福尔马林固定的组织预处理多通道光学光谱使用人类大脑肿瘤横截面的例子

文摘

脑肿瘤的描述需要神经病理学专业知识和一般由组织学评价和分子分析。一个新兴技术协助病理学家未来的肿瘤诊断方法是多通道光学光谱。在目前临床常规组织预处理和福尔马林广泛建立适合光谱调查自降解过程阻碍本地组织的测量。然而,福尔马林固定结果组织化学和形态的改变例如蛋白质交联。作为光学光谱对这些变化很敏感,我们评估福尔马林固定的影响多通道脑瘤数据在这个概念验证研究。Nonfixed和formalin-fixed横截面不同常见的人类大脑肿瘤受到分析使用紫外线和傅里叶变换红外显微镜的化学变化。形态变化进行评估的弹性光散射显微镜可见波长范围。数据分析与多元数据分析并与组织病理学。组织类型分类推导出光学光谱高度可比性和独立于准备和固定协议。然而,福尔马林固定导致略好分类模型由于改进组织的稳定性。 As a consequence, spectroscopic methods represent an appropriate additional contrast for chemical and morphological information in neuropathological diagnosis and should be investigated to a greater extent. Furthermore, they can be included in the clinical workflow even after formalin fixation.

1。介绍

数字化转型已经进入临床诊断和影响的微观诊断病变(1]。数字病理取代传统显微镜可以直接在屏幕上实现自诊断(2]。进一步的优势是数据管理解决方案和评价算法的结合,以及全球交易所的数据集1,3]。在短时间内调查大量的样本(高通量筛选)需要一个数字和预定义的流程链,让病理学家和数字病理系统预选样本,因此花更多的时间与诊断(4]。此外,流程链使一个简单的集成更多的光谱的对比方法,与经典的染色,提高选择3,4]。这些额外的对比方法之一是光学光谱(5,6]。其实现进入临床常规要求标准化样品处理(7),特别是在临床实践(1,8]。因此,光学光谱方法必须严格检查在临床常规的适用性。

在组织病理学、组织样本通常是获得活检和切除术和立即用福尔马林保存的目的9]。在病理学实验室使用得最多的是福尔马林固定剂(10- - - - - -13]。这个过程应该确保化学保护固定后的组织进行进一步的调查和分子分析(10,11,14- - - - - -16]。虽然没有固定的满足所有这些标准,福尔马林满足这些需求(11,17,18)抑制自我分解和稳定的组织与氨基交联氨基酸在肽和蛋白质组。用福尔马林固定不破坏核酸,碳水化合物,和脂肪。此外,三维结构被保留,以便它可以显式地调查9,17,18]。

固定后的标本通常嵌入在,例如,对部分制备石蜡,随后组织部分组织学染色使他们的显微镜检查7,10]。最常见的一种常规染色方法hematoxylin-eosin (H & E)染色。染色的细胞的细胞核和细胞质允许判断安排,密度和数量的有丝分裂,坏死的发展,和核和细胞多形性。这四个形态特征的肿瘤分类的主要标准是人类中枢神经系统(CNS) (19]。基于组织病理学和由此产生的形态因素,最近,遗传指纹,世界卫生组织(世卫组织)将主要的中枢神经系统肿瘤四个年级(I-IV) [19,20.)与良性肿瘤分为级为最高等级,等级IV表示大多数恶性肿瘤,如多形性成胶质细胞瘤(19- - - - - -22]。

改善癌症诊断是一项正在进行的任务。早,有针对性的和安全的癌症疗法只能导致增强病人的预后与一个坚实的基础在诊断(23- - - - - -26]。一个有意义的诊断方法是与光谱显微分析方法的结合,不需要任何额外的准备工作的肿瘤标本(27,28]。因此,越来越多的光谱单一技术,特别是拉曼和红外(IR)光谱,出现,针对脑部肿瘤的分类(29日- - - - - -32]。进一步的研究可以考虑弹性光散射光谱(ELS),这是特别敏感的组织形态差异(33,34]。它使最早的检测致癌作用(35- - - - - -37]。在紫外吸收光谱(UV)光谱范围是另一个技术描述细胞系和肿瘤组织(38- - - - - -40]。不同的光谱技术可以相互补充的信息内容(41),从而提高敏感性和特异性(42,43]。这种方法受到多通道光学光谱。它生成大型数据集,使用多元方法评估减少的数据量和识别小光谱差异(44- - - - - -46]。在众多的研究中,光学光谱技术结合多元数据分析方法用于癌症诊断(47- - - - - -49]。为了确定和可视化组中的数据集,一个主成分分析(PCA)是一个适当的工具(50]。PCA地址提取最相关的信息的复杂数据表(51,52]。结合主成分分析和贝叶斯判别分析(DA)使数据的分类和其他扣除model-related质量参数(53]。这个PCA-DA-based分类可以随后与古典相比,组织病理学诊断。额外的质量参数描述更准确的多变量模型和显示模型的预测质量。

