八个人类大脑不同的恶性肿瘤和肿瘤组织类型中切除手术和立即转移到液氮。两个不同的样本集用于光谱表征。两组是由肿瘤组织样本有不同的成绩。每个肿瘤实体产生三个组织横截面。基于详细的组织病理学评价,选择最合适的横截面进行光谱测量。

)染色证实组织的分析来自核心肿瘤。标本切片在10 µm层厚度在cryomicrotome放在显微镜载玻片。对于紫外线显微镜,组织准备在石英幻灯片(Suprasil 1,亚琛Quarzglas-Technologie海因里希GmbH & Co .公斤)。ELS)和红外光谱的显微镜,BioGold幻灯片(高密度芯片,热科学)。一半的幻灯片与甲醛水溶液随后被固定在PBS(4%)和PBS冲洗,而另一半保持本机的幻灯片。相邻组织部分与类似的组织类型和结构formalin-fixed或保持本地为了比较固定的效果。此外,横截面的样品准备在玻片)染色。

十 µ从八米厚的包埋H&E-stained横截面肿瘤组织是由两个独立的执照神经病理学检查和评分(美联社和JS)。样品的详细列表,见下表 S1。

在每个组织横截面,15单点测量进行固定和nonfixed样本的光谱技术。计量点选择,考虑特征形态特征的不同等级。因此,反映了组织的异质性度量。

对于每一个肿瘤,15个测量每个nonfixed和formalin-fixed截面。测量数据在传输进行了蔡司MPM 800从230纳米到380纳米。一个空白的石英幻灯片作为参考。从XBO-lamp非偏振光(14 V, 75 W)幽灵似地分开了单色仪(光谱分辨率1海里,光谱精度±2.5 nm)和耦合到显微镜的照明孔径1.0毫米。透射光被引导通过石英客观(蔡司,ULTRAFLUAR 10 x,数值孔径0.20)和光电倍增管检测到图像平面的显微镜。测量孔径为0.25毫米。

十五的测量每个nonfixed和formalin-fixed横截面/肿瘤。在反射测量完成蔡司MPM 800,范围从380纳米到700纳米。未极化的白光从卤素灯(12 V, 100 W)耦合成一个暗场反射器,和弹性散射光被暗视野仅仅收集目标(蔡司,EPIPLAN-NEOFLUAR 20 x,数值孔径0.50)。单色仪的背散射光光谱分离(光谱分辨率1海里,光谱精度±2.5 nm)和光电倍增管检测到图像平面的显微镜。测量位置仅限于一个直径0.63毫米的孔。Spectralon®作为参考。

15个测量每个nonfixed和formalin-fixed肿瘤横截面进行在衰减全反射PerkinElmer Autoimage显微镜结合红外光谱系统2000光谱仪。波数范围从4000厘米⁻¹到700厘米⁻¹。锗晶体孔径大小为100 μm×100 μ使用m。引用的系统对空气,和256年累积为每个测量获得的4。光谱分辨率是8厘米⁻¹。

的PCA计算软件从这种“辨音器X 10.5”意味着定心,利用修正,和NIPALS-algorithm。模型确定了异常值的影响图霍特林的 T²与 F残差(例外限制各占5%)。单变量计算和情节进行了从OriginLab OriginPro 2017 g公司。nonfixed的比较固定的模型,每个主成分分析结合贝叶斯判别分析与Mahalanobis距离(紫外线和ELS显微镜)或欧几里得距离(红外光谱显微镜)背面的软件“辨音器X 10.5。“主成分(pc)用于显示的贝叶斯判别分析是类似于主成分分析模型。每个模型的质量是由之间的一致程度,模型的预测,和病理学家的假设是用百分比表示。这个值被称为整体精度。此外,平均敏感性,特异性,假阳性率,和精密的计算基于混淆矩阵的术语解释(见术语混淆矩阵的补充材料详情)(可用 在这里)。这导致一个nonfixed模型和一个模型formalin-fixed样品每个光谱方法。除此之外,额外的模型包括nonfixed和formalin-fixed光谱计算(数字 S5- - - - - - S7)。

