微流控平台检测ctDNA:一种有前途的癌症个性化化疗生物标志物

抽象的

早期检测和鉴定循环肿瘤DNA (ctDNA)可以揭示全面的生物学见解，从指示肿瘤的存在，识别恶性细胞的突变，并允许精确或靶向治疗，监测疾病进展，治疗耐药性，以及疾病的复发除此之外，ctDNA检测最大的公理意义之一是，它为非侵入性液体活检提供了一种新的思路，作为外科肿瘤活检的替代程序。尽管ctDNA在癌症研究中具有巨大的潜力，但对ctDNA检测和分析的定量研究仍然缺乏。以前发表的大多数基于微流体的研究都集中于循环肿瘤细胞(CTC)的检测，而没有解决ctDNA的潜力。微流控检测ctDNA的研究并不一致，可能是由于ctDNA在血浆中浓度低，分离复杂。研究人员需要利用微流控系统的能力进行ctDNA分析，从而有效地解决癌症的重大谜题。因此，这项研究强调了ctDNA作为液体活检的癌症生物标志物的重要性，并提供了当前实验室和微流控技术检测ctDNA的概述。这篇论文也试图展示新出现的微流控ctDNA检测和分析的个体化癌症化疗。

1.导言

生物标记物是在体液或组织中发现的生物分子，用来描述正常或异常的生物状态或疾病。世界卫生组织[1]定义的生物标记物是指可在体内测量用于疾病预测的生物物质、结构或过程[2］．一般来说，作为生物标志物的潜在生物分子是蛋白质(酶或受体)、多肽、核酸(DNA、RNA)、抗体和改变，如基因表达、蛋白质组学特征、代谢组学特征和细胞突变[3.］．在癌症研究中，肿瘤生物标志物是由肿瘤分泌并因肿瘤的存在而产生特异性反应的生物分子。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)和循环肿瘤dna (circulating tumor dna, ctDNA)是目前研究最多、检测最有效的肿瘤生物标志物。这些生物标记物可在全血、血清、血浆循环或其他体液(如尿液和唾液)中识别[3.］．除了作为预后生物标志物预测疾病外，它还可以衡量癌症进展的风险、治疗反应和药物基因组反应(细胞对药物的反应)。这一术语也被称为诊断生物标志物，用于个体化医疗，在个体化医疗中可以提供精确的治疗或治疗，而不会产生不良反应[2，4］．

循环肿瘤细胞（CTC）是从原发性肿瘤，复发或转移源于血液中自由循环的细胞的细胞[5］．它们具有初级肿瘤的特异性遗传特征，即使在初级阶段也会对器官的各部分转移[6］．根据一些综述，ctc可以在肿瘤生长的早期阶段被识别，这可以作为治疗评价的治疗生物标志物，以及检测特定疾病或肿瘤的转移性复发[7，8］．ctc可从器官不同部位的不同肿瘤中释放，其性质各不相同。因此，ctc可以显示原发肿瘤脱落的异质细胞，这需要进一步的分析来研究原发肿瘤的特征和位置。最近，基于有前景的无创液体活检技术分离出的ctc已被证实为包括肺癌、结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌在内的多种癌症的潜在生物标志物[9］．然而，血液中的CTCs的浓度在10分1中非常低⁹只有特定数量的ctc能够产生转移。因此，有必要进一步分析转移性和非转移性ctc的特征，以进行适当的精确治疗[5，10］．

循环细胞游离DNA (cfDNA)是在血液(血浆和血清)和其他体液中自由循环的小DNA片段被降解。它主要是双链的细胞外DNA分子，较小的片段在70 ~ 200 bp之间，不一定来源于肿瘤[11，12］．基于早期研究，研究人员发现，与健康患者相比，癌症患者的CFDNA的存在显着高。升高的CFDNA含有稀释数量的肿瘤特异性突变，其也称为循环肿瘤DNA（CTDNA）[13］．ctDNA是癌细胞和肿瘤生长并被新细胞取代时释放的一种生物标志物。ctDNA的数量差异取决于肿瘤类型、位置和肿瘤级联。ctc、cfDNA、ctDNA的总体情况如图所示1．