到目前为止,各种组织制备技术研究了光谱(54- - - - - -61年]。大多数这些研究红外光谱和拉曼光谱用于这一目的。结果表明,细胞和组织准备与福尔马林最类似于他们的原生状态(54,58,62年]。然而,这些研究是一个多通道的概念与两个或两个以上的光谱技术。此外,对比spectroscopy-based脑肿瘤的识别和组织病理学组织部分这些肿瘤迄今为止没有执行。在这项研究中,我们追求一种多通道光谱的方法使用三种技术,紫外线,船,傅里叶变换红外光谱(英尺)。为此,nonfixed和固定组织的部分大脑肿瘤检查三种光谱方法。我们调查是否适当的福尔马林固定固定协议为每个光谱方法。福尔马林固定的适用性验证,确保化学稳定性与很少应用紫外和红外光谱。形态由福尔马林固定保护,然而,与ELS光谱学研究。基于多通道的数据集,计算关键性能指标的各自的光谱方法。在这里,我们表明,多元模型可以独立使用的固定。 Consequently, formalin-fixed tissue sections are suitable for a multivariate model-based diagnosis. Such a diagnostic tool is also simple to implement in a clinical workflow combined with fundamental studies.

2。材料和方法

2.1。样品制备

八个人类大脑不同的恶性肿瘤和肿瘤组织类型中切除手术和立即转移到液氮。两个不同的样本集用于光谱表征。两组是由肿瘤组织样本有不同的成绩。每个肿瘤实体产生三个组织横截面。基于详细的组织病理学评价,选择最合适的横截面进行光谱测量。

)染色证实组织的分析来自核心肿瘤。标本切片在10µm层厚度在cryomicrotome放在显微镜载玻片。对于紫外线显微镜,组织准备在石英幻灯片(Suprasil 1,亚琛Quarzglas-Technologie海因里希GmbH & Co .公斤)。ELS)和红外光谱的显微镜,BioGold幻灯片(高密度芯片,热科学)。一半的幻灯片与甲醛水溶液随后被固定在PBS(4%)和PBS冲洗,而另一半保持本机的幻灯片。相邻组织部分与类似的组织类型和结构formalin-fixed或保持本地为了比较固定的效果。此外,横截面的样品准备在玻片)染色。

2.2。组织病理学分级

十µ从八米厚的包埋H&E-stained横截面肿瘤组织是由两个独立的执照神经病理学检查和评分(美联社和JS)。样品的详细列表,见下表S1。

2.3。数据采集

在每个组织横截面,15单点测量进行固定和nonfixed样本的光谱技术。计量点选择,考虑特征形态特征的不同等级。因此,反映了组织的异质性度量。

2.4。紫外吸收显微镜

对于每一个肿瘤,15个测量每个nonfixed和formalin-fixed截面。测量数据在传输进行了蔡司MPM 800从230纳米到380纳米。一个空白的石英幻灯片作为参考。从XBO-lamp非偏振光(14 V, 75 W)幽灵似地分开了单色仪(光谱分辨率1海里,光谱精度±2.5 nm)和耦合到显微镜的照明孔径1.0毫米。透射光被引导通过石英客观(蔡司,ULTRAFLUAR 10 x,数值孔径0.20)和光电倍增管检测到图像平面的显微镜。测量孔径为0.25毫米。

2.5。弹性光散射显微镜

十五的测量每个nonfixed和formalin-fixed横截面/肿瘤。在反射测量完成蔡司MPM 800,范围从380纳米到700纳米。未极化的白光从卤素灯(12 V, 100 W)耦合成一个暗场反射器,和弹性散射光被暗视野仅仅收集目标(蔡司,EPIPLAN-NEOFLUAR 20 x,数值孔径0.50)。单色仪的背散射光光谱分离(光谱分辨率1海里,光谱精度±2.5 nm)和光电倍增管检测到图像平面的显微镜。测量位置仅限于一个直径0.63毫米的孔。Spectralon®作为参考。