紫外光谱的多元数据分析前进行预处理以以下方式:标准正态变量(SNV),随后Savitzky-Golay 1^圣(平滑)导数(11分,2^nd多项式阶)。

ELS)光谱的多元数据分析前预处理。最初的面积归一化之后,第一个SavitzkyGolay(平滑)导数(15分,2^nd多项式阶)。

红外光谱的多元数据分析之前进行预处理以以下方式:波数从2410厘米⁻¹到2240厘米⁻¹排除由于公司吗₂吸收空气中。一个单位向量归一化后的第一次SavitzkyGolay(平滑)导数(15分,2^nd多项式顺序)。

为了验证光谱方法研究了组织样本的诊断,常规组织部分神经病理学的诊断是由两个独立的认证神经病理学家(美联社和JS)。样本集我由一个WHO-grade纤维脑膜瘤(以下提到的示例),世卫组织二级间胶质瘤样本(B),世卫组织三级未分化室管膜瘤(示例C),和一个年级第四胶质母细胞瘤(D)样本数据 1(一)- 1(d))。第二个数据集提供了证明本研究的可行性:样本集。它由一个年级我丛乳头状瘤(以下提到的示例E),世卫组织二级少突神经胶质瘤(样本),世卫组织三级未分化间胶质瘤样本(G),和一个年级第四胶质母细胞瘤(样本H)(数据 1(e) - 1(h))。这些肿瘤被选为代表肿瘤实体概念验证研究(表 S1)。

数据 2(一)- 2(d)显示,紫外吸收光谱的人类大脑肿瘤。高吸收在230 nm和250 nm和300 nm之间广泛的吸收带是可见的。平均光谱几乎相同的形状,和nonfixed(数字 2(一)和 2(c))和formalin-fixed(数字 2(b)和 2(d))大多具有可比性。

样本B和H,然而,揭示小光谱差异240 nm - 260 nm和330 nm - 360 nm nonfixed和固定的横截面。为了突出这些差异,导数光谱(图生成 S1)。

数据 2(e) - 2(l)的PCA模型预处理光谱并允许nonfixed分化的四个肿瘤样本,每个样本集的formalin-fixed横截面。3 d分数的情节nonfixed横截面样本集我如图 2(e),在PC1解释方差(79%),少突神经胶质瘤,示例B是分开的其他组织样本。PC2解释方差(15%)将未分化室管膜瘤,脑膜瘤的示例C,样本和胶质母细胞瘤,d .生物样品(2%解释方差)区分脑膜瘤,样本从胶质母细胞瘤,d的3 d分数阴谋PC1解释方差(86%)与PC2解释方差(7%)与生物formalin-fixed脑瘤的解释方差(3%)横截面样本集我如图 2(f)。在PC1,样品A, B, C可以区分。PC2和生物需要划分样本D从其他组织样本。相应的载荷图如图 2(我)nonfixed模型和图 2(j) formalin-fixed模型和有类似的趋势。nonfixed的主要差异和formalin-fixed脑瘤横截面为PC1位于240 nm。PC2的极值载荷formalin-fixed横截面变化的5 nm长波长nonfixed相比的。nonfixed横截面,极端值在245 nm和280 nm)。他们是位于250 nm和285 nm formalin-fixed横截面。在生物,我们观察到的主要差异在240海里,250 nm和290 nm nonfixed和formalin-fixed横截面。可比PCA模型能够达到nonfixed样本集二世(数字 2(g)和 2(k)和formalin-fixed(数字 2(h)和 2(左))脑瘤横截面。由于每个PCA与贝叶斯判别分析的结合使用Mahalanobis距离计算,质量比较nonfixed和formalin-fixed模型是可能的。模型的预测的根据与病理学家的假设导致82% nonfixed样本集我和85% nonfixed样本集。formalin-fixed样本集我达到一个整体精度为95%,而75%的精度决定了样本集II(表 S5- - - - - - S8)。

