细菌粘附的影响显示接枝链的非侵入性和频率代光谱学

文摘

在生物医学和食品行业,表面由细菌殖民化是有害的:它会导致生物膜的形成,微生物财团浮游细菌对抗生素的抗药性要比。为了设计材料能够限制生物膜的形成,影响细菌的材料必须为特征。在这项工作中,定义良好的表面组成的自组装单层(SAM) octadecanethiol (ODT)表面探测到黄金原位。使用飞秒的山姆构象得到振动频率和一代(SFG)光谱。这种技术提供了选择性的分子振动信号接口。ODT山姆的行为在不同的环境中研究:在暴露在空气中,在水,亲水或疏水Lactococcus lactis细菌。造型实验SFG光谱揭示了一个可衡量的山姆构象的变化取决于环境,尤其是在hydrophilic-hydrophobic性格。

1。介绍

所有表面暴露于实体如细菌生活在自然环境中。最初的表面由致病性细菌的殖民问题在许多领域如生物医学或食品行业(1,2]。事实上,它发展成为一个生物膜的形成,一个三维组织细菌,细菌对抗生素的抗药性和杀菌剂比浮游导致院内或food-born感染。因此,科学界是动员理解一类过程所涉及的机制,以抑制和/或控制它和寻找新的预防生物膜控制线路。

细菌坚持一种惰性表面通过共价分子的相互作用,如范德华静电,路易斯酸/碱交互,根据细菌的特点(肽聚糖自然、细胞壁蛋白质和多糖、细胞外附录作为pili等)和表面的物理化学性质3,4]。实验进行了理解细菌粘附在功能化聚合物或接枝链,通过改变地形,疏水/亲水的表面,等等(5,6]。然而,预测模型和实验结果之间差异出现(7,8),可能由于缺少非侵入性的表面特性在分子水平上,当细菌是表面上的。

本研究的目的是描述的初始事件细菌殖民化与方法能够提供表面在分子水平上的信息原位。振动频率和一代(SFG)光谱采用首次探测特定的表面:自组装单层(SAM)的octadecanethiol (ODT)在金表面由细菌殖民。这种技术,基于二阶非线性光学,包括重叠在时间和空间中红外(碳氢键带波长调谐在这种情况下),可见光束。这个光谱的主要兴趣是SFG反应仅仅源自noncentrosymmetric区域(一般来说,大量的固体不为SFG信号)允许获得特别的分子光谱特征相关的表面可以其分子构象。SFG光谱无损方法,能很好地适应研究选择性生物分子系统的接口(9- - - - - -11由于其高灵敏度。先前的SFG研究描述了构象ODT山姆暴露在空气中(12]。在这部作品中,构象ODT山姆决定当这个表面暴露在纯水和水溶液中亲水或疏水Lactococcus lactis细胞(不致病的模型链球菌agalactie负责任的严酷的新生儿感染)。

结果表明,山姆接触细菌的光谱特征可以发现使用飞秒IR-visible和频率代光谱学。此外,造型实验SFG光谱揭示了山姆构象的可衡量的变化取决于hydrophobic-hydrophilic环境的角色。这些结果表明,细菌能够在分子水平上修改他们的支持(13]。因此,这一结果应该考虑新的生物材料的设计。

2。材料和方法

2.1。材料

基质由硼硅玻璃涂有250海里的多晶金膜厚度和退火在烤箱在30秒600°C。创建的自组装单层octadecanethiol金色涂布衬底上使用以下过程:涂层表面浸在1毫米ODT解决方案在绝对乙醇3小时,绝对乙醇冲洗和干燥氮气流。如前所述(12),我们在这些条件获取一个ODT山姆~ 2纳米的厚度。这些基质表面形貌的特征是原子力显微镜(AFM)联系方式(13]。金表面形貌呈现plantens 1 - 2μ米²清楚地说明20 - 30 nm的凹槽深度。此外,水接触角进行测量:ODT山姆的接触角在所有表面强疏水性质。

2.2。Lactococcus lactis细菌

用于细菌粘附在ODT地对空导弹l . lactis ssp。cremoris菌株MG1363及其导数突变PRTP +表达PRTP蛋白酶(14,15]。细菌是储存在−20°C M17肉汤(Difco)含有0.5% (w)卷的葡萄糖和50%的甘油(卷/期)。他们两次亚文化M17-glucose肉汤30°C,直到固定相。最后,他们培养过夜(工作文化)在30°C。来自最终工作文化的同时,90毫升的细菌被离心收获(10分钟,7000克,4°C),洗了两次,在25毫升蒸馏水resuspended最终细胞密度约细胞/毫升。

