识别DLEC1 D215N体细胞突变在福尔马林固定石蜡包埋黑色素瘤和Melanocytic痣标本

文摘

DLEC1被建议作为一种肿瘤抑制基因在一些癌症。DLEC1 D215N体细胞突变(COSM36702)被发现在一个黑素瘤细胞系通过全基因组测序。然而,很少有人知道这个突变的含义和患病率在原发性黑色素瘤或melanocytic痣。本研究的目的是基因型DLEC1 D215N突变黑色素瘤组织和melanocytic痣样品来确认其发生和估计其患病率。原发性黑素瘤()与同步或异步转移()从81年黑色素瘤患者和melanocytic痣()筛查DLEC1 D215N突变。我们发现突变3原发性黑色素瘤和2 melanocytic痣,对应于一个相对较低的患病率(3.7%和7.1%,resp)。DLEC1 215 n突变的致病作用尚不清楚。然而,由于突变先前从未被描述在一般人群中,其参与nevogenesis和黑色素瘤进展仍有可能在将来的研究中阐明。

1。介绍

突变在肺癌和食管癌1删除(DLEC1)由表观遗传沉默基因或其失活,即发起人CpG岛或组蛋白甲基化hypoacetylation,以前报道在一些癌症(肺癌1),食管(2)、肾(3,胃4),结肠(4),卵巢5],乳腺癌[6),头部和颈部7),和淋巴瘤(8])。此外,对预后产生负面影响与DLEC1失活是在肺9)、肾(10),和卵巢5癌。

DLEC1 D215N变异(COSM36702)替换在密码子641 (ENST00000308059)在全基因组测序发现的肿瘤细胞系来源于黑色素瘤转移(11]。建立目录的体细胞突变的癌细胞,lymphoblastoid线来自同一个病人也是测序(11]。三个不同的错义突变被发现在其他基因组或外显子组测序研究,使DLEC1候选人在皮肤的黑色素瘤,肿瘤抑制基因可能采取行动抑制细胞增殖的12,13]。然而,DLEC1突变的患病率在原发性黑色素瘤,黑色素瘤转移或良性melanocytic痣仍未确定。

本研究的目的是为了确认发生和估计的患病率DLEC1 D215N突变在福尔马林固定和石蜡包埋组织样本从黑色素瘤和melanocytic痣。

2。患者和方法

2.1。黑色素瘤患者

102年,福尔马林固定石蜡包埋从筛选81例黑色素瘤患者肿瘤组织。样品原发性黑色素瘤()与同步或异步皮肤转移()或淋巴结转移()从相同的病人接受了DLEC1 pcr测定D215N突变。81从一组224例患者选择治疗原发性皮肤黑色素瘤的Coimbra的大学医院的皮肤科,葡萄牙,在2000年和2008年之间。排除143年的224例是基于以下标准:(i)患者从后续损失(),(2)没有原发肿瘤样本可供筛选由于原发性黑色素瘤切除术在其他中心()或主要未知的黑素瘤(),(3)DNA隔离病人的可用的样品没有达到所需的DNA浓度和吸光度比值的基因分析(= 19:24个样本),(iv) DLEC1突变并不成功的基因分型分析病人的样本(= 8,9样品)。黑色素瘤患者的临床资料披露表1。

2.2。Melanocytic痣患者

同时,28岁的福尔马林固定石蜡包埋组织获得良性melanocytic痣(不典型特征)来自28个病人也被屏蔽。28从一组70例患者选择提交melanocytic痣手术切除6个时期在2008年。化妆品关注痣切除的主要原因。42 70名患者被排除在外是因为(我)没有痣患者样本可供筛选(),(2)DNA隔离病人的可用的样品没有达到所需的DNA浓度和吸光度比值型()和(iii) DLEC1突变并不成功的基因分型分析病人的样本()。的临床数据melanocytic痣患者披露表2。