2.6。傅里叶变换红外显微镜

15个测量每个nonfixed和formalin-fixed肿瘤横截面进行在衰减全反射PerkinElmer Autoimage显微镜结合红外光谱系统2000光谱仪。波数范围从4000厘米⁻¹到700厘米⁻¹。锗晶体孔径大小为100μm×100μ使用m。引用的系统对空气,和256年累积为每个测量获得的4。光谱分辨率是8厘米⁻¹。

2.7。数据分析

的PCA计算软件从这种“辨音器X 10.5”意味着定心,利用修正,和NIPALS-algorithm。模型确定了异常值的影响图霍特林的T²与F残差(例外限制各占5%)。单变量计算和情节进行了从OriginLab OriginPro 2017 g公司。nonfixed的比较固定的模型,每个主成分分析结合贝叶斯判别分析与Mahalanobis距离(紫外线和ELS显微镜)或欧几里得距离(红外光谱显微镜)背面的软件“辨音器X 10.5。“主成分(pc)用于显示的贝叶斯判别分析是类似于主成分分析模型。每个模型的质量是由之间的一致程度,模型的预测,和病理学家的假设是用百分比表示。这个值被称为整体精度。此外,平均敏感性,特异性,假阳性率,和精密的计算基于混淆矩阵的术语解释(见术语混淆矩阵的补充材料详情)(可用在这里)。这导致一个nonfixed模型和一个模型formalin-fixed样品每个光谱方法。除此之外,额外的模型包括nonfixed和formalin-fixed光谱计算(数字S5- - - - - -S7)。

2.8。光谱数据处理

紫外光谱的多元数据分析前进行预处理以以下方式:标准正态变量(SNV),随后Savitzky-Golay 1^圣(平滑)导数(11分,2^nd多项式阶)。

ELS)光谱的多元数据分析前预处理。最初的面积归一化之后,第一个SavitzkyGolay(平滑)导数(15分,2^nd多项式阶)。

红外光谱的多元数据分析之前进行预处理以以下方式:波数从2410厘米⁻¹到2240厘米⁻¹排除由于公司吗₂吸收空气中。一个单位向量归一化后的第一次SavitzkyGolay(平滑)导数(15分,2^nd多项式顺序)。

3所示。结果

3.1。脑部肿瘤样品和组织病理学分级

为了验证光谱方法研究了组织样本的诊断,常规组织部分神经病理学的诊断是由两个独立的认证神经病理学家(美联社和JS)。样本集我由一个WHO-grade纤维脑膜瘤(以下提到的示例),世卫组织二级间胶质瘤样本(B),世卫组织三级未分化室管膜瘤(示例C),和一个年级第四胶质母细胞瘤(D)样本数据1(一)-1(d))。第二个数据集提供了证明本研究的可行性:样本集。它由一个年级我丛乳头状瘤(以下提到的示例E),世卫组织二级少突神经胶质瘤(样本),世卫组织三级未分化间胶质瘤样本(G),和一个年级第四胶质母细胞瘤(样本H)(数据1(e) -1(h))。这些肿瘤被选为代表肿瘤实体概念验证研究(表S1)。

3.2。紫外吸收Nonfixed显微镜和Formalin-Fixed人类大脑肿瘤

数据2(一)-2(d)显示,紫外吸收光谱的人类大脑肿瘤。高吸收在230 nm和250 nm和300 nm之间广泛的吸收带是可见的。平均光谱几乎相同的形状,和nonfixed(数字2(一)和2(c))和formalin-fixed(数字2(b)和2(d))大多具有可比性。

样本B和H,然而,揭示小光谱差异240 nm - 260 nm和330 nm - 360 nm nonfixed和固定的横截面。为了突出这些差异,导数光谱(图生成S1)。