数据 3(一)- 3(d)显示了ELS的意思是光谱的人类大脑肿瘤组织样本。在每一个谱,广泛最大400 nm和500 nm之间是可观测的。光谱是尾矿从500纳米到700纳米和几乎相同的形状。nonfixed横截面的光谱数据 3(一)和 3(c))和formalin-fixed(数字 3(b)和 3(d))大多具有可比性。

示例C,然而,揭示小光谱差异400 nm - 450 nm nonfixed和固定横截面。为了突出这些差异,导数光谱(图生成 S3)。

数据 3(e) - 3(左)显示了预处理光谱的主成分分析模型。模型允许一个组织的分化nonfixed样本集我和样本集二世和formalin-fixed横截面样本集。的分数阴谋nonfixed横截面样本集我如图 3(e)。PC1解释方差(51%)区分组织。这里,组织位于订单B, D、C和PC1。PC2解释方差(9%)进一步提高分离的组织,特别是样本和样本B从样本C和d的成绩阴谋PC1解释方差(59%)与PC2 formalin-fixed脑瘤的解释方差(9%)横截面样本集我如图 3(f)。在PC1,所有组织样本均匀排列的顺序nonfixed PCA模型。这同样适用于PC2,除了PC2镜像。总的来说,我们发现少重叠集群的分数的情节formalin-fixed样本。相应的载荷图如图 3(我)nonfixed模型和图 3我(j) formalin-fixed样本集模型。nonfixed的主要差异和formalin-fixed横截面是PC1 500海里。载荷块PC1几乎相同的形状。PC2的主要差异和载荷的外观是不同的。可比PCA模型能够达到nonfixed样本集二世(数字 3(g)和 3(k)和formalin-fixed(数字 3(h)和 3(左))脑瘤横截面。nonfixed和固定的质量比较的模型,每个主成分分析结合贝叶斯判别分析与距离。模型的预测的根据与病理学家的假设是88% nonfixed样本集我和72% nonfixed样本集。获得了98%的准确率的formalin-fixed样本集我和98%的样本集II(表 S9- - - - - - S12)。

数据 4(一)- 4(d)的红外光谱的意思是光谱每个组织的人类大脑肿瘤样本。2410厘米之间的波数⁻¹和2240厘米⁻¹(有限公司₂在空气中)被排除在外。对于每个组织截面,之间有一个占主导地位的乐队3670厘米⁻¹和3200厘米⁻¹紧随其后的是一个乐队在2930厘米的两倍⁻¹和2850厘米⁻¹这不是明显的纤维脑膜瘤,样品的指纹区1780厘米⁻¹到700厘米⁻¹,平均光谱显示相同的趋势,除了乐队在1068厘米⁻¹为样品BD。主导nonfixed横截面的光谱(数据吗 4(一)和 4(c))和formalin-fixed(数字 4(b)和 4(d))大多具有可比性。

样本G显示小的光谱差异3000厘米⁻¹到3700厘米⁻¹,而样本H显示3500厘米之间的光谱变化⁻¹到3100厘米⁻¹nonfixed和固定的横截面。为了突出这些差异,导数光谱(图生成 S4)。

数据 4(e) 4(左)显示预处理光谱的主成分分析模型和允许一个组织的分化nonfixed formalin-fixed横截面。分数nonfixed脑瘤横截面样本集的情节我如图 4(e)。PC1解释方差(57%)分离样本和样本B从样本C和D . C和D的组织样本是重叠的。PC2解释方差(15%)区分组织样本C和D。的分数阴谋PC1解释方差(71%)与PC2 formalin-fixed脑瘤的解释方差(9%)横截面样本集我如图 4(f)。在这里,组织样本PC1 B和D是重叠的,而组织样本和C是分开的。PC2确保样品的分离D从示例b。总的来说,我们发现少重叠集群的分数的情节formalin-fixed样本。四个测量样本D位于群样本对应的载荷图如图 4(我)nonfixed模型和图 4(j) formalin-fixed模型样本集i nonfixed的主要差异和formalin-fixed横截面是PC1 3000厘米之间⁻¹和2800厘米⁻¹在1635厘米⁻¹。的PC2 formalin-fixed模型,该地区在3000厘米之间⁻¹和2800厘米⁻¹再次主导以及乐队在1700厘米吗⁻¹,1621厘米⁻¹,1557厘米⁻¹。PC2 nonfixed模型相比,主要的差异取决于乐队在1700厘米⁻¹,1621厘米⁻¹,1557厘米⁻¹。载荷块PC1几乎相同的形状和nonfixed和formalin-fixed横截面的主要差异。可比PCA模型能够达到nonfixed样本集二世(数字 4(g)和 4(k)和formalin-fixed(数字 4(h)和 4(左))脑瘤横截面。

