文摘

背景。以前的研究已经表明ferroptosis在癌症的发展过程中发挥着不可或缺的作用和拷贝数变异(CNVs)已报告与ferroptosis有关。然而,CNVs-driven的角色ferroptosis-related基因(德意志联邦共和国)在肺腺癌(LUAD)仍然是知之甚少。因此,我们旨在建立一个基于CNVs-driven小说在LUAD基因签名ferroptosis-related基因。方法。转录组数据和临床特征的LUAD患者从基因表达综合下载(GEO)数据库和癌症基因组图谱(TCGA)数据库。微分分析进行了识别差异表达CNV-driven德意志联邦共和国。单变量Cox和最绝对的收缩和选择算子(套索)回归分析用来确定prognosis-associated基因。kaplan meier (km)分析是一个建筑工人来估计模型的价值。此外,该诺模图创建评估每个病人的存活率。最终,免疫微环境景观之间的高和低风险组评估。结果。共有22个差异表达CNV-driven德意志联邦共和国在LUAD收购。这些基因与丝氨酸家族氨基酸代谢相关显著,铁监管、活性氧代谢、细胞氧化应激反应,并参与氨基酸代谢、疟疾、氨基酸生物合成,HIF-1信号通路。此外,凭6基因(TFAP2A、SLC2A1 AURKA, CDO1, SLC7A11,和ALOX5),预后模型创建,和LUAD样本明显分为高和低风险组,与高危人群预后差。此外,风险评分是一个独立的预后因素。良好的预测性能开发的列线图计算最终结果LUAD病人1,2,3年。最后,19免疫细胞有不同的渗透组间的差异。结论。小说CNV-driven ferroptosis-related预后和成立LUAD可以作为预测指标。然而,进一步的临床和体内体外实验是必要的。

1。介绍

2018年全球癌症统计数据的基础上(1),肺癌是一种疾病,在中国的发病率和死亡率最高。主要类型的肺癌非小细胞肺癌(NSCLC)的85%以上,随着肺腺癌(LUAD)是最常见的非小细胞肺癌亚型(2]。大多数LUAD患者的5年连续小于15%由于缺乏早期诊断和post-diagnosis生物标记(3]。此外,因肺癌的高异质性和复杂性,LUAD之间有显著差异的生存患者不同的分子亚型(4]。尽管相当大的进步在化疗、放疗、靶向治疗LUAD,患者的存活率LUAD仍然收到了不良预后[5]。因此,渴望新的敏感的生物标志物评估患者的预后LUAD处于初级阶段,这是尤其重要的预后和治疗的病人。

Ferroptosis是一种iron-dependent激活细胞死亡过程的积累脂质过氧化(法律流程外包),不同的细胞坏死、凋亡和自噬6,7]。有活性氧(ROS)在肺癌组织中脂质氧化标记,表明ferroptosis可能在肺癌细胞存在。江et al。8]表明p53的重要途径诱导ferroptosis打断肺癌的生长,肿瘤发生所以ferroptosis发挥至关重要的作用。近年来,ferroptosis诱导物抑制剂也被证明有潜在的抗肿瘤能力(9,10]。因此,ferroptosis-related基因(德意志联邦共和国)希望变成未来新鲜LUAD管理的目标。

拷贝数变异(CNV)的基因组结构变异的一部分,这是一个DNA片段1 kB和3 Mb之间的变化,包括删除、复制,反转,易位(11]。的放大或删除在癌症基因组拷贝数通常会导致原癌基因的激活与肿瘤抑制,最终导致肿瘤的发生(12]。先前的研究已经证实CNV影响病人的结果,是关键因素和特点CNV可以扮演法官癌症患者的预后。例如,据报道,CNV DICER1和DROSHA密切相关的非小细胞肺癌病人的结果,upregulation表达式的DROSHA变得弱的生存,而DICER1表达的增加提高了生存(13]。斯等人。14)发现拷贝数的下降,下降的表达SOCS6 LUSC仔细与复发。刘等人。15)发现,CNV的叔PBX1P1 LUAD的发展有关。在LUAD CNV-driven德意志联邦共和国很少报道。因此,本文主要构造和验证预测模型根据CNV-driven LUAD ferroptosis预后特征基因,基因和分析,有助于从根本上理解的角色CNV-driven ferroptosis基因LUAD的进展。

