胞计数器Vi-cell XR 2.01(贝克曼库尔特,Krefeld,德国)后,台盼蓝染色。细胞数量和细胞的数量的参数估计用指数曲线配合实验时间进程数据。

2.1.6。测试化合物在验证研究

NCI-H295R细胞暴露于七类固醇生成的良好抑制剂,然后培养基中的激素的浓度测量估计酶抑制对仿真模型的性能进行评估。肾上腺steroidogenic抑制剂包括氨鲁米特(AGT、Bachem AG)、Bubendorf、瑞士),o, p′DDD (DDD, Sigma-Aldrich Inc .,圣路易斯,密苏里州),螺内酯(SP, Sigma-Aldrich Inc .,圣路易斯,密苏里州),甲吡酮(MP, Sigma-Aldrich Inc .,圣路易斯,密苏里州),酮康唑(和光纯化学工业KC, kouichi,大阪,日本),咪康唑(和光纯化学工业,MC, kouichi有限公司,大阪,日本),和大豆苷(DZ, Sigma-Aldrich Inc .,圣路易斯,密苏里州)。细胞也暴露于四个肾上腺毒物的肾上腺毒性不是通过类固醇生成抑制介导的。毒物是丙烯腈(和光纯化学工业,kouichi,大阪,日本),盐霉素(SM、Sigma-Aldrich Inc .,圣路易斯,密苏里州),硫鸟嘌呤(TG、东京化工有限公司,东京,日本),和fumaronitrile(和光纯化学工业FN, kouichi,大阪,日本)。和光纯化学物质都溶解在DMSO (kouichi化学工业公司,有限公司,大阪,日本)和添加到培养基1:1000稀释。

2.1.7。验证研究使用肾上腺毒物

NCI-H295R细胞培养3天6-well盘子然后刺激上述化合物。在开始的刺激,各种浓度的测试化学物质被添加到文化。经过3天的文化与化学物质的浓度12类固醇(怀孕的,HPREG脱氢表雄酮,掠夺,HPROG,土卫四,DCORTICO, DCORT, CORTICO, CORT,奥尔多,和服务)的培养基通过LC / MS / MS测定。测试这些化学物质的浓度测定研究细胞毒性分析。96孔板的细胞毒性试验进行了使用细胞ATP含量为端点(CellTiter-Glo™发光细胞生存能力分析,Promega)。浓度导致超过20%的细胞毒性没有类固醇生成试验中使用。测试肾上腺类固醇生成抑制剂和其他化合物的浓度如表所示1。

2.1.8。统计分析

由两个示例韦尔奇的比较以及与Bonferroni多个测试修正每个甾类激素的物种。统计上显著的类固醇激素被认为在调整的值小于0.01。微分代谢类固醇概要文件被分类分层聚类分析。两两之间的距离所有化合物和类固醇被标准化的欧几里得度量计算。这个距离矩阵进行了分析与病房的层次聚类的方法。使用MATLAB软件进行统计分析(MathWorks公司,纳蒂克,MA)。

2.2。计算部分

2.2.1。数学建模NCI-H295R肾上腺类固醇生成的细胞

从人类肾上腺类固醇激素分泌corticocarcinoma NCI-H295R通过C细胞合成的胆固醇₂₁类固醇激素生物合成途径。肾上腺类固醇生成的数学模型NCI-H295R细胞是由胆固醇运输和细胞内定位路径,oxysterol合成途径的绕过类固醇生成,C₂₁类固醇激素生物合成途径为主要类固醇生成途径,被动运输的类固醇激素,细胞增殖(图1)。在这个模型中,两个隔间,细胞内空间和培养基,被合并为可用的地区。方程和参数类固醇激素的细胞增殖和扩散运输提出了先前的研究[21,22]。胆固醇运输和细胞内定位路径包括oxysterol绕过集成ACTH-stimulated皮质醇分泌模型的一部分被Dempsher和他的同事们(47]。C₂₁类固醇激素生物合成途径包括14类固醇激素,怀孕的,HPREG,脱氢表雄酮,掠夺,HPROG,土卫四,服务,DCORTICO, DCORT, CORTICO, CORT,奥尔多,E1, E2,和17由九steroidogenic酶,酶反应催化胆固醇侧链裂解酶(CYP11A1), 17岁α羟化酶(CYP17H), C_17日,20裂合酶(CYP17L) 3β-hydroxysteroid脱氢酶(HSD3B2) 21-hydroxylase (CYP21A2) 11β羟化酶(CYP11B1) 18-hydroxylase (CYP11B2), 17岁β-hydroxysteroid脱氢酶(HSD17B3)和芳香化酶(CYP19A1)。在这个数学模型NCI-H295R肾上腺类固醇生成的细胞,分子运输和酶促反应速率的变化速度steroidogenic酶的定义基于一阶反应和rapid-equilibrium酶动力学,分别。所有的肾上腺类固醇生成的数学模型方程NCI-H295R细胞补充文档中描述网上(见补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/4041827)。速率常数和最大活动被拟合实验时间进程数据估计胆固醇浓度的类固醇。浓度初始值的胆固醇和14类固醇是用于每个实验测量值,每个类固醇浓度被认为是快速达到平衡态之间的培养基和细胞内的空间。所有固定值的静态参数和初始值的变量参数在这个模型被描述在表S1和S2补充文档,分别。