质量比较nonfixed和固定模型,每个主成分分析结合贝叶斯判别分析与欧式距离。按照与病理学家的假设,模型的预测精度是93% nonfixed样本集我和87% nonfixed样本集。的准确性达到97% formalin-fixed样本集我和样本集二世达成整体精度为93%(表 向- - - - - - S16)。

对于每个光谱方法,我们进一步结合的光谱nonfixed和formalin-fixed横截面在一个数据集。基于这个数据集的组合,多变量模型是建立分析集群上的固定步骤的影响。这可能导致以下选项:我们得到了两个主要的集群主导信息引起的固定(nonfixed和formalin-fixed),组织样本在哪里不是位于第一个PC轴最大方差。第二个选择是组织样本信息位于第一个电脑,导致四大集群(样品A, B, C, D和E,样品F, G, H)。在第二个选项的情况下,它可以被排除在外,连续脑瘤横截面太不均匀。

这个数据集的结果结合了PCA的分数和载荷图所示补充材料(可用 在这里)(数据 S5- - - - - - S7)。无论固定,每个光谱方法的结果在一个集群根据不同的组织样本。

紫外光谱的主成分分析模型、聚类和作业组织样本的数据集都可能通过构建模型与四个人电脑。PC1 PC4描述解释方差的97%,样本集我为92%,第二样本集数据。总体精度是91% (I)和(II) 84%。ELS)光谱的主成分分析模型,聚类和作业的组织可能通过构建模型有三个电脑。解释的方差之和PC1生物是67%的样本集第二样本集,我们需要四个人电脑和解释方差为79%。总体精度为82%,样本集我为87%,样本集。红外光谱光谱的主成分分析模型、聚类和作业组织样本与四个人电脑可能通过构建模型。解释的方差之和PC1 PC4是86%,样本集我为98%,样本集。总体精度是92% (I)和(II) 87%。总体而言,模型建立的三种光谱方法nonfixed和formalin-fixed横截面特征根据组织样本。我们确定,福尔马林固定的结果是,独立的光谱技术,非常接近的nonfixed样本。否则,组合模型建筑不可能以这种方式。

紫外光谱测量电子从基态到激发态的转换 π 电子或非键电子。紫外线激发电子高反键分子轨道。由此产生的光谱有广泛的乐队。结合主成分分析和适当的光谱预处理,小化学和形态差异可以被脑瘤横截面和用作生物标记 5, 38]。光谱特性的提取适当的数据预处理是数据清晰可见 2(一)- 2(d)(标准正态变量,SNV)和图 S1(SNV加上派生)。作者认为紫外光谱是有前途的工具,进一步的研究,因为它是便宜,易于使用,并提供基于生物分子的总和(化学信息 38]。在紫外光谱,广泛吸收乐队230 nm和300 nm之间主要是可见光和分配的变化DNA和蛋白质的吸收。此外,含有芳香族氨基酸具有不同的吸收波段的紫外线(在257纳米苯丙氨酸,酪氨酸在274 nm,和色氨酸在280海里)( 63年]。

由于蛋白质交联固定造成的,光谱差异可能出现在固定和nonfixed紫外光谱。这可能是可见的样本B和H。

相应的载荷PC1(数据 2(我) 2(左))可以被描述为一种蛋白质组件在240纳米左右( 38]。另一种蛋白质成分吸收在280纳米,而DNA组件(包括组蛋白)吸收在260纳米 38, 63年]。我们假设的波长偏移formalin-fixed模型由5 nm长波长PC2有关,可能是由于环境的变化。福尔马林的交联反应是基于与自由氨基团体如赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸的活性羟基蛋白质和核苷酸。进一步与C = C和sh在不饱和脂质( 1, 5]。人类脑组织脂质含量高( 7]。组织降解过程可以加速的高能紫外线激发光。显然,固定抑制组织的变性导致更少的异构集群。