鉴于TCGA LUAD相关数据的数据库和地理数据库,six-gene预后模型结构在目前的调查,包括TFAP2A SLC2A1, AURKA, CDO1, SLC7A11, ALOX5,通过一系列的生物信息学技术。之后,生存分析证明的预后能力六CNV-driven德意志联邦共和国。不出所料,TCGA的训练集,分析表明,CNV-driven德意志联邦共和国显然与操作系统相关的患者内部验证集以及外部验证集。此外,单变量和多变量Cox独立预后分析表明,风险评分有能力独立预测病人的存活率。一列线图的预测性能开发预测的结果LUAD病人1,2,3年。进一步分析的免疫细胞和免疫疗法在两个不同的风险组织发现显著差异在19个类型的免疫细胞。因此,预后模型构建在我们目前的调查表现出优越的预测价值,可以帮助临床医生做出最好的临床策略增强操作系统的速度LUAD病人。

2。材料和方法

2.1。数据源

转录组数据(三级)和适当的临床癌症基因组LUAD被收购的消息阿特拉斯(TCGA)数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/),包括479 LUAD样品完全可用生存数据,56与不可用生存LUAD LUAD样本数据和59正常组织样本。TCGA-LUAD数据集显示了能够转录估计,如 改变RESM规范化计数。此外,共有1147个拷贝数变异(CNV)的材料从TCGA数据库(获得 和 )。此外,转录组测序数据442 LUAD样品完全可用GSE68465生存数据的数据集是采购和作为验证组的基因表达综合(GEO)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。六十德意志联邦共和国是获得公认的文学,以补充文件1。Ferroptosis-related司机和抑制FerrDb数据库的标记基因。

2.2。识别差异表达CNV-Driven LUAD德意志联邦共和国

差异表达基因(度)535年LUAD 59控制样本TCGA-LUAD队列是由“limma”包(3.46.0版) 值小于0.05 大于或等于0.5。主成分分析(PCA)在执行TCGA-LUAD根据度采用“FactoMineR”(版本2.4)和“factoextra”包(1.0.7版)。CNV的基因注释采用参考基因组研究财团人类构建38 (GRCh38)。基因复制变异率控制和患者样本被分析和基因 值小于0.05被选为CNV司机基因。CNV司机和度分割得到差异表达基因CNV司机基因。此外,共有397个德意志联邦共和国从先前的研究和收集ferrdb数据库。然后,德意志联邦共和国之间的相关分析和差异表达CNV司机基因进行筛选CNV-driven ferroptosis基因 ,它被带到相交与度微分CNV-driven ferroptosis-related基因。

2.3。功能富集分析

进一步探索度的函数和微分CNV-driven ferroptosis-related基因,基因的富集分析理由本体(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)数据库与相关途径找到共同的功能通过使用“clusterProfiler”包。筛选标准 和 。使用“enrichplot”(版本1.10.2)绘制条形图,显示富集的结果。

