1。介绍gydF4y2Ba
所有表面暴露于实体如细菌生活在自然环境中。最初的表面由致病性细菌的殖民问题在许多领域如生物医学或食品行业(gydF4y2Ba
1gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba
2gydF4y2Ba ]。事实上,它发展成为一个生物膜的形成,一个三维组织细菌,细菌对抗生素的抗药性和杀菌剂比浮游导致院内或food-born感染。因此,科学界是动员理解一类过程所涉及的机制,以抑制和/或控制它和寻找新的预防生物膜控制线路。gydF4y2Ba
细菌坚持一种惰性表面通过共价分子的相互作用,如范德华静电,路易斯酸/碱交互,根据细菌的特点(肽聚糖自然、细胞壁蛋白质和多糖、细胞外附录作为pili等)和表面的物理化学性质gydF4y2Ba
3gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba
4gydF4y2Ba ]。实验进行了理解细菌粘附在功能化聚合物或接枝链,通过改变地形,疏水/亲水的表面,等等(gydF4y2Ba
5gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba
6gydF4y2Ba ]。然而,预测模型和实验结果之间差异出现(gydF4y2Ba
7gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba
8gydF4y2Ba ),可能由于缺少非侵入性的表面特性在分子水平上,当细菌是表面上的。gydF4y2Ba
本研究的目的是描述的初始事件细菌殖民化与方法能够提供表面在分子水平上的信息gydF4y2Ba
原位gydF4y2Ba 。振动频率和一代(SFG)光谱采用首次探测特定的表面:自组装单层(SAM)的octadecanethiol (ODT)在金表面由细菌殖民。这种技术,基于二阶非线性光学,包括重叠在时间和空间中红外(碳氢键带波长调谐在这种情况下),可见光束。这个光谱的主要兴趣是SFG反应仅仅源自noncentrosymmetric区域(一般来说,大量的固体不为SFG信号)允许获得特别的分子光谱特征相关的表面可以其分子构象。SFG光谱无损方法,能很好地适应研究选择性生物分子系统的接口(gydF4y2Ba
9gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba
11gydF4y2Ba 由于其高灵敏度。先前的SFG研究描述了构象ODT山姆暴露在空气中(gydF4y2Ba
12gydF4y2Ba ]。在这部作品中,构象ODT山姆决定当这个表面暴露在纯水和水溶液中亲水或疏水gydF4y2Ba
Lactococcus lactisgydF4y2Ba 细胞(不致病的模型gydF4y2Ba
链球菌agalactiegydF4y2Ba 负责任的严酷的新生儿感染)。gydF4y2Ba
结果表明,山姆接触细菌的光谱特征可以发现使用飞秒IR-visible和频率代光谱学。此外,造型实验SFG光谱揭示了山姆构象的可衡量的变化取决于hydrophobic-hydrophilic环境的角色。这些结果表明,细菌能够在分子水平上修改他们的支持(gydF4y2Ba
13gydF4y2Ba ]。因此,这一结果应该考虑新的生物材料的设计。gydF4y2Ba
2。材料和方法gydF4y2Ba
2.1。材料gydF4y2Ba
基质由硼硅玻璃涂有250海里的多晶金膜厚度和退火在烤箱在30秒600°C。创建的自组装单层octadecanethiol金色涂布衬底上使用以下过程:涂层表面浸在1毫米ODT解决方案在绝对乙醇3小时,绝对乙醇冲洗和干燥氮气流。如前所述(gydF4y2Ba
12gydF4y2Ba ),我们在这些条件获取一个ODT山姆~ 2纳米的厚度。这些基质表面形貌的特征是原子力显微镜(AFM)联系方式(gydF4y2Ba
13gydF4y2Ba ]。金表面形貌呈现plantens 1 - 2gydF4y2Ba
μgydF4y2Ba 米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba 清楚地说明20 - 30 nm的凹槽深度。此外,水接触角进行测量:ODT山姆的接触角gydF4y2Ba