数据2(e) -2(l)的PCA模型预处理光谱并允许nonfixed分化的四个肿瘤样本,每个样本集的formalin-fixed横截面。3 d分数的情节nonfixed横截面样本集我如图2(e),在PC1解释方差(79%),少突神经胶质瘤,示例B是分开的其他组织样本。PC2解释方差(15%)将未分化室管膜瘤,脑膜瘤的示例C,样本和胶质母细胞瘤,d .生物样品(2%解释方差)区分脑膜瘤,样本从胶质母细胞瘤,d的3 d分数阴谋PC1解释方差(86%)与PC2解释方差(7%)与生物formalin-fixed脑瘤的解释方差(3%)横截面样本集我如图2(f)。在PC1,样品A, B, C可以区分。PC2和生物需要划分样本D从其他组织样本。相应的载荷图如图2(我)nonfixed模型和图2(j) formalin-fixed模型和有类似的趋势。nonfixed的主要差异和formalin-fixed脑瘤横截面为PC1位于240 nm。PC2的极值载荷formalin-fixed横截面变化的5 nm长波长nonfixed相比的。nonfixed横截面,极端值在245 nm和280 nm)。他们是位于250 nm和285 nm formalin-fixed横截面。在生物,我们观察到的主要差异在240海里,250 nm和290 nm nonfixed和formalin-fixed横截面。可比PCA模型能够达到nonfixed样本集二世(数字2(g)和2(k)和formalin-fixed(数字2(h)和2(左))脑瘤横截面。由于每个PCA与贝叶斯判别分析的结合使用Mahalanobis距离计算,质量比较nonfixed和formalin-fixed模型是可能的。模型的预测的根据与病理学家的假设导致82% nonfixed样本集我和85% nonfixed样本集。formalin-fixed样本集我达到一个整体精度为95%,而75%的精度决定了样本集II(表S5- - - - - -S8)。

3.3。弹性光散射显微镜Nonfixed和Formalin-Fixed人类大脑肿瘤

数据3(一)-3(d)显示了ELS的意思是光谱的人类大脑肿瘤组织样本。在每一个谱,广泛最大400 nm和500 nm之间是可观测的。光谱是尾矿从500纳米到700纳米和几乎相同的形状。nonfixed横截面的光谱数据3(一)和3(c))和formalin-fixed(数字3(b)和3(d))大多具有可比性。

示例C,然而,揭示小光谱差异400 nm - 450 nm nonfixed和固定横截面。为了突出这些差异,导数光谱(图生成S3)。

数据3(e) -3(左)显示了预处理光谱的主成分分析模型。模型允许一个组织的分化nonfixed样本集我和样本集二世和formalin-fixed横截面样本集。的分数阴谋nonfixed横截面样本集我如图3(e)。PC1解释方差(51%)区分组织。这里,组织位于订单B, D、C和PC1。PC2解释方差(9%)进一步提高分离的组织,特别是样本和样本B从样本C和d的成绩阴谋PC1解释方差(59%)与PC2 formalin-fixed脑瘤的解释方差(9%)横截面样本集我如图3(f)。在PC1,所有组织样本均匀排列的顺序nonfixed PCA模型。这同样适用于PC2,除了PC2镜像。总的来说,我们发现少重叠集群的分数的情节formalin-fixed样本。相应的载荷图如图3(我)nonfixed模型和图3我(j) formalin-fixed样本集模型。nonfixed的主要差异和formalin-fixed横截面是PC1 500海里。载荷块PC1几乎相同的形状。PC2的主要差异和载荷的外观是不同的。可比PCA模型能够达到nonfixed样本集二世(数字3(g)和3(k)和formalin-fixed(数字3(h)和3(左))脑瘤横截面。nonfixed和固定的质量比较的模型,每个主成分分析结合贝叶斯判别分析与距离。模型的预测的根据与病理学家的假设是88% nonfixed样本集我和72% nonfixed样本集。获得了98%的准确率的formalin-fixed样本集我和98%的样本集II(表S9- - - - - -S12)。

3.4。傅里叶变换红外显微镜Formalin-Fixed和Nonfixed人脑肿瘤

数据4(一)-4(d)的红外光谱的意思是光谱每个组织的人类大脑肿瘤样本。2410厘米之间的波数⁻¹和2240厘米⁻¹(有限公司₂在空气中)被排除在外。对于每个组织截面,之间有一个占主导地位的乐队3670厘米⁻¹和3200厘米⁻¹紧随其后的是一个乐队在2930厘米的两倍⁻¹和2850厘米⁻¹这不是明显的纤维脑膜瘤,样品的指纹区1780厘米⁻¹到700厘米⁻¹,平均光谱显示相同的趋势,除了乐队在1068厘米⁻¹为样品BD。主导nonfixed横截面的光谱(数据吗4(一)和4(c))和formalin-fixed(数字4(b)和4(d))大多具有可比性。