微生物粘附溶剂(垫)评估法的疏水/亲水特性两个菌株的细胞表面。野生型的l . lactis应变MG1363呈现疲软的亲和力疏水癸烷和十六烷表明亲水细胞壁,而细胞菌株MG1363 PRTP +提出强烈的亲和力来显示他们的强疏水性质。

2.3。细菌粘附

探讨ODT山姆对细菌粘附,~ 200的体积μ细菌悬液的L 10⁹细胞/毫升蒸馏水是沉积在ODT山姆。解决方案是允许孵化与暂停90分钟,然后洗液体除去non-adherent细菌。CaF SFG测量₂板了,以确保在水面上一层均匀的薄水样本。它的厚度是5 ~μm,足够薄允许红外辐射到样品。

控制原位细菌表面覆盖ODT山姆,扫描电镜(SEM,前面描述的13),进行了显微数字化测量。对数字化的图像、附着细菌与核酸染料染色acridin橙色(0.01%水)在黑暗中15分钟。染料溶液清洗,取而代之的是纯水前安装示例莱卡DM2显微镜下装有一个奥林巴斯Camedia C5060WZ数码相机。两个显微镜显示我们的程序确保均匀细菌存款。细菌表面覆盖率估计%的ODT山姆表面,对应于每个细菌2200 ODT分子的直径。

形态学上附着的细菌ODT山姆被扫描电镜分析。Lactococcus lactis细胞保持其特性ovococcoid功能化金表面粘附后形态。没有证据表明在我们的细菌是优先的SEM图像集合本地化凹槽的电影。此外,没有细胞外基质表面上证明实验条件允许我们在细菌殖民化的第一步。

2.4。SFG技术

详细信息我们的宽带SFG设置中可以找到我们以前公布的工作(12]。可调红外脉冲(4μJ, 145 fs和150厘米⁻¹带宽)和“可见”脉冲(800海里,2μ1 - 6 p J,可调时间和带宽≡15 - 2.5厘米⁻¹)是叠加在样本在共线copropagating配置~ 66°的入射角p偏振。在这个实验几何,样品表面上的激光光斑大小~ 100μm。生成的SFG信号期间收集的100 - 300秒获得一个可以接受的信号噪声比,分析了高分辨率的探测系统(光谱仪的分辨率0.4厘米⁻¹在650 nm,配有冷却CCD相机)。振动带叠加到所谓nonresonant背景红外激光的光谱剖面和来自广泛的共振响应的黄金表面电子态。为了deconvolute振动乐队从这个nonresonant背景,实验光谱安装标准公式: 在哪里)是红外激光光谱剖面记录在砷化镓参考的样品只提供了一个nonresonant SFG信号。这个词非盟常数nonresonant响应阶段吗和 ,是洛伦兹的振幅、频率和一半的宽度模式,分别。与表面振动能量的衰减,都应该是相同的CH模式。砷化镓光谱测量空气的引用。因此,红外激光剖面必须纠正的水层吸收周围的细菌。在我们的拟合过程中,著名的CH拉伸频率是固定的,每个拉伸模的宽度是相同的所有乐队。阶段的价值在不同的媒体也是固定的,对应于平均获得超过50 ~实验。这种限制数量的安装参数确保我们不能获得多个解决方案(16]。我们只承认相变从空气到水,因为第一层水可能影响静电非盟衬底。

3所示。结果

3.1。ODT山姆在空气中

的SFG光谱波数范围2800 - 3050厘米⁻¹ODT山姆多次报道的文献(谱图中未显示)。我们分析了它在细节13)和提取两个ODT分子构象的山姆。光谱主要由三个甲基的强大的乐队:甲基对称拉伸乐队在2875厘米⁻¹,CH的费密共振₃CH的对称模式有两个澳洲航空公司₃在2936厘米弯曲模式⁻¹和甲基不对称拉伸乐队在2964厘米⁻¹。常规的CH₂带强度是2850厘米⁻¹(对称拉伸模式)和2918厘米⁻¹(不对称)。ch的₂s波段频率转移到更高频率(2905和2973厘米⁻¹),很弱。

3.2。ODT山姆在蒸馏水

的SFG ODT山姆在蒸馏水是显示在图1(一)。图1 (b)显示了deconvoluted振动CH的乐队₃和CH₂组根据(2。1)。甲基乐队强度是不同的在水和空气的相对强度CH₃不对称模式是在水中的速度比在空气中的小。