2.4。建设a0nd验证CNV-Driven FRGs-Based预后模型

调查是否CNV-driven德意志联邦共和国是与患者的预后相关,我们随机TCGA-LUAD的肿瘤样本分为训练集( )和一个内部验证集( )7:比例的3。首先,利用单变量Cox分析选择CNV-driven德意志联邦共和国与LUAD患者的总生存期(OS)在训练集和 被认为是统计学意义。接下来,进一步缩小候选人CNV-driven德意志联邦共和国,我们用最绝对的收缩和选择算子(套索)算法筛选出最优基因组合构造LUAD患者的预后模型通过使用“glmnet”包在训练集(版本4.1 1)。此外,每个病人的风险评分的训练集被定义为每个基因的相对表达及其相关的考克斯系数从套索分析获得通过使用下列公式: 在哪里 是风险系数和 是表达式的一部分预后的基因。此外,根据风险评分中位数,LUAD样本训练集被分为高、低风险组。km生存分析进行评估操作系统之间的高和低风险组和使用包r .“survminer”另一方面,“survivalROC”包是用来情节接受者操作特征曲线(ROC)检查LUAD患者的预后预测的预测精度,和曲线下的面积(AUC) 1 - 2,和3年OS计算通过“survivalROC”包r .最后,LUAD的风险分数在内部验证集和外部验证集样本进行评估通过使用上述公式和方法,分别。

2.5。相关分析的风险模型和临床特点

为进一步调查与临床信息签名的风险之间的相关性,我们比较了风险得分在LUAD患者不同的临床特点TCGA-LUAD数据集包括年龄,阶段,TNM和吸烟。结果可视化通过绘画小提琴情节“ggpubr”包(版本0.4.0)和“ggplot2”包版本(3.3.3)。

2.6。建立和验证的诺模图

临床特征包括性别、年龄、T / N / M,阶段,吸烟,和风险评分进行单变量分析考克斯479年LUAD样本,和重要因素进一步参与多变量Cox TCGA-LUAD队列独立预后分析。建立一个预后诺模图帮助预测的概率1 - 2 -和3年OS LUAD病人利用“rms”包。一致性指数(c指数)是用来评估计算图表的准确性。之间的关系与观察到的风险预测的结果计算图表生动的显示使用校准的情节。

2.7。免疫渗透分析

进一步探索预后之间的关系模型和LUAD微环境免疫渗透,ssGSEA是用来计算免疫细胞分数基于24内免疫闲暇的参考基因的表达基因从转录组数据集通过“gsva”包(版本1.36.3)在479年LUAD样品和24免疫细胞的差异分数之间的高和低风险组479 LUAD样本。框线情节被吸引利用“ggplot2”包(3.3.3版)可视化的结果得分24免疫细胞。

3所示。结果

3.1。识别和富集分析差异表达CNV LUAD基因

总共1220度在场LUAD和正常样本,其中563是调节和657年下调( )(图1(一))。PCA分析完整的样本显示,度可以明显区分患者和正常样本(图1 (b))。的功能性浓缩生物过程的结果显示调节基因优秀的与核分裂,细胞器裂变,和DNA构象变化;然而,表达下调基因与second-messenger-mediated信号显著相关,血管发展的监管,和上皮细胞增殖(图1 (c))。的分子功能,调节基因的atp酶活性,显著地相关抗原结合,免疫球蛋白受体结合。表达下调的基因与信号受体激活活动显著相关,细胞因子受体的活动,等等(图1 (d))。的细胞成分,调节基因明显参与凝聚核染色体,浓缩的染色体,染色体,染色体区域,免疫球蛋白复合体,等。用三聚胶原蛋白表达下调基因显著相关,膜区域,膜microdomains,肌原纤维、分泌颗粒膜,和横向等离子体膜(图1 (e))。KEGG浓缩结果表明,调节醒目地关心p53基因信号通路,酗酒、病毒致癌,膀胱癌,卵母细胞减数分裂和细胞周期。表达下调的基因明显与醛固酮合成和分泌,细胞粘附分子,PPAR信号通路和胆汁分泌(图1 (f))。

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图1
差异表达基因的筛选和富集分析LUAD(度)。(一)火山度的地图。(b)主成分分析(PCA)在TCGA-LUAD示例基于度。条形图最浓缩的条件去度,包括GO-BP (c), GO-CC (d)和GO-MF (e)。(f)条形图最浓缩的KEGG度的途径。
3.2。22 CNV-Driven德意志联邦共和国被识别和潜在的功能