CTDNA分析提供了关于通过液体活检检测肿瘤的异质信息的启示，提供更有效的精度治疗和监测疾病病症，包括非活性学以及进展[14］．癌症可以被归类为一种不可比较的疾病，肿瘤的分子机制最终反应的肿瘤阶段的进展，治疗，或免疫系统的变化在治疗期间。几乎所有的化疗都有耐药标准，并在疾病进展期间导致肿瘤克隆进化[15］．由于ctDNA从包括原发和克隆在内的多个肿瘤区域释放，该分析提供了关于肿瘤异质性和克隆进化的大量信息。大量的研究已经认识到ctDNA在检测肿瘤残留、耐药克隆存活和治疗耐药方面的可行性，并预测在肿瘤复发前出现亚克隆[16- - - - - -18］．此外，CTDNA可以提前检测整个肿瘤进展过程中的转移。CTDNA改变和早期CTDNA的升级数量还预测疾病复发的概率[19- - - - - -21］．一些关于ctDNA的横断面研究预测了患者接受手术、化疗或放疗时的预后和肿瘤复发的风险[22，23］．该研究进一步可用于监测治疗反应率，以更好地治疗管理和治疗指导[24，25］．结论表明，ctDNA检测与肿瘤分期有一定的相关性。II-IV期的检出率为100%，而I期非小细胞肺癌(NSCLC)的检出率为50% [18，26］．图中描述了ctDNA检测的潜在临床益处2．

多个来源的数据表明，ctDNA比CTCs更容易分离，因为ctDNA更稳定，在血流中所占比例更高，敏感性更高。在7.5 ml单次抽血中仅检测到少数ctc，而包括ctDNA在内的cfDNA也可由凋亡细胞和肿瘤细胞释放[21，27]它们的浓度与肿瘤级联反应成正比[28］．尽管如此，需要进一步分离甲基化分析方法，以良好地定义肿瘤特异性的CFDNA或特别是CTDNA。甲基化分析是甲基的DNA染色体图案研究。甲基化DNA的基因组变化模式显示了精确的肿瘤特异性DNA，特别是CTDNA或生物标志物鉴定[29，30.］．合适的癌症生物标志物的识别是实现具体个性化医疗的关键。在革命性的医疗保健中，不断升级的个性化药物能够在正确的时间为正确的人提供正确的治疗，进行疾病诊断筛查、监测肿瘤进展和耐药性反应[31］．ctDNA作为肿瘤生物标志物的分析可用于非侵入性液体活检，这比传统的需要手术检查肿瘤组织的组织活检更容易获得肿瘤样本。尽管在癌症研究中，ctDNA作为有效的预后和诊断生物标志物的前景十分广阔，但仍需要一种高灵敏度和选择性的即时护理设备来发挥ctDNA的潜能。微流控平台作为一种医疗设备，在满足现代分子技术的需要，根据需要同时或连续地操作DNA、蛋白质和细胞的各种分析中扮演着重要的角色。因此，本文综述了目前实验室液体活检技术，开发的微流体液体活检设备，以及在癌症患者中快速检测和鉴定ctDNA的未来趋势。

2.ctDNA分析方法

ctDNA的鉴定和分析通常是在多个实验室进行的，这需要大型设备和专业技能来处理样品，被认为是耗时的程序。因此，ctDNA快速检测和分析从实验室(使用大容量样品的宏观尺度分析)发展到微流控技术(使用小容量样品的微观尺度分析)。接下来的部分将描述这个分析的发展过程。

3.实验室液体活检技术

活组织检查是对手术切除的肿瘤细胞或组织的检查，以研究和确定肿瘤或疾病的存在、原因和阶段。传统的组织活检在临床上不值得考虑用于一些疾病的筛查，主要是肺癌和脑癌。手术切除部分组织可能导致神经损伤、出血或疾病扩散。此外，化疗期间的手术，肿瘤细胞基因组高度不稳定，无法持续监测药物和肿瘤进展[32］．相比之下，基于血液等液体样本进行分析的液体活检提供了无创、连续、不均匀和全面的疾病观察技术。通过这种液体活检检测ctDNA，可以随时获得关于肿瘤类型、肿瘤分期和个性化药物化疗进展的多样化所需信息[33］．组织活检和液体活检所需的程序如图所示3.和4．

目前的实验室技术和ctDNA分析可分为四类。它们是测序、聚合酶链反应（PCR），包括蝎子扩增难治性突变系统（ARMS）、珠、乳剂、扩增和磁分析（BEAMing）以及下一代测序（NGS）[32，34，35］．PCR、real-time quantitative PCR (qPCR)、digital PCR (dPCR)或改进版的液滴数字PCR (ddPCR)是在传统方法的基础上进行基因变异研究、扩增和检测罕见的已知突变DNA分子和已知等位基因特异性突变[36］．PCR和QPCR是用于定量核酸的最广泛使用的方法。然而，它们被认为是不敏感的，以检测突变等位基因的低浓度，并且在样品中仅存在所需量的靶向等位基因时，扩增引发。因此，研究人员开发了与实时QPCR集成的蝎子臂以检测低浓缩突变等位基因[37，38］．然后引入ddPCR，只从整个样品中扩增目标DNA模板，通过阳性信号指示剂显示被分析物序列的存在。这种方法被认为是高度不敏感的，因为它降低了假阴性率，而假阴性率通常是由基于qpcr的技术观察到的[39］．类似地，DDPCR和光束也基于乳液和扩增，其中将所需模板分离成数千个微小的反应室进行扩增的液滴[39]。在乳化成液滴之前，以与ddPCR相同的原理将DNA结合到磁性微球上。该方法基于使用流式细胞仪对含有细胞突变的珠子进行分类[40］．扩增过程结束后，洗脱出磁性微珠，纯化PCR产物，检测突变[41］．虽然Scorpion ARMS、ddPCR和BEAMing对不同癌症阶段的检测能力和敏感性相当高，但这些方法仅适用于已知突变，且临床设置的程序复杂[42]许多研究已经提出在癌症患者中检测ctDNA，但是由于临床应用的实际限制，测序和NGS方法被开发出来。这些方法允许通过对单个样本中数亿个DNA片段进行平行测序来检测ctDNA。平行测序也用于同时检测各种潜在突变。NGS分析还可用于帮助从生物标记物检测、诊断分析、预后分析和癌症治疗监测等方面做出丰富的临床决策[43- - - - - -46］．