样本G显示小的光谱差异3000厘米⁻¹到3700厘米⁻¹,而样本H显示3500厘米之间的光谱变化⁻¹到3100厘米⁻¹nonfixed和固定的横截面。为了突出这些差异,导数光谱(图生成S4)。

数据4(e)4(左)显示预处理光谱的主成分分析模型和允许一个组织的分化nonfixed formalin-fixed横截面。分数nonfixed脑瘤横截面样本集的情节我如图4(e)。PC1解释方差(57%)分离样本和样本B从样本C和D . C和D的组织样本是重叠的。PC2解释方差(15%)区分组织样本C和D。的分数阴谋PC1解释方差(71%)与PC2 formalin-fixed脑瘤的解释方差(9%)横截面样本集我如图4(f)。在这里,组织样本PC1 B和D是重叠的,而组织样本和C是分开的。PC2确保样品的分离D从示例b。总的来说,我们发现少重叠集群的分数的情节formalin-fixed样本。四个测量样本D位于群样本对应的载荷图如图4(我)nonfixed模型和图4(j) formalin-fixed模型样本集i nonfixed的主要差异和formalin-fixed横截面是PC1 3000厘米之间⁻¹和2800厘米⁻¹在1635厘米⁻¹。的PC2 formalin-fixed模型,该地区在3000厘米之间⁻¹和2800厘米⁻¹再次主导以及乐队在1700厘米吗⁻¹,1621厘米⁻¹,1557厘米⁻¹。PC2 nonfixed模型相比,主要的差异取决于乐队在1700厘米⁻¹,1621厘米⁻¹,1557厘米⁻¹。载荷块PC1几乎相同的形状和nonfixed和formalin-fixed横截面的主要差异。可比PCA模型能够达到nonfixed样本集二世(数字4(g)和4(k)和formalin-fixed(数字4(h)和4(左))脑瘤横截面。

质量比较nonfixed和固定模型,每个主成分分析结合贝叶斯判别分析与欧式距离。按照与病理学家的假设,模型的预测精度是93% nonfixed样本集我和87% nonfixed样本集。的准确性达到97% formalin-fixed样本集我和样本集二世达成整体精度为93%(表向- - - - - -S16)。

3.5。结合数据集从Nonfixed Formalin-Fixed样本

对于每个光谱方法,我们进一步结合的光谱nonfixed和formalin-fixed横截面在一个数据集。基于这个数据集的组合,多变量模型是建立分析集群上的固定步骤的影响。这可能导致以下选项:我们得到了两个主要的集群主导信息引起的固定(nonfixed和formalin-fixed),组织样本在哪里不是位于第一个PC轴最大方差。第二个选择是组织样本信息位于第一个电脑,导致四大集群(样品A, B, C, D和E,样品F, G, H)。在第二个选项的情况下,它可以被排除在外,连续脑瘤横截面太不均匀。

这个数据集的结果结合了PCA的分数和载荷图所示补充材料(可用在这里)(数据S5- - - - - -S7)。无论固定,每个光谱方法的结果在一个集群根据不同的组织样本。

紫外光谱的主成分分析模型、聚类和作业组织样本的数据集都可能通过构建模型与四个人电脑。PC1 PC4描述解释方差的97%,样本集我为92%,第二样本集数据。总体精度是91% (I)和(II) 84%。ELS)光谱的主成分分析模型,聚类和作业的组织可能通过构建模型有三个电脑。解释的方差之和PC1生物是67%的样本集第二样本集,我们需要四个人电脑和解释方差为79%。总体精度为82%,样本集我为87%,样本集。红外光谱光谱的主成分分析模型、聚类和作业组织样本与四个人电脑可能通过构建模型。解释的方差之和PC1 PC4是86%,样本集我为98%,样本集。总体精度是92% (I)和(II) 87%。总体而言,模型建立的三种光谱方法nonfixed和formalin-fixed横截面特征根据组织样本。我们确定,福尔马林固定的结果是,独立的光谱技术,非常接近的nonfixed样本。否则,组合模型建筑不可能以这种方式。

4所示。讨论

船,我们调查的多通道组合紫外线和红外光谱显微镜获得横向解决信息原发性脑瘤组织。福尔马林固定收益更好的诊断结果比本地样本光谱多通道数据集的生成。使用这种多通道的方法,紫外和红外光谱获取化学信息的横截面,而船与组织形态(33]。