2.2.2。建模与仿真环境

该计算模型的肾上腺类固醇生成NCI-H295R细胞是发达simBio平台是一个通用的环境生物动态仿真和计算模型的发展(48]。常微分方程是通过四阶龙格-库塔方法解决可变时间步。时间步长()是指调整的最大绝对值变化速度或酶反应速率在每个时间点,和时间步的范围从1×10⁻⁵到10⁻²。确认时间步的范围是否合适,计算出的数值误差比某些固定的时间步骤的时间步,下1×10⁻⁸在每一个时间步。持续时间的计算模拟NCI-H295R肾上腺类固醇生成的细胞被设定为72 h。

2.2.3。参数优化

重建实验时间进程模式的胆固醇的浓度和14类固醇在培养基和细胞内的空间,我们优化每个steroidogenic酶的速率常数和最大速度。Levenberg-Marquardt这个参数优化问题是解决方法的非线性最小二乘方法(49- - - - - -51]。优化的目标函数是用作以下距离归一化最小二乘(NLSD): 在哪里是隔间(培养基或细胞内的空间),是分子物种(胆固醇和14类固醇),是时间点(0,8、24、48和72小时),实验测定分子的浓度在室在时间点,模拟分子的浓度在室在时间点,分子的最大浓度吗在室在所有时间点。数据点在定量下限被排除在评价的目标函数。

每个静态模型参数的影响从不同的拟合参数优化计算目标函数使用敏感性分析。

2.2.4。定量评估肾上腺毒物的作用机制

代谢类固醇分析和微分模式肾上腺类固醇激素的化学微扰重构优化的相对活动steroidogenic酶。输入数据的定量的机械分析肾上腺有毒化合物的褶皱变化(比率)测量12类固醇药物暴露引起的浓度为72 h。的两步优化方法采用实数编码遗传算法(RCGA)作为一种全局优化方法定量的机械分析肾上腺有毒化合物。交叉和代变更的操作模式在RCGA用于实数编码合奏交叉(雷克斯)和代沟(JGG) [52- - - - - -55]。RCGA的初始参数,最大的一代,人口规模,选择父个体大小,儿童个人、人口规模和终止标准是1000年,100年,6日,25日分别NLSD 0.1及以下。搜索空间的相对活动steroidogenic酶从1/100到100年。评估每个人的健康,残差平方和的褶皱变化测量12类固醇浓度作为目标函数。非线性最小二乘优化Levenberg-Marquardt方法被用作本地搜索(49- - - - - -51]。估计行为机制的肾上腺有毒化合物,八steroidogenic酶的相对活动(CYP11A1、CYP17H CYP17L, HSD3B2, CYP21A2, CYP11B1, CYP11B2,和HSD17B3)被上述两步优化方法优化。每一个优化计算重复检查的数值稳定性最优参数。

2.2.5。全球动态灵敏度分析

每一个动力学参数计算模型的属性NCI-H295R类固醇生成的细胞被动态灵敏度分析评估。灵敏度()的动力学参数为变量参数是由以下方程: 在可变参数是一种类固醇荷尔蒙的浓度在NCI-H295R细胞的胞质空间。动力学参数的扰动是+ 10% ()。