为了量化的强度变化ODT山姆甲基乐队,我们定义了现象学参数等于强度比值CH₃对称和CH₃不对称振动: 振动的强度在哪里等于。的参数测量空气ODT相比当ODT山姆暴露于水。

3.3。ODT山姆与亲水和疏水性细菌

我们调查的影响细菌粘附到ODT山姆。亲水性和疏水性细菌,ODT山姆SFG光谱变化的模式相比,在水(谱图中未显示)。两株,实验光谱是安装在我们的模型作为细菌的函数覆盖范围从0到100%。得到最适合的细菌的报道~ 60%在良好的协议与覆盖率估计来自荧光和SEM图像。振动模式的相对强度,因此值的显著差异(图中发现水1 (b))。此外,价值取决于亲水(/疏水()的细菌。

4所示。讨论

ODT分子的构象变化在山姆可以从实验中提取相对强度。由于山姆之间的相互作用,水,和细菌都很弱,我们假设分子只调整旋转的轴的碳链。这样一个甲基的方向旋转变化,由SFG容易检查出来。振动模式的强度取决于其偶极矩的方向对表面正常。对金属,只有沿着曲面法线的投影转换时刻SFG贡献显著。因此,CH₃对称拉伸强当甲基对称轴垂直于表面。相比之下,双重退化的过渡时刻不对称垂直于拉伸模式CH₃因此,对称轴,最少的时候这个轴是垂直于表面。它的价值的结果增加时,甲基终端ODT山姆提出的一部分。

定量地评估ODT甲基取向,SFG光谱建模ODT链的执行根据模型所描述的布吉尼翁et al。12]。模型可以计算吸附的SFG频谱alkanethiol分子烷基链的构象。它是基于从头开始张量计算的分子推导模式的个人甲基和亚甲基组,它考虑了分子构象以及几何和光学参数,如入射角度,光束的偏振和光学索引。此外,它成立ODT山姆结构包括两种类型的分子,下标A和B, C,它们具有不同的旋转平面的平均分子轴。考虑SFG频谱中的数据建模,甲基轴倾角的ODT萨姆是获得(图2)。

当暴露在空气中,甲基轴倾角是55.1/15.8°分子A和B,分别(图2(A))。

甲基甲基SFG强度发生非常敏感轴倾斜角度:5°的改变结果的两倍参数。因此,我们预计SFG将允许探索山姆的构象变化甚至在他们是由于弱相互作用的情况。当暴露于蒸馏水,CH的倾斜₃轴略有减少的价值1.7和2.5°分子A和B对空气,分别为:水环境对ODT“刷效应”(图2(B))。

对于细菌粘附,光谱的变化值的变化可能导致从ODT山姆构象的改变,和/或从一个额外的信号从细菌本身。我们已经记录了SFG光谱在裸露的金表面细菌粘附后(谱图中未显示):只有nonresonant信号,表明细菌不会导致SFG谱,观察到的相对强度变化的结果只能从ODT山姆构象的改变。在亲水的情况下细菌粘附到衬底上,“刷效应”是增强对水(图2(C))。甲基倾斜角度相应降低3.6°,4.4°的A和B分子相比ODT山姆构象在水里。相反,疏水性细菌减少的影响值,所以平ODT山姆:甲基的3.3°,4.9°倾角增加A和B分子对水(图2(D))。

这些不同的行为可以被考虑合理化的疏水/亲水和疏水/疏水相互作用[17]。ODT山姆,CH组成₂和CH₃组织,是一个疏水表面。当ODT山姆接触水分子极性和亲水性,系统往往保持分开在两个阶段,这是最好的实现在表面点的甲基终端组。这最小化两个阶段之间的相互作用,最大化溶剂内的氢键网络,导致形成一个有序的水层的顶部ODT山姆。

在疏水的情况下Lactococcus lactis附着力,只有范德瓦耳斯相互作用存在和不存在相分离。相互作用最大化当ODT山姆夷为平地,因为附近的亚甲基甲基终端部分也可以与细菌和互动有助于吸引人的交互。亲水细菌粘附,我们期望行为类似于水:确实如此。有趣的是,刷的效果比水大的细菌。然而,细菌膜的复杂性,不可能提出一个简单的解释这个观察。