从实用的角度来看,固定,因此稳定的标本是首选光谱(54),甚至可以用于回顾性分析。本机脑组织样品遭受快速降解过程,但可用于实时的方法。通常,切除组织直接转移到一个缓冲福尔马林的解决方案在临床常规(9]。我们的结果表明,nonfixed和formalin-fixed横截面应为脑瘤提供可比的结果类型。这是未来重要的转移光谱结果术中应用。这个需求的验证,PCA-DA使用。PCA结构数据基于客观的数学标准和提供了一个客观的观点在光谱(44,51]。这减少了所需的数据提取和空间相关的光学信息(生物标记物)肿瘤特征(38,42]。

4.1。紫外吸收显微镜

紫外光谱测量电子从基态到激发态的转换 - - - - - -电子或非键电子。紫外线激发电子高反键分子轨道。由此产生的光谱有广泛的乐队。结合主成分分析和适当的光谱预处理,小化学和形态差异可以被脑瘤横截面和用作生物标记5,38]。光谱特性的提取适当的数据预处理是数据清晰可见2(一)-2(d)(标准正态变量,SNV)和图S1(SNV加上派生)。作者认为紫外光谱是有前途的工具,进一步的研究,因为它是便宜,易于使用,并提供基于生物分子的总和(化学信息38]。在紫外光谱,广泛吸收乐队230 nm和300 nm之间主要是可见光和分配的变化DNA和蛋白质的吸收。此外,含有芳香族氨基酸具有不同的吸收波段的紫外线(在257纳米苯丙氨酸,酪氨酸在274 nm,和色氨酸在280海里)(63年]。

由于蛋白质交联固定造成的,光谱差异可能出现在固定和nonfixed紫外光谱。这可能是可见的样本B和H。

相应的载荷PC1(数据2(我)2(左))可以被描述为一种蛋白质组件在240纳米左右(38]。另一种蛋白质成分吸收在280纳米,而DNA组件(包括组蛋白)吸收在260纳米38,63年]。我们假设的波长偏移formalin-fixed模型由5 nm长波长PC2有关,可能是由于环境的变化。福尔马林的交联反应是基于与自由氨基团体如赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸的活性羟基蛋白质和核苷酸。进一步与C = C和sh在不饱和脂质(1,5]。人类脑组织脂质含量高(7]。组织降解过程可以加速的高能紫外线激发光。显然,固定抑制组织的变性导致更少的异构集群。

4.2。弹性光散射显微镜

目主要特征样本纹理和形态。等结构的细胞和亚细胞的细胞器,它是基于米氏散射的大小,作为微观细胞和细胞器和sub-microscopic光学谐振器(33,64年]。细胞核染色体的一部分可以被视为结构化粒子阵列(65年]。许多细胞形成组织的安排。组织包含子单元的散射中心。由此产生的光谱的组织他们的形态密切相关33,34,64年]:这船信息互补的紫外和红外光谱显微镜的化学信息。另外,船是最便宜的方法之一。

福尔马林固定保存形态结构;因此,光谱差异不太可能出现。示例C的差异可能导致nonfixed变性的组织。

正如上面提到的,组织类型之间的光谱差异往往很小。边际粒子大小和形状的变化或折射率导致复杂的光谱特征和非随机的(33,65年]。因此,数据预处理和多元数据分析需要加强重叠光谱的小信息(44,51,65年]。图S3显示了ELS意味着光谱面积归一化后,首次推导光谱预处理在计算主成分分析的一部分。因此,微观结构的微小差异和sub-microstructures导致不同的光谱特征,因此底层调制能被探测到。相应的载荷的电脑携带组织病理学的相关信息。第一个电脑数据3(我)3(左)显示一条曲线有一个广泛的全球峰值负最大值500海里。这可以分配给散射光(66年]。的整体签名曲线类似于一阶导数(图S3)。此外,波纹结构强度覆盖较少。这种波纹结构是一个重复的模式,代表了主要的方差PC2的载荷。它可以分配给米氏干扰所引起的结构的横截面33]。固定过程会导致蛋白质的交联,这体现在小纹理变化。这是明显的形状PC2的载荷。主要的差异,分离的组织样本,给出PC1,类似nonfixed和formalin-fixed模型。即使样本的顺序在得分图PC1是相同的样本集我和可比样本集II(数字3(e) -3(h))。固定的主要目的是保持完整的形态特征(12,15,18];因此,我们有更少的分歧主要船模型的方差。然而,PC2,我们看到几个不同的载荷以及分数的阴谋。这可能是由于小纹理的变化,通过蛋白质的交联。为其特定的高灵敏度(ELS)是已知的66年]。例如,组织最早的可能的致癌作用检测是可行的,船(35,36),见一只老鼠模型前六周早期检测生物标记物(37]。测量横截面内的方差比formalin-fixed更高的本地组织的组织。