3所示。结果

3.1。在肾上腺类固醇生成实验数据

3.1.1。肾上腺类固醇生成NCI-H295R细胞和质量平衡

类固醇激素的培养基都显著增加与50 nM ACTH刺激72 h后,20μM forskolin, 100 nM血管紧张素ⅱ(图2(一个))。质量平衡的类固醇生成NCI-H295R细胞:和控制(刺激)条件下的数据所示2 (b)和2 (c),分别。刺激下,这些实验的动力学的净质量不变,和积累胆固醇转化为肾上腺类固醇。

3.1.2。细胞毒性的肾上腺毒物

异常的细胞治疗与每个化合物被表示为一个相对价值的ATP水平控制。效果的,SM TG、FN AGT, DDD, SP, MP, KC, MC, DZ细胞生存能力测定有效在80%的相对ATP水平治疗后7天。一、SM、TG和FN显示细胞毒性超过100,1、10和10μM,分别。AGT、议员和DZ并不影响细胞的生存能力高达100μm . DDD SP、KC和MC感应不到80%的细胞生存能力超过100,50岁,100年,25岁μM,分别。

3.1.3。不同激素肾上腺毒物分析

期间NCI-H295R细胞暴露在每个测试化合物后三天,12类固醇激素的浓度培养基同时衡量LC / MS / MS。所有影响肾上腺类固醇生成化合物的浓度没有明显的细胞毒性进行评估。微分代谢类固醇的11肾上腺有毒化合物分类和利用层次聚类分析(图可视化3)。

四个没有steroidogenic抑制肾上腺毒物,一个,SM, TG、FN,并未改变介质浓度的类固醇激素2倍以上。上述4化合物在每一个条件和7肾上腺steroidogenic抑制剂在低暴露浓度聚集成一个大集群作为nonchange组。7 steroidogenic抑制剂的最大暴露浓度显示特征类固醇概要文件,但是100年μM DZ和10μM SP被归类为一个集群。AGT大大减少怀孕的介质浓度,HPREG,脱氢表雄酮,掠夺,DCORTICO CORTICO,奥尔多100μm . DDD剂量依赖性降低介质浓度的学监,DCORTICO, CORTICO CORT,奥尔多> 10μM和减少怀孕的,HPREG脱氢表雄酮,掠夺,HPROG,土卫四,DCORT 25的最大暴露浓度μm . SP增加怀孕的,HPREG,脱氢表雄酮和食物减少,土卫四,DCORTICO, DCORT, CORTICO,奥尔多,服务在10μm .议员剂量依赖性降低CORTICO、CORT和奥尔多和减少脱氢表雄酮,HPROG,土卫四,服务在100年的最大暴露浓度μm . KC大大减少怀孕的介质浓度,HPREG,脱氢表雄酮,HPROG,土卫四,DCORTICO, DCORT, CORTICO, CORTO,奥尔多,服务在10μm . MC学监的介质浓度增加和减少土卫四,DCORT, CORT,服务在10μm . DZ增加怀孕的,HPREG和脱氢表雄酮和减少土卫四,DCORTICO, DCORT, CORTICO, CORT,奥尔多,服务在100年μM。

3.2。数学建模

3.2.1之上。优化的数学模型,在NCI-H295R细胞肾上腺类固醇生成

NCI-H295R细胞肾上腺类固醇生成的数学模型是优化的几个动力学参数的胆固醇运输、细胞内定位、oxysterol通路,最大速度steroidogenic酶以适应实验时间进程的数据。所有优化动力学参数见表S1在附加文档。优化的数学模型与实验动态重构模式的胆固醇和14类固醇激素在细胞内空间和培养基。健身是0.621761 NLSD值拟合的目标函数。仿真结果和实验数据如图4。

优化计算动力学参数敏感性NLSD值拟合分数和表S1补充文档中所示。高度敏感的参数拟合NLSD分数是提取的九个动力学参数,,,,,,,,,,合适的灵敏度高于3.0。