在一项基于上述当前实验室技术的分析研究中，肿瘤中可检测到的ctDNA的百分比根据分期的不同而不同，在局限性肿瘤中敏感性为49%至78%，而在转移性肿瘤中敏感性为86%至100% [47]石井先生和他的团队[48]检测表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗非小细胞肺癌（NSCLC）的耐药机制。该分析以收集的血浆（ctDNA）和肿瘤样本为基础，采用滴状数字PCR（ddPCR）进行，灵敏度为81.8%，特异性为85.7%Gray等人检测到非小细胞肺癌（NSCLC）中的EGRF突变，其敏感性和特异性分别为81%和85%[24］．另外一些研究表现出CTDNA检测并证实了结直肠癌的存在[49]和乳腺癌的ctDAN[50.］．芦田等[51.]通过PCR扩增成功检测到罕见突变的DNA分子和指定的等位基因。van Ginkel和他的同事[52.]通过ddPCR和血液样本的BEAMing鉴定ctDNA和指定的稀有突变标记。全基因组测序（WGS）或全外显子组测序（WES）是对肿瘤基因组进行稀有突变鉴定的综合研究，因此有助于临床治疗[35，53.]虽然WGS被用于识别恶性突变，但由于给予治疗而引起的原发肿瘤的变化会影响随后对肿瘤基因组的分析。同样，高产WES用于检测罕见疾病和肿瘤细胞突变，但仅适用于肿瘤检测的后期。下一代测序技术通过同时测序数以百万计的DNA分子，减少了测序时间、成本和基因组的详细分析，具有许多优势。第一种改良测序方法称为标记扩增子深度测序（TAm-Seq），用于鉴别晚期卵巢癌患者是否存在转移性突变。然后，Newman等人介绍了基于捕获的深度测序方法[54.并与Bratman等人共同开发[26]以多种突变鉴定具有综合诊断信息的CTDNA，用于监测残留疾病和检测单一核苷酸变体。然后，纽曼及其小组进一步改善了这种方法[55.[数字误差抑制 - 增强深度测序主要是提高CTDNA检测的敏感性和特异性。Volik等人。[13[展示了基于扩增子方法的安全排序系统（Safe-SEQS），用于有效检测罕见变体，能够通过降低测序误差率来鉴定许多肿瘤类型中的CTDNA。然而，这需要具有患者特异性优化的复杂数据分析系统，用于改变，例如体细胞拷贝数和片段重排检测。在随访的研究中，WGS用于分析转移性乳腺癌患者的CTDNA，也研究了治疗选择。通过同样的令牌，WES用于高乳腺癌，卵巢癌和肺癌患者的CTDNA检测[56.］．表中显示了CTDNA检测实验方法的概述1．虽然这些方法在CTDNA检测和监测疾病进展中敏感，但它们保持昂贵且时间密集，并且需要复杂的数据分析系统。因此，临床微流体装置揭示了一种新的光，以快速，成本效益，最重要的是简单的工作流程，其中可以随时重复该技术的分子分析，如图所示5．

4.微流控液体活检技术

在过去的十年中，微流控系统在医疗保健方面得到了迅速发展。单个微流控芯片能够在整个实验室中进行一系列分析或实验，这需要几天的时间才能显示结果。由于所需的样品和试剂量很小，微流控平台可以ht适用于单个细胞的分析。大多数情况下，微流控设备可以作为便携式、可移动、口袋大小的工具，也可以作为小型台式仪器。它将是在适当的时间提供适当护理的一个很好的支持设备。然而，微流控设备的开发有一些考虑因素对于医疗必需。分析和结果解释的质量差将直接导致不准确的治疗方案，从而可能影响患者的健康。虽然输入设备的原始样本不需要离心过程，但样本质量和分析技术对生产至关重要e高产结果。