4.3。傅里叶变换红外显微镜

红外光谱是一种常见的方法来测量获得分子振动的化学信息。标签的样品是没有必要的,他们准备是最小的。因此,我们选择红外光谱显微镜作为第三种方法,因为它被描述为一个标准的方法组织特征(7]。光谱特性的提取适当的数据预处理是数据清晰可见4(一)-4(d)(向量归一化)和图S4(向量规范化+推导)。

福尔马林固定的组织结构变化导致大分子存在的组织。最突出的变化引起的这个过程是蛋白质交联,导致过分强调酰胺等相关蛋白质带我和二酰胺振动。结构稳定的实际利益组织的蛋白质交联是一种更健壮的PCA模型描述的实体肿瘤。因此,样品的光谱差异G之间固定和nonfixed红外光谱可以推导出另外蛋白质和脂质含量的变化。样例H, OH-band更明显以来nonfixed样本相对于固定一个固定过程导致组织脱水。

脑肿瘤的光谱带的任务是总结表1。在2850 - 2960厘米之间的波数范围⁻¹,一个强大的影响是可辨认的归因于脂肪酸(ν(CH),ν(CH2),ν(CH3)) (32,67年]。此外,ν在1750厘米(C = O)⁻¹与脂质(32,68年,69年]。人类的大脑组织由脂肪酸和脂质(7,神经胶质瘤的形成与脂肪代谢的显著改变(32]。因此,脂质浓度和组成的变化在肿瘤起源也影响肿瘤的光谱属性。我周围的著名乐队酰胺和二酰胺振动(1655厘米⁻¹,1582厘米⁻¹,1547厘米⁻¹)被分配到蛋白质和肽(32,67年- - - - - -71年]。例如胶原纤维使用脑部肿瘤检测和红外光谱(70年]。在大多数情况下的肿瘤起源、遗传变化。癌基因的激活和失活的肿瘤抑制是必不可少的。此外,DNA的甲基化是不可以忽略不计72年]。DNA和RNA变化相关红外显微镜与磷酸和/或磷酸二酯在1234厘米⁻¹和1063厘米⁻¹(ν(PO₂),1165厘米⁻¹(ν(切断),1040厘米⁻¹到1110厘米⁻¹(ν(切断))(32,67年,68年,71年]。1040厘米之间的范围⁻¹到1110厘米⁻¹是最有可能的关联ν从核糖(切断)伸展振动ν(切断)骨架振动在RNA和DNA。此外,核酸磷酸二酯组的对称伸缩振动强烈相关DNA和RNA的变化(71年]。

4.4。结合数据集从Nonfixed Formalin-Fixed样本

此外,我们为每个光谱方法建立多元模型结合formalin-fixed和nonfixed组织数据集。因为邻近组织横截面formalin-fixed或保持本地,nonfixed横截面不formalin-fixed的完全相同。因此,病理学家需要单独检查每个横截面,以确保一个视觉匹配nonfixed和固定的组织样本。此外,脑肿瘤组织不均匀,导致更大的连续横截面之间的结构差异。

样品根据恶性肿瘤的特点就是证明不仅与单一模型的制备技术与组合模型也包含nonfixed和formalin-fixed光谱。结合的聚类模型的控制效果不是(nonfixed和formalin-fixed)的制备过程,但不同的组织样本在不同恶性肿瘤。在此基础上观察,我们假设每个脑瘤的nonfixed和formalin-fixed部分具有可比性。