3.3。验证使用肾上腺毒物

3.3.1。机械的肾上腺毒物分析

影响肾上腺有毒化合物steroidogenic酶定量预测的变化测量介质浓度的比值72 h后12类固醇激素的药物接触使用NCI-H295R细胞肾上腺类固醇生成的数学模型。估计结果的再现性执行测试证实了两次。11的估计影响肾上腺有毒化合物八steroidogenic酶如图5。没有steroidogenic抑制肾上腺有毒化合物,比如vasculotoxic代理(一个,SM、TG和FN),没有估计为目标steroidogenic noncytotoxic条件下酶。每个健身价值低于0.05 NLSD值作为拟合的目标函数(数据5(一个)- - - - - -5 (d))。其他steroidogenic抑制剂(AGT DDD、SP、MP, KC, MC,和DZ)详细描述如下。

3.3.2。AGT

肾上腺类固醇生成的AGT的作用机制是抑制CYP11A1估计,HSD3B2 CYP21A2, CYP11B1 100μ米(估计禁忌是77.0%,78.0%,81.1%,和59.8%,分别地。)(图5 (e))。AGT报道抑制CYP11A1、CYP21A2 CYP11B1, CYP11B2 [6,27- - - - - -30.]。我们的结果与先前的报道是一致的。特别是,CYP11A1 AGT似乎强烈抑制。在我们的研究中,HSD3B2抑制AGT显示通过机械的分析是基于系统生物学方法作为小说AGT的作用机制。抑制的AGT CYP11B2不是估计在我们的研究中。然而,阿尔多的培养基的浓度下降到3.8%的正常刺激条件。抑制的AGT CYP11B2已经证明使用羊肾上腺匀浆以及人类从库兴氏综合征患者肾上腺匀浆30.]。的活动引起18-hydroxylase CYP11B2决心皮质甾酮的转换18-hydroxycorticosterone在前面的研究。关于AGT的效果差异的原因在CYP11B2提出底物抑制,因为CORTICO的细胞内浓度提高了10倍的培养基达到50μm .另一种可能性是可怜的定量实验数据的可靠性,因为阿尔多浓度下限的量化为100μM AGT。检验员和他的同事报道,3μM AGT降低怀孕的食物浓度和增加服务的浓度(10]。然而,AGT没有增加服务集中在我们的研究中。一种可能性是,服务的浓度已经通过与ACTH刺激提高约3.3倍,forskolin,血管紧张素ⅱ。

3.3.3。DDD

的作用机制在肾上腺类固醇生成估计DDD剂量依赖性抑制CYP11A1, HSD3B2 CYP21A2, CYP11B1(估计禁忌为25μM是87.0%、86.9%、76.9%和84.9%,分别地)(图5 (f))。DDD报道抑制CYP11A1、HSD3B2 CYP21A2, CYP11B1, CYP11B2 [29日,31日,32]。抑制的DDD CYP11B2不是估计在我们的研究中。然而,阿尔多的培养基的浓度下降到3%的正常刺激条件。抑制的DDD CYP11B2已经证明使用线粒体和微粒体分数由标准离心过程从牛肾上腺皮质匀浆(32]。差异的原因关于DDD的抑制CYP11B2不能用同样的效果的AGT来解释。

3.3.4。SP

周效磺胺-乙胺嘧啶在肾上腺类固醇生成机制的作用被抑制HSD3B2估计,CYP21A2和HSD17B3(估计禁忌为10μM是70.2%、59.5%和59.3%,分别地)(图5 (g))。SP报道抑制CYP17H、CYP17L CYP11B1, CYP11B2 [6,33- - - - - -35]。SP在HSD3B2酶的抑制作用是小说的作用机制。SP的主要行动是盐皮质激素受体拮抗剂(先生)。SP也被报道对一些非目标效应通过绑定雄激素,糖皮质激素和孕酮受体(56- - - - - -58]。SP可以抑制生产的奥尔多和CORT怀孕的血管紧张素ⅱ诱导的H295R细胞,但具体对手eplerenone先生没有显示抑制效应(59]。因此,HSD3B2抑制SP不是介导通过先生,和行动可能会直接抑制HSD3B2酶或部分已知的脱靶效应通过其他核激素受体介导的。关于CYP17H CYP17L,我们的结果与先前的报告相一致33,34]。7αSP -thiospironolactone,合成了脱乙酰作用,抑制CYP17H和CYP17L34]。这一事实没有禁忌CYP17H或CYP17L在我们的研究表明,SP可能不会脱去乙酰基- 7α-thiospironolactone NCI-H295R细胞。关于CYP11B1 CYP11B2,我们的研究结果与之前的研究相比并不清楚。它已经表明,30μM SP抑制的CYP11B1 CYP11B2在人类和牛肾上腺线粒体35]。CYP11B1 CYP11B2抑制和SP的原因不能确定在我们的研究中,这可能是由于最大曝光SP浓度低于以前的报告。我们不能检查SP浓度超过10μ米因为这些浓度在NCI-H295R细胞细胞毒性。

