吸收和散射对埋藏肿瘤荧光的影响

摘要

荧光光谱法被广泛应用于生物医学光学的诊断和手术切除肿瘤。这项工作研究了激光诱导嵌入在混浊介质荧光夹杂物的荧光光谱。405 nm laser diode is used for exciting buried protoporphyrin- (PpIX) based inclusions in brain-like optical phantoms. Effects of scattering and absorption of the turbid medium on the recorded fluorescence signal and depth-resolved fluorescence were studied. Results show that optical properties of the surrounding turbid medium influence the intensity of the fluorescence signal. Absorption coefficient of the surrounding medium is the major contributor to the fluorescent signal. Analysis of the recorded fluorescence spectra shows that the effect of absorption coefficient is larger than the effect of scattering coefficient on the fluorescence intensity by nearly fivefold. The findings indicate that the fluorescence signal could be used as a biomarker of optical property variations through different stages of malignancy. This can enhance the detectability of malignant tissue for diagnostic and surgical purposes as well.

一。介绍

手术切除肿瘤肿块是治疗癌症最常用的方法[1]然而，这些程序的精确性和有效性在医学上越来越具有挑战性[2]。肿瘤的位置可以通过在明亮的光线下的目视检查以及先进的外科导航系统(包括计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)和术中超声)提供的信息在术中确定[3.]. 然而，这些常规成像技术的准确性不足以定位肿瘤，特别是埋伏的肿瘤[4]。因此，迫切需要开发一种有效的工具，能够在术中以高灵敏度和高特异性检测内嵌肿瘤。在过去的二十年中，由于肿瘤定位的安全性和高效性，越来越多的人对光学测量产生了兴趣[5]。为了满足这一需要，已经开发并测试了几种基于光学光谱的技术[6]。荧光光谱法是一种很有前途的用于这一目的的光学模式[7]。它是在激发方面以及检测所述表面上的的出射信号的非侵入性技术。所测量的信号包含关于浓度和与该下层组织的功能和生理特性可定量地确定感兴趣的目标荧光团的位置信息。因此，荧光光谱法提供了一种用于区分健康组织和肿瘤组织[潜在光学技术8]。

荧光光谱已经高度发展为肿瘤手术使用的光学对比度提供的原卟啉IX (PpIX)，这是内生合成的肿瘤细胞给药后δ氨基乙酰丙酸（ALA），而PpIX的是在血红素周期的天然物质，其迅速从组织消除[9]. 原卟啉IX吸收波长为405 nm的激光。PpIX分子在635 nm和704 nm处重新发射荧光光谱，并有明显的峰值[10]. 因此，原卟啉IX（PpIX）是一种光敏剂和荧光团，对实验性光基础治疗和手术中可疑组织的诊断评估都很有意义[11]。

尽管如此，许多以前的研究都集中在浅表肿瘤开发的光学方法，以便肿瘤切除过程中显示正常和癌变组织之间的边界[12]. 与此相反，一些研究已经研究了皮下肿瘤的荧光光谱和介质光学陶瓷对荧光信号的影响。斯瓦林等人。[13]研究了光学体模中从地下荧光层发出的荧光信号的光谱变化。Svensson和Andersson-Engels也研究了使用蒙特卡罗方法模拟由于嵌入荧光包裹体引起的光谱变化[14]. 最近，人们发明了宏观光学成像技术来估计光学组织模拟混浊介质中的荧光深度[15作为一个635nm激光二极管被用于激励。

据我们所知，周围的光学性质对从地下肿瘤中检测到的荧光的影响还没有得到彻底的研究;因此，光学系数的独立效应不需要单独量化。

本工作的目的是在组织模拟光学模型中，实验研究深度分辨荧光光谱，该模型包含位于不同深度的嵌入PpIX基荧光内含物。讨论了吸收和散射系数对荧光信号的影响。

2。材料和方法

图中描绘了用于荧光测量的光学仪器的示意图1。荧光包体由盛满浓度为3 mg/mL的PpIX溶液的圆柱形塑料管制成。圆柱体的长度为5毫米，直径为2毫米。包裹体在不同深度的浑浊介质中埋藏。本研究中所有的光学幻影都被安排在12孔微波井中。

光源为405纳米光纤耦合二极管激光器（0405纳米13A，立陶宛集成光学公司），激光功率以20兆瓦的连续波模式提供给样品。用于收集发射的荧光信号，直径为400 的收集光纤（海洋光学公司）μ使用m。该光纤连接到一个微型光谱仪(USB4000, Ocean Optics Inc.)。美国)。光谱仪通过USB电缆连接到计算机，以获取荧光光谱。采集到的光谱的记录数据和信号处理由SpectraSuit软件控制(海洋光学公司，2011)。

为了量化光学特性对荧光强度的影响，研究了两组主要模拟生物组织光学特性的光学幻影。光学性质被定义为覆盖健康脑组织和癌变脑组织的相应值。为了对周围介质的吸收系数的影响，建立了四组模型。吸收系数取值范围为0.5 ~ 2mm⁻¹. 对于每一个吸收系数值，制作了5个光学模型的子集，对应于PpIX包体的5个深度，即1、3、5、7和10 mm。同样，为了量化周围介质的散射效应，又构造了四组光学模型。散射系数在10～50 mm之间⁻¹。对于每一个散射系数值，制作了5个光学幻像的子集，分别对应于PpIX包含物的5个深度，即1、3、5、7和10毫米。

三。结果和讨论

所有PpIX包体荧光测量均在黑暗的实验室环境中进行。作为初步测量，五个散射系数值范围从1到100毫米⁻¹构建并安排在微孔中，然后测量嵌入包体的荧光光谱。数字2示出了荧光光谱散射系数的不同值。