在表2,所有的计算模型质量参数为每个模型进行了总结。所有值混淆矩阵的计算。模型的预测的准确性是根据病理学家的任务。所有类都有相同的大小,他们是平等的。因此,敏感性,特异性,假阳性率,精度为每个组织样本平均值在这个模型中,可以计算的基础上的混淆矩阵所示的补充材料(可用在这里)。灵敏度或真阳性率意味着,当它实际上是,通过病理学家的假设,“是的,”多久模型预测“是的。“专一性描述,当它实际上是“不,”模型预测它多久”。“当模型预测组织样本为“是的,“多久这所描述的预测是正确的精度。高值灵敏度、特异性和显示一个好的模型精度质量。另一方面,一个更小的假阳性比率表明一个更好的模型。根据表2,所有的模型和方法表现出值精度优于70%,敏感性和特异性。生物样本的统计数据,这些都是可接受的值(34]。在所有情况下,formalin-fixed模型更准确和有更少的方差作为nonfixed模型。作者确定的快速降解nonfixed样品测量过程中作为一个可能的原因。

比较光谱方法亦然,红外光谱收益率和最好的质量参数,直接跟着船光谱学。ELS光谱学,nonfixed横截面模型良好的价值观有近10%低于formalin-fixed模型。这可能是由于灵敏度的方法,因为它检测到小改变之前,他们用眼睛是可见的(35- - - - - -37,66年]。总的来说,ELS)更准确地检测衰老和退化nonfixed横截面比其他调查技术。紫外吸收光谱的nonfixed模型可能是受到同样的效果。激发光的高能源可以加速组织的退化过程比其他激励源红外像碳硅棒。这种假设似乎是合理的,我们有一个更好的密切紫外线spectroscopic-based formalin-fixed横截面模型。

总的来说,大多数模型的质量参数略好formalin-fixed横截面考虑所有三种光谱方法。这也可以观察到PCA分数情节(数字2(e) -2(h),3(e) -3(h)和4(e) -4(h))的改进集群分离和不那么明显的分散在每个集群。

5。结论

我们提供一个概念证明调查大脑肿瘤组织的多通道光谱的方法。由于三个不同的光谱方法的结合,整体spectroscopic-based PCA-DA模型是描述开发脑部肿瘤组织对恶性肿瘤的程度。使用这种光谱组合方法,我们表明,福尔马林固定光谱调查是一个合适的样品制备方法。福尔马林固定不影响聚类模型对四个肿瘤并列甚至导致改善PCA-DA模型相比nonfixed数据集。未来的研究工作将不仅包括其他肿瘤类型的调查还考虑常见的石蜡包埋过程。因此,我们将比较石蜡包埋formalin-fixed横截面与本地和福尔马林横截面。

数据可用性

这手稿中使用的所有原始数据可以在请求从相应的作者。

信息披露

J.W.巴奇,大肠Ostertag, r·里茨专利等待(WO002015097089A1和EP000002887050A1)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

女士,艾尔,JWB MBr, BB, SH, RR, KR, EO负责概念化。女士,艾尔,JWB,美联社,JS, BB, SH, SN, RR, EO策划数据。女士、AL、BB、SH和EO进行正式的分析:。女士,JWB,美联社、JS、SH, SN调查研究。女士、AL、BB、SH和EO参与的方法。基米-雷克南和EO负责项目管理。JWB RR, CN、MT和KR收集资源。JWB MBr, EO监督这项研究。女士,艾尔、JWB和EO验证研究。女士,addison - wesley, EO参与了可视化。 MS, AL, JWB, MBa, AW, MBr, and EO were involved in the writing of the original draft. MS, AL, JWB, MBa, AW, MBr, AP, JS, BB, SN, CN, MT, RR, KR, EO wrote, reviewed, and edited the manuscript.

确认

作者特别感谢Yeliz Donat说,Sabine Motzny准备横截面,Lieselotte Barac数据采集,Waltraud凯斯勒教授和鲁道夫·凯斯勒博士教授有价值的讨论。研究报告在这份出版物是巴登-符腾堡州科技部的支持下,研究和文化Ministerium (MWK),在图宾根大学的博士项目“Intelligente Prozess-und Materialentwicklung在der Biomateriomics (IPMB)”(博士生奖学金和MBa女士),和Baden-Wuerttemberg Stiftung。文章加工费由巴登-符腾堡州的科学,研究和文化开放获取出版资助项目。

补充材料

在手稿,引用补充材料。补充数据和表由领先的“S”表示他们的名字。补充材料包括测量样本的概述,解释术语混淆矩阵的例子,每个光谱的派生的意思是光谱方法,每个多变量的混淆矩阵模型。此外,2 d-scores UV-models都包括在内,和所有的多元模型综合评价所示的细节。(补充材料)

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