3.3.5。国会议员

的作用机制议员在肾上腺类固醇生成估计剂量依赖性抑制CYP11B1(估计禁忌1、10和100μM是57.1%、82.7%和98.2%,分别地)(图5 (h))。国会议员被抑制的CYP11B1报道为其主要效应和CYP11A1和CYP11B2弱效应(6,29日,36- - - - - -39]。结果可以表明,议员是一种选择性抑制剂的CYP11B1以前的报告。然而,在高浓度议员的估计效果,100年μM最大暴露浓度,还不清楚。根据以前的报告,选择性的议员的CYP11B1 / CYP11B2(大约5倍39]。此外,20μM议员有轻微的抑制作用CYP11A1 H295R细胞(29日]。

3.3.6。KC

肾上腺类固醇生成的KC的作用机制是抑制CYP11A1估计,CYP17H, CYP17L, HSD3B2, CYP21A2 CYP11B1, CYP11B2(估计禁忌在10μM分别为92.6%,94.3%,51.8%,83.0%,88.2%,97.4%,和79.8%,resp。)(图5(我))。KC报道抑制CYP11A1、CYP17H CYP17L, HSD3B2, CYP21A2, CYP11B1 [6,29日,40- - - - - -43]。我们的结果与先前的报道几乎是一致的。KC抑制CYP11A1、CYP17H CYP21A2, CYP11B1 NCI-H295R细胞在10μ米(29日]和CYP17H CYP17L CYP21A2, CYP11B1人类线粒体肾上腺和睾丸间质细胞微粒体2 - 5μ米(60,61年]。然而,KC显示只在睾丸间质细胞抑制HSD3B2疲软和HSD17B3毫克分子水平(60,61年]。关于CYP11B2和HSD17B3,我们认为这些估计禁忌KC确实有足够的可靠性的定量预测精度,因为奥尔多和服务浓度低于下限的量化10μM KC。

3.3.7。MC

肾上腺类固醇生成的MC的作用机制是抑制CYP17H估计,CYP17L CYP11B1, HSD17B3(估计禁忌为10μM是69.1%、53.0%、76.4%和57.1%,分别地)(图5 (j))。MC报道抑制不仅CYP17H和CYP17L而且CYP11A1 CYP21A2, CYP11B1 [41,44,45]。结果在前面的报告能够估计MC CYP17抑制剂。然而,CYP11A1抑制MC可能,而不是减少明星表达不明确使用NCI-H295R细胞在我们的研究中发现,因为没有减少怀孕的浓度的培养基和掠夺。间接抑制CYP11A1通过peripheral-type苯二氮受体已经被报道在小鼠肾上腺皮质细胞Y-1对待MC在缺乏刺激通过测量怀孕的生产(44]。另一方面,减少星蛋白表达和/或运输活动在不影响总类固醇合成或CYP11A1 HSD3B2酶表达或活动在(BU)已报告₂cAMP-stimulated MA-10睾丸间质肿瘤细胞治疗MC通过测量食物生产(45]。因此,MC的最初反应的影响肾上腺类固醇生成胆固醇应不同条件根据细胞类型和刺激。抑制CYP21A2和CYP11B1 MC已被报道为减少消费的食物和DCORTICO,分别为(41]。抑制的CYP11B1估计MC的行动在这项研究中,但CYP21A2没有检测到。在前面的实验报告,抑制网站由MC可能是反映CYP17H活动的抑制,因为CYP21A2活动测量作为一种减少食物的标签。