109年gydF4y2Ba
±gydF4y2Ba
2gydF4y2Ba
°gydF4y2Ba
在所有表面强疏水性质。gydF4y2Ba
2.2。<斜体> Lactococcus lactis < /斜体>细菌gydF4y2Ba
用于细菌粘附在ODT地对空导弹gydF4y2Ba
l . lactis ssp。cremorisgydF4y2Ba 菌株MG1363及其导数突变PRTP +表达PRTP蛋白酶(gydF4y2Ba
14gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba
15gydF4y2Ba ]。细菌是储存在−20°C M17肉汤(Difco)含有0.5% (w)卷的葡萄糖和50%的甘油(卷/期)。他们两次亚文化M17-glucose肉汤30°C,直到固定相。最后,他们培养过夜(工作文化)在30°C。来自最终工作文化的同时,90毫升的细菌被离心收获(10分钟,7000克,4°C),洗了两次,在25毫升蒸馏水resuspended最终细胞密度约gydF4y2Ba
4.10gydF4y2Ba
9gydF4y2Ba
细胞/毫升。gydF4y2Ba
微生物粘附溶剂(垫)评估法的疏水/亲水特性两个菌株的细胞表面。野生型的gydF4y2Ba
l . lactisgydF4y2Ba 应变MG1363呈现疲软的亲和力gydF4y2Ba
(gydF4y2Ba
7gydF4y2Ba
±gydF4y2Ba
5gydF4y2Ba
%gydF4y2Ba
)gydF4y2Ba
疏水癸烷和十六烷表明亲水细胞壁,而细胞菌株MG1363 PRTP +提出强烈的亲和力gydF4y2Ba
(gydF4y2Ba
90年gydF4y2Ba
±gydF4y2Ba
5gydF4y2Ba
)gydF4y2Ba
%gydF4y2Ba
来显示他们的强疏水性质。gydF4y2Ba
2.3。细菌粘附gydF4y2Ba
探讨ODT山姆对细菌粘附,~ 200的体积gydF4y2Ba
μgydF4y2Ba 细菌悬液的L 10gydF4y2Ba9gydF4y2Ba 细胞/毫升蒸馏水是沉积在ODT山姆。解决方案是允许孵化与暂停90分钟,然后洗液体除去non-adherent细菌。CaF SFG测量gydF4y2Ba2gydF4y2Ba 板了,以确保在水面上一层均匀的薄水样本。它的厚度是5 ~gydF4y2Ba
μgydF4y2Ba m,足够薄允许红外辐射到样品。gydF4y2Ba
控制gydF4y2Ba
原位gydF4y2Ba 细菌表面覆盖ODT山姆,扫描电镜(SEM,前面描述的gydF4y2Ba
13gydF4y2Ba ),进行了显微数字化测量。对数字化的图像、附着细菌与核酸染料染色acridin橙色(0.01%水)在黑暗中15分钟。染料溶液清洗,取而代之的是纯水前安装示例莱卡DM2显微镜下装有一个奥林巴斯Camedia C5060WZ数码相机。两个显微镜显示我们的程序确保均匀细菌存款。细菌表面覆盖率估计gydF4y2Ba
50gydF4y2Ba
±gydF4y2Ba
20.gydF4y2Ba
%的ODT山姆表面,对应于每个细菌2200 ODT分子的直径。gydF4y2Ba
形态学上附着的细菌ODT山姆被扫描电镜分析。gydF4y2Ba
Lactococcus lactisgydF4y2Ba 细胞保持其特性ovococcoid功能化金表面粘附后形态。没有证据表明在我们的细菌是优先的SEM图像集合本地化凹槽的电影。此外,没有细胞外基质表面上证明实验条件允许我们在细菌殖民化的第一步。gydF4y2Ba
2.4。SFG技术gydF4y2Ba
详细信息我们的宽带SFG设置中可以找到我们以前公布的工作(gydF4y2Ba
12gydF4y2Ba ]。可调红外脉冲(4gydF4y2Ba
μgydF4y2Ba J, 145 fs和150厘米gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba 带宽)和“可见”脉冲(800海里,2gydF4y2Ba
μgydF4y2Ba 1 - 6 p J,可调时间和带宽gydF4y2Ba
