帕金森病6-羟多巴胺模型大鼠纹状体的同步红外光谱研究

摘要

本研究采用同步辐射傅里叶变换红外(FTIR)微光谱技术对正常和帕金森病(PD)大鼠脑组织纹状体神经元的生化组成进行分析。利用6-羟多巴胺破坏黑质纹状体通路建立帕金森病大鼠模型。详细的光谱分析显示，6- ohda损伤的PD大鼠纹状体神经元中脂质和蛋白质等细胞成分较对照神经元有显著变化。因此，PD大鼠纹状体神经元脂质光谱吸收强度高于对照组。此外，与正常神经元相比，PD神经元磷脂不饱和水平降低，表明脂质过氧化水平较高。对蛋白质二级结构的分析表明，蛋白质的比例明显较高-与对照组神经元相比，PD神经元的蛋白质结构异常发生在纹状体神经元的形态出现之前。这些发现表明神经元的生化变化可能参与帕金森病的发病机制。

1.导言

帕金森氏病（PD）是一种慢性，进行性神经变性病症和其特征在于，静止性震颤，强直，运动迟缓，和其他特征，诸如姿势和自律神经失调，抑郁症和认知障碍。病理学上，PD的主要特点是黑质和纹状体之间的神经连接的渐进的和选择性的变性，并在黑质致密部（SNpc中）的多巴胺能神经元。在纹状体多巴胺随后损失归因于PD的电机症状表现。PD的另一个关键的病理特征是被称为路易体[胞浆内包含的存在1，2]．虽然PD的确切病因尚不清楚，但遗传和环境因素已被认为在PD的发病机制中发挥作用[3.]线粒体功能障碍和氧化应激也参与PD的发病机制[4，5].6-OHDA是发现的第一种对儿茶酚胺能通路具有特定神经毒性作用的化学制剂，6-OHDA损伤大鼠是一种常见的PD动物模型[6，7]．6-OHDA通过注入黑纹状体束特异性破坏单侧黑纹状体多巴胺能通路，使同侧SN多巴胺能神经元变性，同侧纹状体多巴胺缺位几近完全消除[8].当6-OHDA被运输到神经元时，它被迅速氧化，产生自由基和过氧化氢酶，从而影响蛋白质和膜脂[7，9]．

傅里叶变换-红外微光谱(ftir)是基于共价键振动转变吸收红外光来确定生物组织内的分子化学信息[10]．ftir与同步辐射(SR)红外源相比具有突出的优势，其在中红外范围内的亮度是常规热红外源的100-1000倍，通过实现衍射限制的空间分辨率，可以获得较高的空间分辨率[11- - - - - -13]．ftir通过提供脂类等功能分子群的振动运动信息，直接详细地反映出疾病状态下分子组成和结构的特征变化[14- - - - - -16]和蛋白质[17，18]．大量研究表明ftir在生物医学领域的应用，如细胞死亡[19]，老年痴呆症[20.，21.),骨质疏松症(22.]，羊瘙痒病[23.，24.，心脏病[25.等[26.]．在人类PD患者中，ftir已经被用于研究大脑黑质的生化成分，发现PD患者的蛋白质/脂质比比对照降低，而酰胺I/酰胺II比增加[27.]．

在这项工作中，神经毒素6-OHDA被选择性地微注射到单侧内侧前脑束（MFB）中为了诱发黑质纹状体损伤，采用SR-FTIRM技术研究了正常和6-OHDA损伤大鼠脑组织纹状体神经元的生化变化，旨在探讨帕金森病的发病机制与生化变化之间的关系。

2.材料和方法

2.1.6-OHDA损伤PD大鼠模型的建立

选用成年雄性Sprague-Dawley大鼠(上海Slaccas公司)，体重250-300 g。动物被饲养在标准的住房条件下，在一个温度控制的房间里，有12小时的光-暗循环，并免费获得食物和水。大鼠通过注射10%水合氯醛(i.p)麻醉，并将其置于立体定位装置(NS-2, Narishige，日本)中，切牙杆设置为−2.4 mm。船桨上钻了一个洞，8μ6-羟基多巴胺（西格玛）在4 μ在以下坐标处（相对于Bregma；参见Paxinos和Watson，1998），向右侧内侧前脑束（MFB）注入L 0.2%抗坏血酸和0.9%生理盐水，以实现黑质纹状体通路的完全损伤：毫米,ML: 嗯，DV： 注射速度为0.5 mL/min，并将注射器在适当位置再保持5分钟 在14天的恢复期后，大鼠被预先筛选为对阿扑吗啡（0.3%）的反应进行旋转 mg/kg，i.p.）。对阿扑吗啡有反应的动物(≥7. 在SR-FTIR显微光谱实验中使用了旋转数（单位：min）。