3.3.8。DZ

肾上腺类固醇生成的DZ的作用机制是抑制CYP11A1估计,HSD3B2, CYP21A2 CYP11B1, HSD17B3(估计禁忌,享年100岁μM是58.6%、94.1%、96.5%、87.2%、和98.1%,分别地)(图5 (k))。DZ报道抑制HSD3B2和CYP21A246]。HSD3B2和CYP21A2的结果与以前的报告一致。然而,禁忌CYP11A1尚未报道,CYP11B1, HSD17B3。这些估计的影响DZ的CYP11B1和HSD17B3都不清楚,因为奥尔多和服务的浓度低于下限的量化为100μm .此外,这些酶的强有力的行动点下游DZ, HSD3B2和CYP21A2等。

3.4。模拟和系统模型分析

3.4.1。肾上腺类固醇生成的动态灵敏度分析

全面了解肾上腺类固醇生成的动力学、动态敏感性计算浓度由NCI-H295R细胞分泌类固醇使用类固醇生成的构造数学模型。动态灵敏度分析的结果在72 h的持续时间和间隔时间6小时heat map图6。

的十大参数的动态灵敏度曲线下的面积总胆固醇和14类固醇在培养基,,,,,,,,,从顶部。胆固醇吸收(),星蛋白()和CYP11A1 (),这是类固醇生成能力的决定因素,促进了生产的盐皮质激素(DCORTICO CORTICO,阿尔多)和克制的合成糖皮质激素(DCORT和CORT)和性类固醇(土卫四、服务和E1)由于类固醇生成的中间分子的积累(怀孕的,HPREG,脱氢表雄酮、掠夺和HPROG)只有自活化。的动态模式中间分子类固醇生成主要是依赖CYP17H的活动和HSD3B2与怀孕的这些酶的底物,在动态的敏感性HPREG HPROG和学监,HPROG, DCORTICO逆转的方向敏感性在49 - 66 h后刺激。的最大活动的动态敏感性HSD3B2怀孕的()和CYP21A2学监()相关的所有类固醇在72 h。几乎所有模型参数有积极的敏感性肾上腺steroidogenic通路的下游类固醇和消极的灵敏度为direct-binding类固醇steroidogenic酶的底物。的敏感性在所有steroidogenic酶相对比同样的类固醇衬底。

3.4.2。模拟肾上腺类固醇生成途径的代谢平衡

清楚地表明房地产之间的代谢转变盐皮质激素和糖皮质激素的生物合成,我们进行二维参数扫描CYP17H和HSD3B2(图的酶的活动7)。NCI-H295R细胞失去了生产类固醇激素的能力当CYP17H酶活动,改变了HSD3B2超过60%和30%,分别。激活CYP17H和/或HSD3B2诱导代谢转变,增强了盐皮质激素生物合成糖皮质激素生物合成和偏离。另一方面,抑制CYP17H和/或HSD3B2诱导代谢转变,提高了盐皮质激素生物合成和偏离了糖皮质激素生物合成。此外,HSD3B2酶活性的调节代谢平衡的性类固醇和肾上腺类固醇生成的前体NCI-H295R细胞。E1、服务和土卫四时由NCI-H295R细胞激活HSD3B2的酶活性。相反,E2和脱氢表雄酮是由NCI-H295R HSD3B2细胞,抑制酶活性。的下游类固醇生物合成肾上腺类固醇生成途径,盐皮质激素和糖皮质激素等,几乎完全终止当HSD3B2的酶活性下降了超过80%。