≡gydF4y2Ba 15 - 2.5厘米gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba )是叠加在样本在共线copropagating配置~ 66°的入射角p偏振。在这个实验几何,样品表面上的激光光斑大小~ 100gydF4y2Ba
μgydF4y2Ba m。生成的SFG信号期间收集的100 - 300秒获得一个可以接受的信号噪声比,分析了高分辨率的探测系统(光谱仪的分辨率0.4厘米gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba 在650 nm,配有冷却CCD相机)。振动带叠加到所谓nonresonant背景红外激光的光谱剖面和来自广泛的共振响应的黄金表面电子态。为了deconvolute振动乐队从这个nonresonant背景,实验光谱安装标准公式:gydF4y2Ba
(2.1)gydF4y2Ba
我gydF4y2Ba
(gydF4y2Ba
ωgydF4y2Ba
SFGgydF4y2Ba
)gydF4y2Ba
∝gydF4y2Ba
ggydF4y2Ba
(gydF4y2Ba
ωgydF4y2Ba
红外gydF4y2Ba
)gydF4y2Ba
|gydF4y2Ba
χgydF4y2Ba
NRgydF4y2Ba
⋅gydF4y2Ba
egydF4y2Ba
我gydF4y2Ba
φgydF4y2Ba
+gydF4y2Ba
∑gydF4y2Ba
vgydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba
vgydF4y2Ba
ωgydF4y2Ba
红外gydF4y2Ba
- - - - - -gydF4y2Ba
ωgydF4y2Ba
vgydF4y2Ba
+gydF4y2Ba
我gydF4y2Ba
ΓgydF4y2Ba
|gydF4y2Ba
2gydF4y2Ba
,gydF4y2Ba
在哪里gydF4y2Ba
ggydF4y2Ba
(gydF4y2Ba
ωgydF4y2Ba
红外gydF4y2Ba
)是红外激光光谱剖面记录在砷化镓参考的样品只提供了一个nonresonant SFG信号。这个词gydF4y2Ba
χgydF4y2Ba
NRgydF4y2Ba
·gydF4y2Ba
egydF4y2Ba
我gydF4y2Ba
φgydF4y2Ba
非盟常数nonresonant响应阶段吗gydF4y2Ba
φgydF4y2Ba
和gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba
νgydF4y2Ba
,gydF4y2Ba
ωgydF4y2Ba
νgydF4y2Ba
,gydF4y2Ba
ΓgydF4y2Ba
是洛伦兹的振幅、频率和一半的宽度模式gydF4y2Ba
νgydF4y2Ba
,分别。gydF4y2Ba
ΓgydF4y2Ba
与表面振动能量的衰减,都应该是相同的CH模式。砷化镓光谱测量空气的引用。因此,红外激光剖面gydF4y2Ba
ggydF4y2Ba
(gydF4y2Ba
ωgydF4y2Ba
红外gydF4y2Ba
)gydF4y2Ba
必须纠正的水层吸收周围的细菌。在我们的拟合过程中,著名的CH拉伸频率是固定的,每个拉伸模的宽度是相同的所有乐队。阶段的价值在不同的媒体也是固定的,对应于平均获得超过50 ~实验。这种限制数量的安装参数确保我们不能获得多个解决方案(gydF4y2Ba
16gydF4y2Ba ]。我们只承认相变从空气到水,因为第一层水可能影响静电非盟衬底。gydF4y2Ba
4所示。讨论gydF4y2Ba
ODT分子的构象变化在山姆可以从实验中提取相对强度。由于山姆之间的相互作用,水,和细菌都很弱,我们假设分子只调整旋转的轴的碳链。这样一个甲基的方向旋转变化,由SFG容易检查出来。振动模式的强度取决于其偶极矩的方向对表面正常。对金属,只有沿着曲面法线的投影转换时刻SFG贡献显著。因此,CHgydF4y2Ba3gydF4y2Ba 对称拉伸强当甲基对称轴垂直于表面。相比之下,双重退化的过渡时刻不对称垂直于拉伸模式CHgydF4y2Ba3gydF4y2Ba 因此,对称轴,最少的时候这个轴是垂直于表面。它的价值的结果gydF4y2Ba