共有18224名候选人CNV司机基因在正常和肿瘤样本,染色体如图24日及其分布2(一个)。进一步的十字路口CNV司机基因和度,我们确定了251年调节CNV司机231年基因和基因表达下调CNV的司机。最后,本研究确定了22个微分CNV-driven德意志联邦共和国的397年德意志联邦共和国和差异表达CNV司机基因。这些基因主要是与细胞化学反应压力、活性氧代谢过程,氧化应激反应,细胞氧化应激反应(图2 (b)),尤其是与半胱氨酸和蛋氨酸代谢有关,疟疾,氨基酸的生物合成,HIF-1信号通路( )(图2 (c))。

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图2
筛查微分CNV司机在TCGA-LUAD基因。(一)外圆代表了24条染色体,其中包括性染色体。内圈代表CNV的分布(蓝点代表CNV缺席)。(b)的气泡图去浓缩的分析CNV-driven ferroptosis-related基因。(c)酒吧图表KEGG通路分析的CNV-driven ferroptosis-related基因。
3.3。建立和验证的六个CNV-Driven德意志联邦共和国签名

单变量Cox回归分析后,七个CNV-driven德意志联邦共和国被认证为候选人预后基因在TCGA-LUAD训练集(图3(一个))。6-gene签名终于建立了基于最优λ价值0.00933执行套索回归(图3 (b))。的 。根据最优截断风险评分0.97,LUAD样本划分为高和低风险组,也高风险患者生存时间短(图3 (c))。为分析体现高风险患者恶化的生存(图3 (d))。1 -,3 -和5年AUC值TCGA队列分别为0.679,0.679,和0.669,(图3 (e))。内部验证设置TCGA-LUAD,患者分为高/低风险组最优阈值的基础上的风险评分0.97;此外,高风险的分数组生存率差( )(数据3 (f)- - - - - -3 (g))。此外,ROC曲线结果表明AUC值超过0.6,1,3,5年(图3 (h))。类似的结果在外部验证验证设置GSE68465(数字3(我)- - - - - -3 (k))。

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CNV-driven ferroptosis-related基因与LUAD预后有关。(一)森林地图CNV-driven ferroptosis-related基因通过单变量Cox回归。黄色:风险因素;蓝色:保护性因素。(b)套索考克斯分析确定回归系数和6基因大多数与预测。(c)风险曲线、散点图和风险模型基因表达热图LUAD高和低风险组的患者在训练集。(d)生存曲线LUAD高分组和低风险的患者在训练集。(e) ROC曲线预测1 - 2 -,3年OS LUAD患者在训练集。曲线下面的面积叫做AUC(曲线下的面积),是用来表示预测的准确性和灵敏度。AUC值越高,曲线下面的面积越大,预测精度越高。(f)风险曲线、散点图和模型基因表达热图的高和低风险组内部验证集。(g)高、低风险的生存曲线分组在内部验证集。(h) ROC曲线预测1 - 2 -,和三年的操作系统在内部验证集。(i)风险曲线、散点图和模型基因表达热图GSE68465高和低风险组。(j),高和低风险组的生存曲线GSE68465。(k) ROC曲线预测1 - 2 -,3年OS GSE68465 LUAD病人的。
3.4。预后之间的相关性模型和临床特点

预后模型和临床因素的相关分析显示风险得分显著相关,T / N和阶段。T2和T3患者的风险分数统计值得注意的在顶部的T1的病人。的风险分数N1、N2和N3患者高于N0病人。和风险的II期和III期患者高于I期患者( )(图4)。

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LUAD的风险分数在不同临床亚组患者。(一)年龄;(b)性别;(c) M-stage;(d) N-stage;(e)吸烟类别;(f)阶段;和(g) t台。
3.5。建设的诺模图