4所示。讨论

4.1。3的重要性β在肾上腺类固醇生成hsd活动

我们的系统分析使用肾上腺类固醇生成的数学模型NCI-H295R细胞显示,3的酶活性βhsd控制肾上腺类固醇生成的动力学。明星蛋白质控制网的活动能力steroidogenic类固醇生成的细胞,即运输胆固醇从外到内线粒体膜。明星蛋白质和mRNA的表达水平正在迅速提高对促激素如ACTH刺激做出的反应(62年,63年]。肾上腺steroidogenesisis的另一个重要因素是胆固醇侧链裂解酶CYP11A1,病原和激素调节的第一步合成的类固醇激素,在线粒体胆固醇转换成孕烯醇酮(64年]。根据我们的研究结果的全局敏感性分析(补充表1和图6 (d)),除了CYP11A1和明星蛋白质,3βhsd是一种重要的监管机构NCI-H295R肾上腺类固醇生成的细胞。而且,这个结果表明,一个重要的调节机制在类固醇生成途径是非常合理的。明星,CYP11A1,和3βhsd(人类)亚型1或2蛋白质通常应对同样的荷尔蒙刺激类固醇生产通过营地等共同通路信号在肾上腺和睾丸65年,66年]。此外,我们的数据也支持最近从临床和实验证据在活的有机体内酶活性的研究,表明3βhsd扮演着一个重要的角色在肾上腺类固醇生成盐皮质激素合成的调控,有利于高血压引起的异常生产过剩的醛固酮(67年- - - - - -70年]。昼夜clock-deficient Cry-null老鼠显示食盐过敏高血压由于异常高醛固酮的合成,这是由于持续高表达HSD3B6信使rna和蛋白质的肾上腺皮质(67年,68年]。最近临床观察显示主要HSD3B2 mRNA的表达和蛋白质的醛固酮增多症相关的肿瘤细胞腺瘤(APA),和HSD3B1 mRNA显著相关CYP11B2 mRNA水平和APA患者血浆醛固酮浓度(69年,70年]。然而,尚不清楚和有争议的关系在一个小规模的临床研究表明遗传变异在APA HSD3B1影响血压和高血压患者(71年]。我们的模拟研究的结果表明,3βhsd蛋白(人类基因是HSD3B1和HSD3B2)的决定因素之一是肾上腺类固醇生成的动态特性。我们的研究结果支持Doi的临床证据和他的同事们(69年),我们相信HSD3B1酶颇有潜力作为内分泌高血压的新型药物的目标。

4.2。代谢转变HSD3B2和CYP17H肾上腺类固醇生成和贡献

在NCI-H295R肾上腺类固醇生成细胞的代谢性质揭示了动态灵敏度分析使用的数学模型(图6)。盐皮质激素,如DCORTICO CORTICO,奥尔多,和中间类固醇上游的肾上腺类固醇生成途径,如怀孕的,HPREG,脱氢表雄酮,食物,和HPROG加速胆固醇进口的反应(),星蛋白(和)和CYP11A1 ()。另一方面,糖皮质激素,如DCORT CORT、性激素,如土卫四,服务,和E1,抑制了这些模型参数。因此,净肾上腺类固醇生成能力的增强,提供怀孕的前兆的通路,导致糖皮质激素和盐皮质激素生产转变到CYP17H衬底禁忌,HSD3B2, CYP21A2引起的初始积累中间类固醇,如怀孕的和掠夺。敏感性CYP17H ()和HSD3B2 ()产品的动态改变,这些参数确定的代谢平衡下游肾上腺类固醇生成通路中的类固醇。根据这些结果的动态灵敏度分析的明星,CYP11A1, CYP17H, HSD3B2,我们建议增强CYP17H和HSD3B2活动期间ACTH刺激是非常重要的steroidogenic输出从奥尔多生物合成转向CORT生物合成以及肾上腺雄激素生产。这个建议部分支持比较动物研究的分子和细胞的变化CYP17H活动急性皮质醇显著影响生产,导致不同的生理和行为反应72年]。

结果二维参数扫描CYP17H酶活动的和HSD3B2定量显示细节的代谢盐皮质激素和糖皮质激素生物合成(图之间的关系7)。特别是,结果表明,这些酶活动的平衡是非常重要的对于典型的NCI-H295R细胞功能,即产生所有类固醇激素的能力。NCI-H295R细胞失去了这个函数当酶活动CYP17H和HSD3B2改变了60%和30%,分别。此外,他们成了盐皮质激素(奥尔多)分泌细胞的酶活性CYP17H HSD3B2抑制了50%或糖皮质激素(DCORT和CORT)分泌细胞这些酶激活时超过50%。特别是,这种分析还表明,HSD3B2是个关键球员NCI-H295R肾上腺类固醇生成的细胞,因为HSD3B2抑制了80%几乎完全抑制了下游的生物合成类固醇。CYP17A1比HSD3B2 mRNA表达水平已经与一些内分泌疾病与低水平APAs [73年cortisol-producing腺瘤[]和高水平74年]。此外,表达水平或酶活动相关的CYP17A1和HSD3B1雄激素生产多囊卵巢综合征(75年,76年]。这些临床研究支持我们的模拟结果表明平衡CYP17H酶活性和HSD3B2决定steroidogenic产出转向盐皮质激素,糖皮质激素、雄激素。