目前有关微流控检测ctDNA的学术文献相对较少。这主要是由于在正常细胞的非突变DNA背景下对低浓度的ctDNA检测不敏感。微流控技术的主要进展揭示了其在分子和生物医学领域的应用，可用于快速分析临床应用。ctDNA的大小和性质是开启微流控ctDNA检测的思路之一。因此，引入了微通道上的电动捕获技术，该技术依赖于带电离子的积聚，通过外加电场形成目标分析物的耗尽[57.］．在后续研究中，基于微通道尺寸的微柱结构，微柱填充分离，微通道电泳系统[58.，59.开发用于CFDNA提取以实现高产率和纯化。这些方法具有克服大多数微流体挑战，例如改善散热，通过施加大电场降低CFDNA分离持续时间，从患者和相关缓冲溶液中减少所需的血液样品的量以分离。这些方法遇到的主要局限之一是分离的CFDNA，其无法进一步纯化用于特异性的CTDNA检测。其次是该方法，浓缩基于CTDNA的微流体，特别是窄微通道[60.]及纳米孔微通道[61.]被修饰以富集ctDNA分离。此外，早期用于cfDNA或ctDNA检测的微流控研究是基于应用于微尺度平台的传统qPCR技术。在插入染料(如SYBR Green)或DNA荧光探针(如TaqMan)的帮助下，单个DNA拷贝的热扩增和实时荧光被用来监测DNA浓度。报道了热扩增作为qPCR的微流控系统和代表ddPCR的液滴反应室用于cfDNA检测，而制备的器件没有灵敏度规范[62.，63.]Chaudhuri等人报道了七种基于液滴的数字PCR微流控系统，通过检测ctDNA来识别体细胞突变[64.].使用带有TaqMan®探针的液滴微流控技术，通过荧光信号从野生型DNA中分离突变DNA。突变基因的准确、灵敏定量喀斯特癌基因被检测到，尽管这个平台受到分析液滴数量的限制[65.研制了微流控介质电泳捕获电极分离ctDNA，并报道了高产率结果，但未详细说明该装置的灵敏度水平[66.］．在传统FISH技术的基础上，构建了微流体荧光原位杂交(FISH)技术来筛选造血系统恶性肿瘤。该设备检测到微小残留疾病，一次可以分析10个亚微升体积的样品[67.］．

据我们所知，从过去十年到2017年，以往关于微流控检测ctDNA的研究结果有限、不一致且相互矛盾。作为一项突破，Koboldt等人于2017年提出了微流控多重PCR测序技术，用于高通量和灵敏定量ctDNA[68.]。多重PCR预扩增与测序方法相结合，用于定量低浓度的ctDNA，并通过芯片外经验贝叶斯模型继续研究特定于表征ctDNA的误差；因此，可以采取精确方法来修正他们的工作。他们报告了使用卵巢血浆检测ctDNA突变和疾病监测an和胰腺癌患者（临床试验样本），与肿瘤组织匹配的敏感性为92%，特异性为100%。基于固相微萃取（SP）的新型低成本塑料微流控表面μE） Campos等人证明了cfDNA提取的可行性[69.］．通常，临床分析物可在微流控中通过微柱结构、多孔固相或固定化磁珠等几种方法进行固相萃取[70］．Campos等人(2018)使用微柱阵列增加萃取床负载(可扩展到负载>700 ng cfDNA)和固定缓冲液(IB)，后者由聚乙二醇和盐组成，可诱导cfDNA在活化的塑料微流控表面冷凝。在cfDNA提取中，90%以上的纯度被注意到，IB的使用减少了最终输出中共提取基因组DNA的干扰。该芯片还可用于从结直肠癌和非小细胞肺癌患者血浆中提取cfDNA进行临床疾病检测喀斯特突变基因。Aravanis等人介绍了另一种新方法。通过从结肠直肠癌患者的血浆中取样CFDNA进行CTDNA检测[71.］．以微孔和微柱为基础的微流控平台采用二甲基二硫双丙酰酯(DTBP)进行ctDNA分离，并结合Sanger测序方法进行ctDNA验证。研究结果表明，DTBP极大地减少了细胞背景的检测，特别是在化学混合或洗脱过程中，非癌细胞可能释放的DNA。用胺反应同双功能亚胺酯(HI)与ctDNA的胺基团结合的DTBP和碳酸氢钠作为洗脱缓冲液分离ctDNA。该微流控平台鉴定了71.4%的突变谱喀斯特和吹牛从结直肠癌I期到IV期15分钟内。图中展示了用于分离和检测ctDNA的微流控系统的几个例子6．表中显示为CTDNA检测的微流体方法概述2．