RgydF4y2Ba
增加时,甲基终端ODT山姆提出的一部分。gydF4y2Ba
定量地评估ODT甲基取向,SFG光谱建模ODT链的执行根据模型所描述的布吉尼翁et al。gydF4y2Ba
12gydF4y2Ba ]。模型可以计算吸附的SFG频谱alkanethiol分子烷基链的构象。它是基于gydF4y2Ba
从头开始gydF4y2Ba 张量计算的分子推导模式的个人甲基和亚甲基组,它考虑了分子构象以及几何和光学参数,如入射角度,光束的偏振和光学索引。此外,它成立ODT山姆结构包括两种类型的分子,下标A和B, C,它们具有不同的旋转平面的平均分子轴。考虑SFG频谱中的数据建模,甲基轴倾角的ODT萨姆是获得(图gydF4y2Ba
2gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba
示意图ODT山姆构象(ODT环境强烈夸张的效果清晰)。答:在空气中。B:在蒸馏水。C和D显示甲基方向调整的两种极端的可能性所允许的旋转C支柱飞机的平均分子轴。C和D对应理想的亲水和疏水相互作用,分别。CH的偶极矩的方向gydF4y2Ba3gydF4y2Ba (对称gydF4y2Ba
μgydF4y2Ba
年代gydF4y2Ba
3gydF4y2Ba
,不对称平面gydF4y2Ba
μgydF4y2Ba
作为gydF4y2Ba
3gydF4y2Ba
知识产权gydF4y2Ba
的飞机gydF4y2Ba
μgydF4y2Ba
作为gydF4y2Ba
3gydF4y2Ba
人事处gydF4y2Ba
)也表示。甲基轴倾角的值ODT山姆在不同环境中添加如下。gydF4y2Ba
当暴露在空气中,甲基轴倾角是55.1/15.8°分子A和B,分别(图gydF4y2Ba
2gydF4y2Ba (A))。gydF4y2Ba
甲基甲基SFG强度发生非常敏感轴倾斜角度:5°的改变结果的两倍gydF4y2Ba
RgydF4y2Ba
参数。因此,我们预计SFG将允许探索山姆的构象变化甚至在他们是由于弱相互作用的情况。当暴露于蒸馏水,CH的倾斜gydF4y2Ba3gydF4y2Ba 轴略有减少的价值1.7和2.5°分子A和B对空气,分别为:水环境对ODT“刷效应”(图gydF4y2Ba
2gydF4y2Ba (B))。gydF4y2Ba
对于细菌粘附,光谱的变化gydF4y2Ba
RgydF4y2Ba
值的变化可能导致从ODT山姆构象的改变,和/或从一个额外的信号从细菌本身。我们已经记录了SFG光谱在裸露的金表面细菌粘附后(谱图中未显示):只有nonresonant信号,表明细菌不会导致SFG谱,观察到的相对强度变化的结果只能从ODT山姆构象的改变。在亲水的情况下细菌粘附到衬底上,“刷效应”是增强对水(图gydF4y2Ba
2gydF4y2Ba (C))。甲基倾斜角度相应降低3.6°,4.4°的A和B分子相比ODT山姆构象在水里。相反,疏水性细菌减少的影响gydF4y2Ba
RgydF4y2Ba
值,所以平ODT山姆:甲基的3.3°,4.9°倾角增加A和B分子对水(图gydF4y2Ba
2gydF4y2Ba (D))。gydF4y2Ba
这些不同的行为可以被考虑合理化的疏水/亲水和疏水/疏水相互作用[gydF4y2Ba
17gydF4y2Ba ]。ODT山姆,CH组成gydF4y2Ba2gydF4y2Ba 和CHgydF4y2Ba3gydF4y2Ba 组织,是一个疏水表面。当ODT山姆接触水分子极性和亲水性,系统往往保持分开在两个阶段,这是最好的实现在表面点的甲基终端组。这最小化两个阶段之间的相互作用,最大化溶剂内的氢键网络,导致形成一个有序的水层的顶部ODT山姆。gydF4y2Ba
在疏水的情况下gydF4y2Ba
Lactococcus lactisgydF4y2Ba 附着力,只有范德瓦耳斯相互作用存在和不存在相分离。相互作用最大化当ODT山姆夷为平地,因为附近的亚甲基甲基终端部分也可以与细菌和互动有助于吸引人的交互。亲水细菌粘附,我们期望行为类似于水:确实如此。有趣的是,刷的效果比水大的细菌。然而,细菌膜的复杂性,不可能提出一个简单的解释这个观察。gydF4y2Ba