目主要特征样本纹理和形态。等结构的细胞和亚细胞的细胞器,它是基于米氏散射的大小,作为微观细胞和细胞器和sub-microscopic光学谐振器( 33, 64年]。细胞核染色体的一部分可以被视为结构化粒子阵列( 65年]。许多细胞形成组织的安排。组织包含子单元的散射中心。由此产生的光谱的组织他们的形态密切相关 33, 34, 64年]:这船信息互补的紫外和红外光谱显微镜的化学信息。另外,船是最便宜的方法之一。

福尔马林固定保存形态结构;因此,光谱差异不太可能出现。示例C的差异可能导致nonfixed变性的组织。

正如上面提到的,组织类型之间的光谱差异往往很小。边际粒子大小和形状的变化或折射率导致复杂的光谱特征和非随机的( 33, 65年]。因此,数据预处理和多元数据分析需要加强重叠光谱的小信息( 44, 51, 65年]。图 S3显示了ELS意味着光谱面积归一化后,首次推导光谱预处理在计算主成分分析的一部分。因此,微观结构的微小差异和sub-microstructures导致不同的光谱特征,因此底层调制能被探测到。相应的载荷的电脑携带组织病理学的相关信息。第一个电脑数据 3(我) 3(左)显示一条曲线有一个广泛的全球峰值负最大值500海里。这可以分配给散射光( 66年]。的整体签名曲线类似于一阶导数(图 S3)。此外,波纹结构强度覆盖较少。这种波纹结构是一个重复的模式,代表了主要的方差PC2的载荷。它可以分配给米氏干扰所引起的结构的横截面 33]。固定过程会导致蛋白质的交联,这体现在小纹理变化。这是明显的形状PC2的载荷。主要的差异,分离的组织样本,给出PC1,类似nonfixed和formalin-fixed模型。即使样本的顺序在得分图PC1是相同的样本集我和可比样本集II(数字 3(e) - 3(h))。固定的主要目的是保持完整的形态特征( 12, 15, 18];因此,我们有更少的分歧主要船模型的方差。然而,PC2,我们看到几个不同的载荷以及分数的阴谋。这可能是由于小纹理的变化,通过蛋白质的交联。为其特定的高灵敏度(ELS)是已知的 66年]。例如,组织最早的可能的致癌作用检测是可行的,船( 35, 36),见一只老鼠模型前六周早期检测生物标记物( 37]。测量横截面内的方差比formalin-fixed更高的本地组织的组织。

红外光谱是一种常见的方法来测量获得分子振动的化学信息。标签的样品是没有必要的,他们准备是最小的。因此,我们选择红外光谱显微镜作为第三种方法,因为它被描述为一个标准的方法组织特征( 7]。光谱特性的提取适当的数据预处理是数据清晰可见 4(一)- 4(d)(向量归一化)和图 S4(向量规范化+推导)。

福尔马林固定的组织结构变化导致大分子存在的组织。最突出的变化引起的这个过程是蛋白质交联,导致过分强调酰胺等相关蛋白质带我和二酰胺振动。结构稳定的实际利益组织的蛋白质交联是一种更健壮的PCA模型描述的实体肿瘤。因此,样品的光谱差异G之间固定和nonfixed红外光谱可以推导出另外蛋白质和脂质含量的变化。样例H, OH-band更明显以来nonfixed样本相对于固定一个固定过程导致组织脱水。