5.结论

确定合适的癌症生物标记物是实现有形个性化医疗的关键。ctDNA作为癌症生物标记物的分析适用于非侵入性液体活检，从而快速获取肿瘤样本，而不是需要对肿瘤组织进行外科检查的传统组织活检。尽管ctDNA强调了癌症研究中许多蓬勃发展的可能性以及经过验证的预后和诊断生物标记物，但仍然需要在医疗保健中出现高灵敏度和选择性的微流控设备来利用ctDNA的潜力。由于通过微流控检测ctDNA的研究非常有限且不一致，因此为了应对这一精确医学时代，成本效益高、节省时间的微流控平台是必要的。简言之，ctDNA的微流控分析可以快速获取肿瘤样本，而不是传统的组织活检，有助于临床快速早期检测ctDNA，并可提供适当的治疗。

6.未来的视角

展望未来，目前ctDNA分析微流控平台面临的挑战是令人激动的。用于生物标记物多重识别的微流控平台在快速疾病检测和诊断方面即将出现。同时检测和分析多个生物标记物将是微流控研究中一种引人注目的方法，因为hey包含肿瘤或任何其他相关疾病的指纹信息，这可以提高诊断准确率。此外，太赫兹（THz）超材料在生物传感应用中具有独特的特性，这些特性在天然材料中是不可能获得的。然而，超材料的结构非常复杂，难以制造。太赫兹超材料生物传感器基于生物标记物的可调谐共振频率和电磁波。超材料的结构具有优化的介电常数 ，导电性 ，这种生物传感器的主要能力之一是识别由于药物和抗生素的消耗而引起超敏反应的靶向生物标记物。生物细胞和组织的含水量波动显示介电常数的变化导电性细胞和组织的值。介电常数的变化导电性超材料中细胞的值导致高敏感的谐振频率，可用于检测生物标志物。将THz超材料集成到生物分析装置中可以提高单分子的检测灵敏度和限制。

缩写

背景:	脱氧核糖核酸
反恐委员会：	循环肿瘤细胞
ctDNA:	循环肿瘤DNA
核糖核酸：	核糖核酸
cfDNA：	循环DNA游离
非小细胞肺癌:	非小细胞肺癌
PCR：	聚合酶链反应
武器:	蝎子扩增难治突变系统
qPCR：	定量聚合酶链反应
门店:	新一代测序
喜气洋洋的:	珠子，乳剂，放大，磁性
DPCR:	数字聚合酶链反应
ddPCR：	液滴数字聚合酶链反应
EGFR：	表皮生长因子受体
TKI:	酪氨酸激酶抑制剂
WGS:	全基因组测序
韦斯:	整体exome测序
TAm Seq：	Tagged-amplicon深度测序
安全顺序：	Safe-sequencing系统
鱼：	荧光原位杂交
SPμE:	固相微萃取
IB:	固定缓冲液
DTBP：	二甲基dithiobispropionimidate
你好：	Homobifunctional imidoester
太赫兹：	太赫兹。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

该研究得到了马来西亚高等教育部和马来西亚科技大学的资助(批准号:q . j13000.21a2.04e82和q . j13000.2523.16 h38)。我们感谢他们为这个项目提供资金和无尽的支持。