2．2.样品制备

在本研究中，七个6-OHDA损毁PD模型大鼠和7个对照组大鼠进行了研究。所有动物用4％多聚甲醛灌注。After the perfusion, the brains were removed and postfixed in the same fixative solution for 6 h, then immersed in the 30% sucrose solution until sink to the bottom of container to inhibit the subsequent formation of ice crystals. Typically, the brains were embedded in the frozen section medium Neg-50 (Richard-Allan Scientific, USA), serial 20 μm切片，包括SN，在低温切片机(Microm，德国)上切割。其中一个切片用于组织病理学分析，下一个用于SRFTIR显微光谱研究的切片安装在BaF上₂光学晶体，然后在空气中干燥。每个样品中的五个细胞用同步加速器FTIR扫描。

２．３．同步加速器FTIRM

在国家同步辐射实验室（NSRL，中国）的U4光束线上进行了红外显微光谱检查。光束线配备了FTIR光谱仪（Bruker IFS 66） 与红外显微镜（Hyperion 3000）耦合的v/s。使用20 μm×20μ米孔径。在4 cm处积累512次后获得光谱⁻¹光谱分辨率。然后，利用选定峰的高度进行化学绘图。数据采集和处理采用Opus软件(Version 5.5)。

２.４.统计分析

所有数据采用SPSS10.0软件进行统计学分析，以均数±SEM表示。Mann-Whitney测试用于比较对照组和PD组之间的差异。所有测试的可接受显著性水平为．

3.结果

SR-FTIR用于提供生物样品有机物含量和分子结构信息的整体分析。对正常和6-OHDA损伤大鼠大脑纹状体神经元进行了红外显微光谱分析。对正常和6-OHDA损伤大鼠纹状体神经细胞体的红外吸收光谱进行了分析图中的豪恩1. 这些光谱主要由功能基团的特征吸收组成，如脂质和蛋白质。表中简要列出了光谱中观察到的吸收峰的归属1．在3800 ~ 3000 cm范围内发现了光谱分布⁻¹1200-900 厘米⁻¹区具有糖碳水化合物含量高相对于在文献中报道的动物组织。通过被施加到施加在脑组织制备，其给予糖碳水化合物的高强度的冷冻保护效果，即蔗糖它可以被说明。对于6-OHDA损伤的样品，右边（受损侧）和纹状体的神经元左（未损伤侧）均分别用于比较的测量。正常和6-OHDA损毁样品的光谱显示出对每个生化组成，这意味着针对每个组合物中的相对含量的变化发生在PD大鼠模型不同的强度。

一般来说，脂类的主要光谱吸收特征出现在2800-3000厘米区域⁻¹．在图1，it is found that the absorption intensities of PD neurons in the lesioned side for lipids functional groups at 2850 and 2924 cm⁻¹属于CH₂对称拉伸与CH₂不对称拉伸振动分别比控制振动高10%以上。另外，对侧PD神经元在2850和2924 cm处也有轻微的强度增加⁻¹吸收带相对于控制。根据Petibois和Déléris [10，16),ν＝(CH):ν_作为（CH_3.)的吸收比可以表示磷脂的平均不饱和水平ν_作为（CH₂):ν_作为（CH_3.)吸收比提供了磷脂的平均饱和水平，综合起来就可以提供磷脂过氧化的测量。因此，曲线拟合与标准高斯峰在3100-2800厘米⁻¹光谱间隔进行定量分析的比率ν＝(CH):ν_作为（CH_3.),ν_作为（CH₂):ν_作为（CH_3.吸收(图)2)。因此ν＝(CH):ν_作为（CH_3.）显著增加PD的神经元既在受损侧和未损伤侧相比，与对照组，以及之比ν_作为（CH₂):ν_作为（CH_3.)吸收率，如表所示2．

1653和1546处的吸收带 厘米⁻¹对应于酰胺I和II，通常用于研究肽骨架二级结构的各种组成1可见，PD大鼠纹状体神经元损伤侧和未损伤侧的酰胺I带吸收强度均较对照组明显降低。为了深入了解PD和正常样品蛋白质二级结构的光谱差异，采用标准高斯峰分析在1800-1500 cm范围内进行曲线拟合⁻¹执行并显示在图3.．结果表明，PD神经元的蛋白质二级结构组成与对照组不同。的百分率α与对照组相比，损伤侧和未损伤侧PD神经元的酰胺I区-螺旋减弱。相比之下，…的百分率β与对照组相比，损伤侧和未损伤侧PD神经元的-sheet均显著增加(表1)3.).