评估预后特征与临床可行性的风险模型,然后利用单变量与多变量分析来决定独立预后因素,以及诺模图是利用。Cox回归分析后,与风险评分阶段是公认的独立预后因素( 和0.009,分别)(数据5(一个)和5 (b))。建立了预测计算图表预测1 -,2 -,3年LUAD例(数据的结果5 (c)和5 (d))。

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图5
独立的预后因素分析和计算图表建设。考克斯(a)森林地图的单变量分析的临床特点。(b)森林多变量Cox地图分析。(c)对预测1 -诺模图,2 -,3年生存率LUAD患者。(d)矫正曲线的诺模图。
3.6。在不同的高危人群免疫渗透景观

ssGSEA,结果24免疫细胞分数或每个LUAD病人,如图6(一)。进一步分析变异的免疫细胞渗透之间的高/低风险组透露,19个细胞尤其是两组的变化,包括直流,iDC pDC, Th2细胞、CD8 T细胞,肥大细胞,嗜酸性粒细胞,细胞毒性细胞,Tgd, TFH,巨噬细胞、T细胞、NK细胞、Tem、中医,B细胞,T辅助细胞,NK CD56dim细胞,NK CD56bright细胞( )(图6 (b))。

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图6
微分分析免疫细胞浸润。(一)热图ssGSEA得分24免疫细胞。ssGSEA: single-sample基因集富集分析。箱线图(b)的免疫细胞高和低风险组之间的差异。 和 。

4所示。讨论

Ferroptosis是一种新型的细胞死亡方式,主要是由活性氧的积累和法律流程外包造成致命的细胞损伤。ferroptosis的感应机制在肿瘤细胞可以大致分为经典和非经典的途径。前者是通过抑制胱氨酸/谷氨酸转运体系统-(系统Xc -)谷胱甘肽(谷胱甘肽)GPX4轴,导致活性氧的积累导致ferroptosis,而后者会导致ferroptosis直接或间接由铁代谢和线粒体。近年来,研究发现ferroptosis具有增殖与肺癌细胞凋亡的整体效果16- - - - - -19]。因此,它是合理的猜想,德意志联邦共和国也可能参与预测LUAD的生存结果,为临床提供参考理想预后标记的识别。

在我们的研究中,高22差异表达CNV-driven德意志联邦共和国在LUAD基于信息学手段技术获得。这些基因与丝氨酸家族氨基酸代谢相关显著,铁监管、活性氧代谢、细胞氧化应激反应,也参与氨基酸代谢,疟疾,氨基酸生物合成,HIF-1信号通路。Wan et al。20.HIF-1)确认后高热αHIF-1的一部分,有可能诱导增殖和血管生成与SCLC剩余非小细胞肺癌。碳代谢显示满足肿瘤扩散的特殊营养需求LUAD [21]。此外,姚明et al。22暴露,LUAD有更强的依赖比SQCLC或SCLC 1厘米的活动。