参考文献

1. 世界卫生组织和国际化学品安全计划，“风险评估中的生物标志物：有效性和验证”，年关系环境健康标准，第222卷，第238页，世界卫生组织，2001年，https://apps.who.int/iris/handle/10665/42363．视图:谷歌学术
2. N. Goossens，S. Nakagawa，X. Sun和Y.Hoshida，“癌症生物标志物发现和验证”平移癌症研究，卷。4，不。3，pp。256-269,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术
3. N. L. Henry和D. F. Hayes，《癌症生物标志物》，分子肿瘤学，第6卷，第2期2, pp. 140-146, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学术
4. F. S. Collins和H. Varmus，《精准医疗的新举措》新英格兰医学杂志，第372卷，第2期。9, pp. 793-795, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术
5. M.T.Gabriel、L.R.Calleja、A.Chalopin、B.Ory和D.Heymann，“循环肿瘤细胞：细胞富集和分离的非EpCAM方法综述，”临床化学第62期4, pp. 571-581, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术
6. P. Potdar和N. Lotey，“循环肿瘤细胞在未来癌症诊断和治疗中的作用”，癌症转移与治疗杂志， vol. 1, no. 12，第44页，2015。视图:出版商的网站|谷歌学术
7. T.A.Yap，D.Lorente，A.Omlin，D.Olmos和J.S.De Bono，“循环肿瘤细胞：一种多功能生物标记物，”临床癌症研究，第20卷，第10期，第2553-2568页，2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术
8. K.L.Georgiadis，K.Simpson，M.Ayub等，“循环肿瘤细胞”，年胰腺癌，第1325-1360页，施普林格，纽约，2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
9. C. Alix-Panabières和J.-Y。Pierga，《循环肿瘤细胞:液体活检》公报du癌症，第101卷，第1期，第17-23页，2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术
10. X.哲，M. L. Cher, R. D. Bonfil，《循环肿瘤细胞:大海捞针》美国癌症研究杂志， vol. 1, no. 16, pp. 740-751, 2011。视图:谷歌学术
11. J. D. Merker, G. R. Oxnard, C. Compton等，“癌症患者循环肿瘤DNA分析:美国临床肿瘤学会和美国病理学家学院联合综述”，病理学与实验室医学档案，第142卷，第2期。10, pp. 1242-1253, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
12. C. M. Stewart, P. D. Kothari, F. Mouliere et al，“无细胞DNA在分子病理学中的价值”，病理学杂志，卷。244，没有。5，pp。616-627，2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
13. S. Volik, M. Alcaide, R. D. Morin, C. Collins，“游离DNA (cfDNA):新兴技术在癌症中的临床意义和应用”，分子癌症研究，卷。14，不。10，pp。898-908,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术
14. Liu J.， Chen X.， Wang J. et al.，“健康个体中cf-DNA基因组变异的生物学背景”，《肿瘤学，第30卷，第3期，第464-470页，2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术
15. M. Kleppe和R. L. Levine，“肿瘤异质性混淆和阐明:评估影响，”自然医学，第20卷，第4期，第342-344页，2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术
16. L. De Mattos-Arruda, B. Weigelt, J. Cortes等，“通过循环无细胞肿瘤DNA的从头突变图谱捕捉肿瘤内部遗传异质性:一种原理证明”《肿瘤学，卷。25，不。9，pp。1729-1735,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术
17. M.Murtaza，S.J.Dawson，K.Pogrebniak等人，“在转移性乳腺癌病例中使用循环肿瘤DNA表征的多灶克隆进化，”自然通讯，第6卷，第2期2015年1日。视图:出版商的网站|谷歌学术
18. M. Yang, M. E. Forbes, R. L. Bitting等人，“将基于血液的液体活检信息纳入癌症分期:TNMB系统的时间?”《肿瘤学，第29卷，第2期2，页311-323,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
19. E. I. Deryugina和W. B. Kiosses，“肿瘤内癌细胞静脉静脉静脉静脉瘤型侵入到相邻的基质差异，”细胞报告，第19卷，第3期，第601-616页，2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术
20. E. Yong，“癌症生物标志物：用血写入”自然，第511卷，第7511号，第524-5262014页。视图:出版商的网站|谷歌学术
21. C.Bettegowda，M.Sausen，R.J.Leary等人，“早期和晚期人类恶性肿瘤中循环肿瘤DNA的检测，”科学转化医学，第6卷，第2期224，p。224RA24,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术
22. E. Crowley, F. Di Nicolantonio, F. Loupakis, and A. Bardelli，“液体活检:监测血液中的癌症基因”，自然评论临床肿瘤学，第10卷，第5期。8，第472-484页，2013。视图:出版商的网站|谷歌学术
23. B.S.Sorensen，L.Wu，W.Wei等人，“在厄洛替尼治疗期间监测晚期非小细胞肺癌患者血浆DNA中表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂致敏和耐药突变，”癌症，卷。120，不。24，pp。3896-3901,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术
24. E. S. Gray, H. Rizos, A. L. Reid等，“循环肿瘤DNA监测治疗反应和检测转移性黑色素瘤患者的获得性耐药性，”癌靶，第6卷，第2期39，pp。42008-42018,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术
25. T. Reinert, L. V. Schøler, R. Thomsen等，“结肠直肠癌手术后循环肿瘤DNA监测疾病负担的分析，”肠道，第65卷，第5期4, pp. 625-634, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术