2.3。的制备和质量控制DNA样本

福尔马林固定和石蜡包埋有效保护组织形态学细节,允许简单的长时间储存在室温下。然而,这种保护方法损害DNA提取效果和质量,限制了分子影响分析和基因分型的结果(14]。有证据的固定和嵌入过程的影响核酸的碎片和外观artifactual突变或误报警15]。这些工件应该避免通过使用大量的双链DNA,通过执行多个放大或通过拨款FFPE组织DNA提取试剂盒部分逆转核酸的福尔马林修改。

考虑到组织的高异质性,由异构的正常和肿瘤细胞的数量,由于放大假阴性结果的正常细胞也有问题的分析。因此,强烈建议只包括标本用50%以上的肿瘤细胞。这个建议之后的样品是从石蜡块时,切断其余正常组织增强肿瘤细胞表示。

至少10 6μ米厚片从每个组织石蜡块被削减。DNA样本隔离片的使用QIAamp DNA FFPE组织工具包(试剂盒、希尔登,德国)。质量控制的孤立的DNA是由测量两个260/230和260/280 nm NanoDrop分光光度计吸光度比值。所有样本被荧光分析量化使用PicoGreen dsDNA定量试剂(分子探针,Inc .,尤金,俄勒冈州,美国)。推荐的起始浓度使用pcr TaqMan化验(生活技术,卡尔斯巴德,加州,美国)是50 ng /μl .然而,正如预期的那样,大多数样本低于这个值。经初步测试使用较低的初始浓度,我们观察到浓度范围从15到20 ng /μL也产生了良好的基因分型的结果。只要有可能,在初始浓度低于15 ng / DNA样本μL和/或吸光度比值低于1.7被降水进一步集中和/或纯化糖原和异丙醇。只有样品至少15 ng /μL和吸光度比值为1.6或更高版本被认为是基因型分析。

2.4。基因分型分析

DNA样本基因分型DLEC1 D215N变异使用TaqMan OpenArray基因分型系统(生活技术,卡尔斯巴德,CA,美国),Genoinseq BIOCANT-Biotechnology创新中心,Cantanhede、葡萄牙。鉴于这些DNA样本的性质,即高异质性的组织,每个标本的基因至少三次。这DLEC1 D215N pcr试验包括在TaqMan OpenArray盘子。15 ng / DNA样本归一化μL ng,总共45用于突变的基因分型。两个nontemplate控制基因分型结果被用来确定集群和检查污染。板加载之前,TaqMan OpenArray大师混合添加到规范化的DNA样本(1:1)。示例加载到盘子是由使用OpenArray Accuffil仪器(生活技术,卡尔斯巴德,CA,美国)。热循环中执行双重持平块GeneAmp PCR系统9700(生活技术,卡尔斯巴德,加州,美国),根据制造商的协议。板成像,即基因型的收购,是由使用OpenArray NT的成像仪OpenArray SNP基因分型分析软件(生活技术,卡尔斯巴德,CA,美国)。在成像过程中,OpenArray NT成像仪记录荧光的数量在每个板的通孔。基因分型数据分析使用TaqMan基因型软件(生活技术,卡尔斯巴德,加州,美国),自动调用调用方法。所有调用或基因型被手动检查和纠正。

确定突变的临床意义,1000年的基因组数据,代表欧洲常见的这些突变频率,被用作控制。筛选软件也被用来估计突变对蛋白功能的影响(16]。

2.5。统计数据

所有统计分析(卡方检验和确切概率法)进行了使用IBM SPSS软件19。意义是设置一个值低于0.05。

3所示。结果

样品不满足初始条件的DNA浓度和/或吸光度比值被排除在外,导致排斥率为17.8%(135)24日在黑色素瘤组织和48.5% (32 66)melanocytic痣。这种差异在统计学上意义重大。

基因分型结果DLEC1 D215N话费(102 111)91.9%和82.4%的黑色素瘤样本中(34)28日在melanocytic痣样本。因此,总共81原发性黑色素瘤搭配21转移和28良性melanocytic痣成功样本基因分型为DLEC1 D215体细胞突变。