脑肿瘤的光谱带的任务是总结表 1。在2850 - 2960厘米之间的波数范围⁻¹,一个强大的影响是可辨认的归因于脂肪酸( ν(CH), ν(CH2), ν(CH3)) ( 32, 67年]。此外, ν在1750厘米(C = O)⁻¹与脂质( 32, 68年, 69年]。人类的大脑组织由脂肪酸和脂质( 7,神经胶质瘤的形成与脂肪代谢的显著改变( 32]。因此,脂质浓度和组成的变化在肿瘤起源也影响肿瘤的光谱属性。我周围的著名乐队酰胺和二酰胺振动(1655厘米⁻¹,1582厘米⁻¹,1547厘米⁻¹)被分配到蛋白质和肽( 32, 67年- - - - - - 71年]。例如胶原纤维使用脑部肿瘤检测和红外光谱( 70年]。在大多数情况下的肿瘤起源、遗传变化。癌基因的激活和失活的肿瘤抑制是必不可少的。此外,DNA的甲基化是不可以忽略不计 72年]。DNA和RNA变化相关红外显微镜与磷酸和/或磷酸二酯在1234厘米⁻¹和1063厘米⁻¹( ν(PO₂),1165厘米⁻¹( ν(切断),1040厘米⁻¹到1110厘米⁻¹( ν(切断))( 32, 67年, 68年, 71年]。1040厘米之间的范围⁻¹到1110厘米⁻¹是最有可能的关联 ν从核糖(切断)伸展振动 ν(切断)骨架振动在RNA和DNA。此外,核酸磷酸二酯组的对称伸缩振动强烈相关DNA和RNA的变化( 71年]。

此外,我们为每个光谱方法建立多元模型结合formalin-fixed和nonfixed组织数据集。因为邻近组织横截面formalin-fixed或保持本地,nonfixed横截面不formalin-fixed的完全相同。因此,病理学家需要单独检查每个横截面,以确保一个视觉匹配nonfixed和固定的组织样本。此外,脑肿瘤组织不均匀,导致更大的连续横截面之间的结构差异。

样品根据恶性肿瘤的特点就是证明不仅与单一模型的制备技术与组合模型也包含nonfixed和formalin-fixed光谱。结合的聚类模型的控制效果不是(nonfixed和formalin-fixed)的制备过程,但不同的组织样本在不同恶性肿瘤。在此基础上观察,我们假设每个脑瘤的nonfixed和formalin-fixed部分具有可比性。

在表 2,所有的计算模型质量参数为每个模型进行了总结。所有值混淆矩阵的计算。模型的预测的准确性是根据病理学家的任务。所有类都有相同的大小,他们是平等的。因此,敏感性,特异性,假阳性率,精度为每个组织样本平均值在这个模型中,可以计算的基础上的混淆矩阵所示的补充材料(可用 在这里)。灵敏度或真阳性率意味着,当它实际上是,通过病理学家的假设,“是的,”多久模型预测“是的。“专一性描述,当它实际上是“不,”模型预测它多久”。“当模型预测组织样本为“是的,“多久这所描述的预测是正确的精度。高值灵敏度、特异性和显示一个好的模型精度质量。另一方面,一个更小的假阳性比率表明一个更好的模型。根据表 2,所有的模型和方法表现出值精度优于70%,敏感性和特异性。生物样本的统计数据,这些都是可接受的值( 34]。在所有情况下,formalin-fixed模型更准确和有更少的方差作为nonfixed模型。作者确定的快速降解nonfixed样品测量过程中作为一个可能的原因。

比较光谱方法亦然,红外光谱收益率和最好的质量参数,直接跟着船光谱学。ELS光谱学,nonfixed横截面模型良好的价值观有近10%低于formalin-fixed模型。这可能是由于灵敏度的方法,因为它检测到小改变之前,他们用眼睛是可见的( 35- - - - - - 37, 66年]。总的来说,ELS)更准确地检测衰老和退化nonfixed横截面比其他调查技术。紫外吸收光谱的nonfixed模型可能是受到同样的效果。激发光的高能源可以加速组织的退化过程比其他激励源红外像碳硅棒。这种假设似乎是合理的,我们有一个更好的密切紫外线spectroscopic-based formalin-fixed横截面模型。

总的来说,大多数模型的质量参数略好formalin-fixed横截面考虑所有三种光谱方法。这也可以观察到PCA分数情节(数字 2(e) - 2(h), 3(e) - 3(h)和 4(e) - 4(h))的改进集群分离和不那么明显的分散在每个集群。