5。结论

目前的结果表明,细菌粘附的影响可以观察到SFG光谱和细菌改变表面的构象,这里一个ODT山姆在金的表面上。我们注意到的高灵敏度SFG分子构象:一个小的变化的甲基倾角产生一个可衡量的变化SFG频谱。水或细菌的影响包括在山姆只有很小的调整角度,这是发现依赖的疏水或亲水特征与山姆交互媒介。这表明细菌粘附的影响主要取决于ODT山姆和Lactococcus细菌,细菌的物理化学性质。它还意味着工程功能化聚合物或其他表层,以防止表面被殖民(7,8)必须考虑这一事实保护层的细菌可能会改变构象。这种现象可以解释观察到的差异之间的预测模型和实验附着力测量。总之,这项研究表明,一般的理解之间的交互细菌和所需的表面在分子水平上设计新材料有效预防细菌污染。其他有机分子如蛋白质的存在在周围的介质或生物膜的构象也会影响表面,它必须考虑18]。这是现在在调查之中。

承认

作者要感谢MIMA2平台(INRA,厚重的,法国)允许我们使用扫描电子显微镜和CPBM LUMAT平台(法国奥赛)使用他们的生物基础设施。

引用

1. d·林赛和a·冯·圣”在临床细菌生物膜:卫生保健专业人士应该知道,“《医院感染,卷64,不。4、313 - 325年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. a·c·l . Wong“生物膜在食品加工环境中,”乳品科学杂志》,卷81,不。10日,2765 - 2770年,1998页。视图:谷歌学术搜索
3. m . r . Nejadnik h·c·范德梅w . Norde和h . j . Busscher“聚合物刷胶细菌的粘附和生长,”生物材料卷,29号30日,第4121 - 4117页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. Speranza g, g . Gottardi c .派德左利的男子et al .,“化学交互作用在聚合物表面细菌粘附,”生物材料,25卷,不。11日,第2037 - 2029页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. k . m . Wiencek m·弗莱彻,“细菌粘附羟基和methyl-terminated alkanethiol自组装单层膜,“细菌学期刊,卷177,不。8,1959 - 1966年,1995页。视图:谷歌学术搜索
6. c . j . p . Boonaert y . f . Dufrene s . r . Derclaye和p·g . Rouxhet“粘附的Lactococcus lactis下层模型:直接接口的研究,“胶体和表面B,22卷,不。3、171 - 182年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. g . Cheng z,陈,j·d·布莱恩和江,“抑制细菌粘附和两性离子表面生物膜的形成,”生物材料,28卷,不。29日,第4199 - 4192页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. p . m . Sivakumar g·艾耶l . Natesan, m·多布。”$3^{\prime }$-Hydroxy-4-methoxychalcone作为一个潜在的抗菌涂层高分子生物材料,”应用表面科学,卷256,不。20日,第6024 - 6018页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. t . s . Koffas c . c . Lawrence j . Kim和g . a . Somorjai”检测的乳胶微球固定化蛋白IR-visible和频率生成和扫描力显微镜”朗缪尔,19卷,不。9日,第3566 - 3563页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. s . m . j . Wang巴克,z . Chen”和频率代振动光谱学研究蛋白质吸附,”物理化学学报B,卷106,不。44岁,11666 - 11672年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. c·豪厄尔·m·o·Diesner m . Grunze和p . Koelsch”与sum-frequency-generation光谱探测细胞外基质”,朗缪尔,24卷,不。24日,第13821 - 13819页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. 布吉尼翁,w .郑,s . Carrez a . Ouvrard f·弗尔涅和h . Dubost”推导完整的分子自组装alkanethiol分子的构象和频生成振动光谱,”物理评论B,卷79,不。12篇文章ID 125433 2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. e . Bulard z郭,w .郑et al .,“非侵入式振动SFG光谱显示,细菌粘附可以改变接枝的构象”刷“山姆,链”朗缪尔,27卷,不。8,4928 - 4935年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. m·p·Chapot-Chartier e . Vinogradov i Sadovskaya et al .,“细胞表面的Lactococcus lactis防护多糖薄膜覆盖,“生物化学杂志,卷285,不。14日,第10471 - 10464页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. o . Habimana c·勒高夫诉Juillard et al .,“积极作用的细胞壁锚定蛋白酶PrtP lactococci附着力,”BMC微生物学第三十六条,卷。7日,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. b . Busson和a . Tadjeddine”性的参数提取共振二阶非线性光学光谱,”物理化学学报C,卷113,不。52岁,21895 - 21902年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. J.-C。j . c . Depezay Chottard, j . p . LerouxChimie Fondamentale练习曲以及et Medicales2: Moleculaire结构,赫尔曼,巴黎,法国,1995年。
18. 黄懿慧弗里德曼和r . j .,”简明回顾生物材料表面细菌粘附机制,“生物医学材料研究杂志》上,43卷,不。3、338 - 348年,1998页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2012艾米莉Bulard et al。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。