4.讨论

该SR-FTIR microspectra表现出大脑在帕金森病模型大鼠纹状体神经元的生化成分的变化。我们试图分析并建立疾病状态和脂质和蛋白质组成的神经元的变化之间的关系。

吸收带在2820-2996 cm处⁻¹分析了分配给脂类功能群的光谱区间。PD神经元脂质吸收强度高于对照组。此外，比率ν＝(CH):ν_作为（CH_3.),ν_作为（CH₂):ν_作为（CH_3.)吸收显著增加在PD的纹状体神经元损伤和unlesioned一起对那些控件,它指向未饱和的磷脂水平的减少,从而暗示了高水平的脂质过氧化反应的氧化应激(10，16]．我们知道，大脑的脂质含量第二高，磷脂占大脑干重的6% [28.]．在脑脂中，多不饱和脂肪酸(PUFAs)由于其不饱和键特别容易被氧化。脂质过氧化作用导致细胞膜中多不饱和脂肪酸含量降低，导致膜特性改变[29.，30.]脂质失调和脂质过氧化被认为是PD患者发病的重要病因[31.，32.]．PD的动物模型也被牵连氧化应激的参与。研究无数条线已经证明，6-OHDA的神经毒性作用引起的活性氧类别（ROS），可以破坏脂质，蛋白质和DNA [3.，7，9]．本实验结果清楚地显示了6-OHDA诱导PD模型大鼠纹状体神经元脂质含量的变化和脂质过氧化的增加，这与上述研究一致。

IR分析的另一个异常是PD动物蛋白二级结构的变化。蛋白质的红外光谱有两个主要特征:酰胺I(1600-1700厘米)⁻¹)和酰胺II（1500-1560） 厘米⁻¹）频带，确切频率都通过氢键涉及酰胺C = O和N-H基团[强度的影响33.，34.]酰胺I带的频率对蛋白质二级结构特别敏感[35.，36.]．蛋白质的二级结构可以由所占的百分比来确定α-螺旋，β在酰胺吸收带折叠，和无序结构[10]在本研究中，通过计算酰胺吸收率来证明PD和对照神经元之间蛋白质二级结构的构象变化。结果表明，在不同的温度下α与对照组相比，PD神经元中-螺旋的比例降低，而-螺旋的比例降低β折叠上PD神经元高度增大相比，在控制。这些获得的结果表明，蛋白质在神经元PD的构象变化。文献中的几行表明，异常的蛋白质结构，包括胞外纤维淀粉样蛋白沉积和细胞内包涵体是与神经退行性疾病的关系。这些异常蛋白结构由丝状，不溶性的，蛋白酶抗性结构的称为具有特征的淀粉样蛋白fibrisβ表结构。帕金森病的主要病理特征是神经元中路易小体的细胞质内含物，其主要成分被认为是聚集物α-突触核蛋白β表构象(37.，38.]．然而，这种病理表现主要出现在PD患者和MPTP模型的实质黑质中，而在6- ohda损伤的动物中不出现[39.]．增加的比率β我们在PD动物纹状体神经元中观察到的-sheet可能反映了参与6- ohda损伤PD大鼠发病机制的异常蛋白结构。

综上所述，本研究表明，SR-FTIR微光谱技术可用于测定PD与正常动物之间的生化变化。PD动物神经元的主要成分如脂类、蛋白质、核酸等均在含量和结构上发生变化。这些变化包括磷脂含量和饱和水平的增加，蛋白质二级结构的含量相对升高β表。这些结果表明，SR-FTIR检测到的生化成分的变化可能参与了6-OHDA诱导的神经退行性变的机制。这些结果表明SR-FTIR是一种准确、灵敏的研究神经退行性疾病病理变化的方法。

致谢

国家自然科学基金（30900422, 11179019和11044011），中国科学技术委员会中国科学院国家基础研究发展计划（编号2010CB59806），编号：11ZR1440500（上海），上海市教委分子生理学重点学科项目。

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