4.3。对药物发现方法量化机械的分析

根据我们的结果在NCI-H295R细胞使用类固醇生成的数学模型,如灵敏度分析,基于系统生物学的综合分析可以定量估计steroidogenic干扰化合物的作用机制从微分分析肾上腺类固醇激素,因为动态模式的类固醇激素肾上腺类固醇生成途径是高度复杂的。我们提出的方法定量的机械分析steroidogenic抑制剂能够预测已知行动网站在肾上腺类固醇生成途径只有一个时间点(72 h后药物暴露)。此外,根据灵敏度分析结果(图6),所有steroidogenic酶比更敏感,因为细胞内类固醇激素的浓度几乎保持在足够高的水平相比steroidogenic酶的价值观。这些结果表明估计的作用机制的药物更有效和可检测时使用的影响搜索参数如我们建议的方法。我们的数据表明,该方法基于系统生物学模型是一个非常强大的工具,探索steroidogenic干扰化合物的筛选。

RCGA作为参数估计问题的解决在系统生物学应用于生物网络识别基因调控网络和生物过程的代谢途径和优化使用实验观察时间进程的数据(77年- - - - - -82年]。在这项研究中,RCGA是有用的估计的作用机制新颖制药药物候选肾上腺类固醇生成新的RCGA在系统生物学中的应用。我们有两个问题在应用RCGA定量的机械分析的毒品的行为。这些问题是巨大的计算成本和quasi-optimum解决方案在解决优化问题的多峰性,因为在系统生物学包括许多方程的数学模型和参数。提出优化策略使用RCGA基于雷克斯/ JGG高度稳定和高效计算方法quasi-optimum解决方案比单模态分布交叉(UNDX) /最低代沟(“万人迷”女友)方法应用于工程领域。此外,我们扩大了RCGA优化程序基于雷克斯/ JGG混合遗传算法的方法,然后应用一个本地搜索推荐的原田和小林28,83年]。最终获得了最优解和良好的收敛性质。因为这些问题一般在系统生物学的研究中,我们建议该混合方法基于雷克斯/ JGG量化是一种非常有用的工具机械分析小说药品,不限于steroidogenic干扰化合物。

5。结论

这部小说肾上腺类固醇生成的数学模型是建立在这项研究中,包括胆固醇运输和分销,C₂₁类固醇激素通路、类固醇运输和细胞增殖,从而繁殖在NCI-H295R细胞肾上腺类固醇生成。结果显示使用新的模型,动态灵敏度分析HSD3B2中扮演最重要的角色在肾上腺类固醇生成的代谢平衡NCI-H295R细胞。此外,定量估计肾上腺有毒化合物的作用机制,我们分析了微分12代谢类固醇激素在接触后3天11肾上腺有毒化合物,通过使用新的数学模型和一种混合优化方法RCGA和本地搜索(非线性最小二乘法)。我们可以估计steroidogenic酶被受这些化合物使用混合优化方法。Vasculotoxic特工被估计没有影响的结果显示我们的方法。肾上腺steroidogenic抑制剂,预测行动网站大约匹配目标酶在文献中报道。因此,我们的计算机辅助方法基于系统生物学的方法可能是有用的分析内分泌失调的化合物的作用机制和评估人类肾上腺小说基于甾类激素药物毒性分析。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Ryuta齐藤,Natsuko寺崎和Naohisa Tsutsui设计研究。Naohisa Tsutsui和直Masutomi监督实验。Natsuko寺崎执行所有在体外实验,收集数据。Makoto山崎执行所有测量的类固醇。Ryuta齐藤构思的在网上策略,分析数据,开发的所有程序和数学模型,执行所有与Masahiro Okamoto仿真分析。Ryuta齐藤,Natsuko寺崎Makoto山崎Masutomi直,Masahiro Okamoto写道。

确认

作者要感谢迈克尔·s·布林博士和鸠山幸布林博士帮助讨论关于以前的肾上腺类固醇生成的数学模型。这项工作是支持的部分科研补助金在创新领域,“合成生物学”(No。23119001 (MO))从教育部,文化,体育,科学和技术在日本。

补充材料