基于LUAD-TCGA和地理数据库的相关文件,我们构造一个预后特征形成的六个基因,包括TFAP2A SLC2A1, AURKA, CDO1, SLC7A11, ALOX5,通过一系列的生物信息学技术。其中,TFAP2A、SLC2A1 AURKA, SLC7A11 LUAD生存的危险因素,而CDO1和ALOX5保护性因素。据报道,CDO1显示肿瘤抑制活性在细胞和小鼠模型实验(23]。ALOX5抑制肿瘤生长在KrasG12D老鼠通过其酶产品AT-RvD1 [24]。此外,抑制ALOX5基因可以促进肺癌的生长25]。TFAP2A也称为ap-2A主要指胚胎发育的规定,增殖,凋亡和干细胞分化26]。TFAP2A可以通过激活负调节ferroptosis NRF2 [27]。的预后模型LUAD 15德意志联邦共和国由光徐你et al。28]。SLC2A1葡萄糖转运蛋白编码基因控制葡萄糖的吸收,以及编码蛋白与葡萄糖代谢密切相关。SLC2A1与肿瘤进展和转移(29日调节与预后差的),包括在LUAD [30.]。AURKA是公认的肿瘤易感性基因,这对正常细胞有丝分裂的过程是至关重要的(31日),在许多癌症,由乳腺癌[32),结肠直肠癌(33),胃肠道癌症(34),膀胱癌(35),和肺癌36]。最近的研究表明,在LUAD AURKA和不良预后相关(37,38]。金属蛋白酶CDO1的主要功能,参与半胱氨酸监管和牛磺酸的合成。郝et al。39)证实,抑制CDO1可以还原谷胱甘肽水平与防止活性氧产生,从而抑制ferroptosis。研究发现,CDO1启动子区域的甲基化在非小细胞肺癌是常见和相信CDO1有一定的特异性的甲基化非小细胞肺癌(40,41]。的抑制SLC7A11-mediated胱氨酸吸收导致细胞内谷胱甘肽缺乏,导致ferroptosis-mediated细胞死亡(7]。宣et al。30.所示)报道称,调节SLC7A11 NSCLC患者和糟糕的预后有关。ALOX5是一个起始酶,主要介导炎症介质的产生白三烯和lipoxin。ALOX5可以抑制药物引起ferroptosis通过过度42]。ALOX5研究进行了大量的癌症,如胶质母细胞瘤(43],乳腺癌[44),和肺癌42]。

在这项研究中,479名luad患者被分为高危组和低风险组,高危人群的不良预后。随后的独立预后分析发现风险评分是一个值得信赖的独立元素。此外,列线图的预测性能开发预测的结果LUAD病人1,2,3年。诺模图有很好的预测能力。

免疫治疗是近年来的研究热点,了解免疫渗透和LUAD的预后关系可能导致LUAD治疗的发展。ssGSEA,本研究获得24分LUAD样本的免疫细胞。进一步分析变异的免疫细胞分布在两组透露,共有19个细胞突出差异不同的高危人群,这证明LUAD的预后相关免疫渗透。许多研究证实了免疫细胞之间的相关性与肺癌的临床结果。包等。45)显示,大量的肥大细胞与更好的生存在早期LUAD患者。在这项研究中得出相同的结论。相比之下,丽丽et al。46)发现肥大细胞与LUAD进展有关。据报道,CD8 + T细胞密度是预后不良的预后因素之一LUAD患者(47]。然而,这一研究获得的结果是相反。另一项研究显示,IL-38提升LUAD CD8 + T淋巴细胞的增殖,抑制肿瘤微环境(48]。此外,通过比较分析、巨噬细胞和pDC是更高的低风险人群在我们的分析。这一发现表明,巨噬细胞和pDC与更好的肺腺癌预后相关,与先前的研究。荣格et al。49]发现,较高的癌症肿瘤相关巨噬细胞密度与可怕的生存有关的结果。君威et al。50]表明pDC淘汰赛抑制肿瘤传播低剂量lPS-treated老鼠。总之,不同的研究者有不同的观点。差的预后作用和机制免疫细胞在肺腺癌的研究需要进一步研究。

5。结论

总之,六CNV-driven ferroptosis-related基因组合预测模型筛选由多种生物信息学方法有良好的预后价值LUAD并可能提供某些依据个人LUAD患者的治疗和评价。然而,本研究有一定的局限性的影响的具体机制CNV-driven德意志联邦共和国LUAD仍然需要进一步验证了基本实验。我们将继续关注这些基因的研究动态。

数据可用性

在生成的数据集和/或分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本研究支持广东海洋大学科研启动基金项目(批准号R20049)和支持中国的国家自然科学基金项目(批准号62066040)。铜仁大学。

补充材料

对ferroptosis进行一个全面的文献调查,获取高质量的文章,在这60 ferroptosis-related基因识别和补充文件1中给出。(补充材料)