26. S. V. Bratman, A. M. Newman, A. A. Alizadeh, M. Diehn，“CAPP-Seq超灵敏循环肿瘤DNA检测的潜在临床应用”，分子诊断学专家评论，第15卷，第5期。6, pp. 715-719, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术
27. C. K. Y. Ng, G. G. Di Costanzo, N. Tosti等，“therapy-naïve肝细胞癌患者血浆来源的细胞游离DNA的遗传图谱:一项初步研究，”《肿瘤学，第29卷，第2期5、pp. 1286-1291, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
28. K. Sun, P. Jiang, K. C. A. Chan等，“通过全基因组甲基化测序对无创产前、癌症和移植评估的血浆DNA组织定位，”国家科学院的诉讼程序，第112卷，第40号，第E5503-E5512页，2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术
29. L.D.Moore，T.Le和G.Fan，“DNA甲基化及其基本功能，”神经咽部医生，第38卷，第1期，第23-38页，2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术
30. C. K.Y.NG，G.G.ID Costanzo，L.M. Terracciano和S. Piscuoglio，“肝细胞癌的无细胞DNA：当前的见解和前景”，前沿的医学，第5卷，2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术
31. K. Kichko，P.Marschall和S. Flessa，“美国和德国的个性化医学：广泛实施”医疗标准“的意识，接受，使用和前提条件，”个性化医学杂志，第6卷，第2期2，第15页，2016。视图:出版商的网站|谷歌学术
32. S. Abou Daya和R.Mahfouz，“循环肿瘤DNA，液检和下一代测序：综合技术和临床应用审查，”元基因，第17卷，第192-201页，2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
33. M. H. D. Neumann, S. Bender, T. Krahn，和T. Schlange，“液体活检中的ctDNA和ctc -现状和我们需要进展的地方，”计算和结构生物技术杂志，卷。16，pp。190-195,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
34. L. Sorber, K. Zwaenepoel, V. Deschoolmeester等，“循环无细胞核酸和血小板作为为肺癌患者提供个性化治疗的液体活检，”肺癌，卷。107，pp。100-107,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术
35. H Li，C.Jing，J.Wu等，“循环肿瘤DNA检测：结直肠癌管理的潜在工具（审查），”肿瘤学信件，卷。17，pp。1409-1416,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
36. 张,C.-W。Xu, Y. Shao等，“液滴数字PCR与常规定量PCR检测EGFR基因突变的比较”，实验与治疗医学，卷。9，不。4，pp。1383-1388,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术
37. Z.邵忠，Z. Ming，P. Haiyan，Z. Aiping，Y.Qiao和S. Xiangqun，“武器的比较”检测到术EGFR突变和手术与活检肿瘤组织的EGFR-TKI疗效预测在NSCLC患者中，“医学肿瘤学，卷。31，不。5，pp。1-9,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术
38. J. Liu, R. Zhao, J. Zhang, and J. Zhang，“ARMS for EGFR突变分析的细胞学和相应的肺腺癌组织标本，”癌症研究与临床肿瘤学杂志CHINESE，第141卷，第141期2, pp. 221-227, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术
39. A.A.Chaudhuri、M.S.Binkley、E.C.Osmundson、A.A.Alizadeh和M.Diehn，“通过分析循环肿瘤DNA预测放疗反应和治疗结果，”放射肿瘤学研讨会，卷。25，不。4，pp。305-312,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术
40. Cheng，L.Su和C.Qian，“循环肿瘤DNA：癌症液体活组织检查中一个有希望的生物标记物，”癌靶，第7卷，第5期30, pp. 48832-48841, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术
41. J.C.M.Wan，C.Massie，J.Garcia Corbacho等人，“液体活检成熟：实现循环肿瘤DNA。”自然评论。癌症，第十七卷，第二期4, pp. 223-238, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学术
42. J.García-Foncillas，E. Alba，E. Aranda等，“将光束技术作为液体活组织检查，以结直肠癌患者管理临床实践：专家工作组审查”《肿瘤学第28卷第2期12, pp. 2943-2949, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学术
43. D.C.Koboldt，K.Chen，T.Wylie等人，“VarScan：个体和集合样本大规模平行测序中的变异检测，”生物信息学，第25卷，第17期，第2283-22852009页。视图:出版商的网站|谷歌学术
44. J.A. REUTER，D.V. Spapk和M. P. Snyder，“高通量测序技术”分子细胞，第58卷，第2期4, pp. 586-597, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术
45. J.C.Thompson，S.S.Yee，A.B.Troxel等人，“通过无细胞循环肿瘤DNA的下一代测序检测肺癌患者的治疗靶向驱动和耐药突变，”临床癌症研究，第22卷，第23期，第5772-5782页，2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术
46. A. M. Aravanis, M. Lee, R. D. Klausner，《用于早期癌症检测的下一代循环肿瘤DNA测序》，细胞，第168卷，第4期，第571-574页，2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术
47. “循环肿瘤DNA作为肿瘤检测的生物标志物，”基因组学、蛋白质组学和生物信息学，第15卷，第5期。2, pp. 59-72, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学术
48. H. Ishii, K. Azuma, K. Sakai等，“EGFR突变NSCLC中血浆细胞游离DNA的数字PCR无创检测耐药机制:与配对肿瘤样本的相关性”癌靶，第6卷，第2期31，PP。30850-30858,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术