三个主要的皮肤黑色素瘤(3.7%)突变的杂合的状态DLEC D215N:两例黑色素瘤表面传播的下肢和结节性黑色素瘤的脸,所有发生在女性患者。只有病人结节性黑色素瘤发达区域淋巴结转移和远处转移。然而,没有组织样本的转移性疾病患者为突变筛查提供了可能。DLEC1 D215N杂合的体细胞突变也发现2例(7.1%)获得melanocytic痣:脸部皮肤痣和复合痣在树干没有非典型特征。没有统计显著差异中观察到的流行DLEC D215N突变与黑色素瘤melanocytic痣患者()。

报告的氨基酸变化的筛分数(D215N)为0.33,表明容忍改变,可能影响蛋白质功能较低。根据1000的基因组数据,DLEC D215N突变并不是先前描述通用欧洲人口。

4所示。讨论

尽管生物材料的来源和局限性的DNA浓度和吸光度比值,最终基因分型结果DLEC1 D215N分析非常有前途的,如图所示的话费从黑色素瘤和pcr melanocytic痣样本。这些结果显示的适用性TaqMan基因分型技术研究福尔马林固定和石蜡包埋组织。作为组织的数量影响DNA的功效隔离,规模较小的melanocytic痣样可能是有关DNA的明显高于失败隔离与黑色素瘤样本(48.5%比17.8%)。

大多数的黑色素瘤研究结节性类型,反之表面传播的预期优势类型。结节性黑色素瘤的高估可能选择性偏差引起的高风险的情况下从其他机构推荐。这种偏见的影响发病率的突变被认为是低,但其真正的影响不能具体确定。

突变DLEC1 D215N少量的样本中,检测出与黑色素瘤和melanocytic痣患者之间没有显著差异。描述了这种突变体细胞突变在黑素瘤细胞系(11),但没有证据表明这个基因的角色在黑色素瘤的报道,我们发现没有之前的数据发生这种突变在黑色素瘤患者或melanocytic痣。尽管低患病率和容许突变对蛋白功能的影响,筛选所估计的软件,其发生必须强调,由于这核苷酸替换没有观察到在欧洲人口(1000人基因工程)。因此,的可能性DLEC D215N突变与致病事件急剧上升,暗示潜在参与nevogenesis和黑色素瘤的发展。

几个致癌基因或肿瘤抑制基因的突变黑色素瘤也可以发现在melanocytic痣(17]。事实上,它不是完全阐明如何BRAF或国家管制当局方面突变导致的出现良性melanocytic痣,因为他们也在黑色素瘤最常见的突变基因,发生在肿瘤恶化的早期阶段(18]。oncogene-induced细胞衰老机制提出了解释(19),但最近的研究并没有能够找到人类衰老特征melanocytic痣(20.]。肿瘤抑制基因在癌症发展一种不同的方式。通常,恶性转换之前,杂合性丢失或显性负突变(21]。DLEC1以前相关的损失函数和几个癌症,表明DLEC1作为肿瘤抑制基因。自的致病作用DLEC1 D215N突变并不是完全阐明直到现在,还不清楚这个点突变的贡献增加易感性为黑色素瘤或melanocytic痣发展。因此,它的意义发生原发性黑色素瘤和melanocytic痣还不清楚,声称进行进一步的研究。协会,这种突变与攻击性的黑色素瘤在未来需要澄清。

5。结论

D215N体细胞突变发生在DLEC1 melanocytic患病率相对较低的痣和原发性黑色素瘤。这个突变的检测可以有效地执行在福尔马林固定石蜡包埋组织。突变的潜在作用DLEC1 nevogenesis和黑色素瘤发病机制使得DLEC1候选人在皮肤黑色素瘤的肿瘤抑制基因。据我们所知,这是第一个研究患病率DLEC1 D215N突变在黑色素瘤患者和melanocytic痣组织样本。

利益冲突

作者没有利益冲突披露。

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