荧光信号的强度与光体的散射功率成正比。从图中可以看出2即荧光强度为50和100毫米⁻¹是大致相同的。即，荧光信号可达到的散射系数的较高值的饱和度水平。数字3(一个)显示在光学体模内不同深度的PpIX包体的荧光检测结果。包合深度为1 ~ 10 mm。在这种情况下，可以注意到荧光强度与深度成反比。这种强度的下降可以被拟合到指数曲线上，如图所示3 (b)。

所有的PpIX荧光光谱在635和704 nm处都有明显的峰，因此，在这些特定波长处的荧光强度值被用来进一步分析测量的光谱。绘制了不同深度和吸收系数范围(从0.5到2毫米)的荧光强度的平均值和标准差⁻¹)如图所示4（甲）- - - - - -4（e）. 所有产生的曲线显示，在所有研究深度的荧光强度明显下降。荧光强度的降低可以解释为由于吸收而到达PpIX包体的光子数量的减少。

此外，还绘制了不同深度和散射系数范围（从10到50 mm）下荧光强度的平均值和标准偏差⁻¹)，如图所示5（甲）- - - - - -5 (e)）。所有产生的曲线显示为PpIX的夹杂物的所有调查的深度，荧光强度显着增加。这种增加的荧光信号可以归因于光子激发的PpIX夹杂物由于散射的增加的数量。

值得注意的是，所有的曲线都是用数字表示的4和5显示荧光变化的非线性行为作为吸收和散射系数的函数。这与之前的研究[协定16]。

在Markwardt等人进行的一项研究中。[17，通过限制激发时间，避免了光漂白对记录的荧光信号的影响。在这项研究中，每个光学体模包含一个圆柱形的包裹体，该包裹体在给定的激发时间内被激发;因此，光漂白的效果是标准化的所有样本。

此外，定量分析光学性质的变化对记录的荧光信号的影响具有重要意义。为此，分别分析了散射和吸收的变化效应。首先，对于吸收系数，每个深度在上述吸收系数范围内635nm处的荧光强度衰减按下式计算: 在哪里是给定深度的PpIX包裹体在635 nm处的强度变化，是指本研究所用吸收系数最大的吸收介质中的荧光强度，即对应于2 mm的值⁻¹，和本研究中使用的吸收系数最小的吸收介质中的荧光强度是否对应0.5 mm的值⁻¹. 吸收的变化百分比如图所示6(一)。

其次，对于散射系数，在上述散射系数范围内，计算每个深度635 nm处的荧光强度升高，如下式所示 在哪里是给定深度的PpIX包裹体在635 nm处的强度变化，为本研究所用散射系数最大的散射介质中的荧光强度，即对应于50 mm的值⁻¹，和在本研究中使用的散射系数最小的散射介质中，荧光强度是否对应于10 mm的值⁻¹. 数字6(一)显示由于所有深度的散射而引起的变化百分比。

可以通过取所有对应深度的平均值来评估变化的总体量化，如图所示6 (b)。

可以清楚地注意到，吸收和散射的变化是可比较的(吸收为44%，散射为55%)。然而，散射系数和吸收系数的对应范围是不同的。由此可见，介质的吸收系数对被测荧光的影响远大于散射系数的影响。也就是说，内含物的荧光光谱对吸收系数的变化更为敏感。

考虑到散射和吸收介质中荧光强度变化的非线性趋势，可以将荧光强度与光学性质之间的关系转化为线性关系，即记录的荧光量的对数。结果表明，荧光强度的对数与吸收系数的变化成反比，荧光强度的对数与散射系数的变化成正比。因此，根据本研究中使用的光学特性范围，增量为1 mm⁻¹吸收系数使荧光强度降低18%。相反，散射系数增加了1 mm⁻¹相当于4％，以增加荧光信号。也就是说，吸收系数的效果比通过将近五倍散射对荧光强度系数的效果大。

Stepp等人。[18]测量脑组织的光学性质通过在大鼠中肿瘤发展的不同阶段，并且他们发现吸收系数很大程度上影响在肿瘤的发展过程。这表明荧光信号可以被用作通过恶性肿瘤的不同阶段的光学特性的变化的生物标志物。

还导出了估算荧光包裹体深度的分析方法[19]。这种方法要求事先了解混浊介质的光学特性。然而，在临床应用中，荧光浓度和光学性质是未知的，因此本研究在将荧光强度与光学性质相关联方面的潜在贡献。

未来工作的另一个领域可以考虑正在使用的其他激发波长[20.]用于激发生物荧光团。

目前工作的一个可能的限制是在吸收和散射测量荧光信号的注意偏差。这可以解释为不可避免的错误定位光纤探头在光学幻影。然而，这一挫折对总体结果的影响可以忽略不计。

4.结论

本文试图通过实验研究介质的光学性质对PpIX包裹体产生的深度分辨荧光的影响。结果表明，吸收系数对荧光强度的影响远大于散射系数。因此，嵌入的荧光包裹体对周围介质吸收系数的变化更为敏感。这在生物医学光学测量中有着深远的意义，例如脑肿瘤，它含有一定浓度的PpIX，并被具有不同光学特性的生物组织所包围。这项研究还可以扩展到研究与不同生物组织相关的其他光学特性，从而提高生物医学光学诊断的准确性。

数据可用性

支持本研究结果的数据可根据要求从通信作者处获得。

利益冲突

作者声明本论文的发表不存在利益冲突。

致谢

这项工作由大马士革大学资助。

工具书类

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