49. J. A. Denis，A. Patroni，E. Guillerm等，“来自结肠直肠癌患者的循环肿瘤细胞的液滴数字PCR可以预测手术前的KRAS突变，”分子肿瘤学，第10卷，第5期。8, pp. 1221-1231, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术
50. D. Chu, C. Paoletti, C. Gersch等，“转移性乳腺癌患者循环血浆肿瘤DNA中的ESR1突变”，临床癌症研究，第22卷，第4期，第993-999页，2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术
51. A.Ashida、K.Sakaizawa、A.Mikoshiba、H.Uhara和R.Okuyama，“使用竞争等位基因特异性TaqMan PCR对黑色素瘤患者循环肿瘤源性DNA中BRAFV600E突变进行定量分析，”国际临床肿瘤学杂志，卷。21，不。5，pp。981-988,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术
52. J. H. van Ginkel, D. A. van den Broek, J. van Kuik等，“使用液滴数字PCR用于未来分子癌症诊断的无细胞DNA分析的分析前血液样本检查”，癌症医学，第6卷，第2期10，pp。2297-2307,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术
53. E. Heitzer, P. Ulz, J. Belic等，“通过全基因组测序确定前列腺癌患者循环中的肿瘤相关拷贝数变化”，基因组医学，卷。5，不。4，p。2013年30日。视图:出版商的网站|谷歌学术
54. A. M. Newman, S. V. Bratman, Jacqueline To等人，“一种用于广泛患者范围内定量循环肿瘤DNA的超灵敏方法，”自然医学，第20卷，第2期。5, pp. 548-554, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学术
55. A.M.Newman，A.F.Lovejoy，D.M.Klass等人，“改进循环肿瘤DNA检测的集成数字错误抑制，”自然生物技术第34卷第3期5, pp. 547-555, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术
56. E.Bohers，P.J.Viailly，S.Dubois等人，“通过下一代测序检测到的无细胞循环DNA的体细胞突变反映了诊断时生发中心B细胞样和活化B细胞样弥漫性大B细胞淋巴瘤的遗传变化。”血液学号，第100卷。7, pp. 270,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术
57. T.Hahn、C.K.O'Sullivan和K.S.Drese，“聚对苯二甲酸乙二醇酯膜上DNA场放大电动捕获预浓缩的微系统，”分析化学第81卷第1期8, pp. 2904-2911, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学术
58. M.Sun、J.S.Lin和A.E.Barron，“通过微流控芯片电泳在混合聚合物基质中超快、高效分离大尺寸双链DNA：实验设计方法，”电泳，第32卷，第22期，第3233-32402011页。视图:出版商的网站|谷歌学术
59. A. Barry和S. Cohen，“基因组DNA降解的质量评估”基因工程与生物技术新闻，卷。33，不。16，p。2013年28日。视图:出版商的网站|谷歌学术
60. C. H. Kuo，J.H. Wang和G. B. Lee，“一种用于DNA预浓度和分离的微型制衡的CE芯片，利用常闭阀”，“电泳，第30卷，第18号，第3228-32352009页。视图:出版商的网站|谷歌学术
61. K.H.Paik，Y. Liu，V.Gabard-Cossa等，“通过纳米流体晶体管控制DNA捕获”，ACS纳米，第6卷，第2期8, pp. 6767-6775, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学术
62. B. Vogelstein和K. W. Kinzler，《数字PCR》国家科学院的诉讼程序，第96卷，第2期16，第9236-9241页，1999。视图:出版商的网站|谷歌学术
63. M. Baker，“Digital PCR击中了它的步伐，”自然方法，第9卷，第6期，第541-544页，2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术
64. D.Pekin，Y.Skhiri，J.-C.Baret等人，“使用液滴微流体对罕见突变进行定量和敏感检测，”芯片上的实验室，第11卷，第5期。13, pp. 2156 - 2166,2011。视图:出版商的网站|谷歌学术
65. S. S. Bahga, C. M. Han，和J. G. Santiago，“利用双向等速电泳整合快速DNA杂交和毛细管区带电泳”，分析师第138卷第1期1, pp. 87-90, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术
66. R.Malbec，J.Cacheux，P.Cindelier，T.Leichlé，P.Joseph和A. Bancaud，微流体分布DNA样本分析：对血液血浆中无细胞循环DNA的基因检测开放挑战，“微纳工程，卷。1，pp。25-32,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
67. F. Mughal, S. J. Baldock, E. G. Karimiani, N. Telford, N. J. Goddard, P. J. R. Day，“微流控通道辅助筛选造血系统恶性肿瘤，”基因、染色体与癌症，第53卷，第3期，第255-263页，2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术
68. Y.Guan，O.Mayba，T.Sandmann等人，“通过基于微流控的多重PCR和下一代测序对循环肿瘤DNA进行高通量和灵敏定量，”分子诊断杂志第19卷第2期6、pp. 921-932, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学术
69. C. D. M. Campos，S.S.T.Gamage，J.M. Jackson等，“微流体基固相提取细胞自由DNA”，芯片上的实验室，第18卷，第22期，第3459-34702018页。视图:出版商的网站|谷歌学术
70. G. Samla, K. B. Gan, and S. M. Then，“Solid phase microextraction based micro device for extraction of PCR amplification DNA，”国际纳米电子与材料杂志，第10卷，第63-802017页。视图:谷歌学术
71. C. E. Jin, B. Koo, T. Y. Lee等，“从血浆中简单和低成本的无细胞核酸取样用于快速和敏感检测循环肿瘤DNA，”科学进步，第5卷，第10期，2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术

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