文摘

可靠、快速、低成本的生物传感器在医学诊断使用DNA序列检测一直开发和测试检测细菌”炭疽杆菌”。在这种传感器,聚[9 9-di (6 - - - - - - N, trimethylammonium) hexylfluorenyl-2 7-diyl) -alt-co -二溴化(4-phenylene)]盐(PFP)作为阳离子共轭聚合物与染料荧光素(CCP)和附加机构( )作为探针。这个传感器的基本原理是,当一个 与单链DNA探针杂交(ssDNA)互补序列,福斯特共振能量转移(FRET)可能发生从亲 / DNA复杂。如果烦恼是有效的,光致发光从亲民党将高度淬火和 将会增强。另一方面,如果DNA序列noncomplementary机构,烦恼就不会发生。

1。介绍

传统的医学诊断方法通常是非常昂贵和费时,大多是基于感染者的抗体检测。在这些方法中,抗体和抗原结合的结构必须首先确定。有时诊断的成本可能会比这更高的待遇,这使得需要快,便宜,可靠的医疗诊断技术必不可少的。DNA序列的检测是一个重大的科学兴趣的话题。其应用领域包括临床诊断,单核苷酸多态性(SNP)的基因,环境研究,反恐和法医分析(1]。这动机小说DNA传感器和光学的发展(2- - - - - -6,声7,8),或电子(9- - - - - -13读出。其中,光学(荧光)检测方法让他们的地方,因为他们的高灵敏度,选择性,易于操作14]。均匀的DNA杂交分析基于福斯特共振能量转移(FRET)供体和受体分子之间的吸引力由于其简单的操作和使用标准的光学仪器。共轭聚合物(CPs)拥有一个独一无二的结合光电特性,发现使用在各种各样的领域(15]。在目前的生物传感器应用,CPs作为聚光分子。CPs表现出高效的能量迁移以及他们的非定域化的骨干和收集到的能量可以通过烦恼有效地转移到受体(16- - - - - -19]。共轭聚合物的化学结构提供了几个优势的响应基础化学和生物检测方案基于光学方法。CPs可能被视为一组短,共轭(低聚物的)单位饲养在一起的聚合物骨干。他们的结构允许有效的电子耦合,因此快速内部和跨链能量转移(20.,21]。

在本文中,我们报告的方法制备,操作,和应用的生物传感器提供了快速、敏感,和选择性检测的DNA杂交利用水溶性阳离子共轭聚合物(CCP)和机构调查。分析的三个组件是一个蓝色发光阳离子共轭聚合物,也就是说,polyfluorenephenylene (PFP),肽核酸探针荧光染料(PNAC的标签*),C*荧光素染料和带负电荷的目标单链DNA (ssDNA),这可能是互补(互补)或noncomplementary (nDNA)机构序列。施主聚合物和受主PNAC之间的烦恼*用于检测特定的存在ssDNA序列DNA的序列和机构是互补。机构/ DNA复合物杂交更快和更严格和更具体的比类似的DNA / DNA复合物(22]。这是由于这样的事实,铌的带负电荷的DNA链之间的斥力,这是缺席的情况下带负电荷的DNA和中立的机构。然而,机构复合物从而更耐热,由于他们的支柱,那么容易生物降解核酸酶,蛋白酶、肽酶(23,24]。此外,他们一般不敏感离子强度和pH值在杂交提供了更广泛的平台进行DNA检测。

PFP提供足够的量子能量时,它会吸收光子并达到电子激发态(激发单重态)和发出蓝色的PL。一旦形成,激发单重态立即失去多余的能量,与sourroundings交互。激子可以以多种方式即失去能量,荧光,系统,光漂白、碰撞与淬火物种,交互和非辐射的能量转移(烦恼)25)附近的一个分子的激发导致的邻居。在这种情况下,激子失去了能量(ps)的非辐射的能量转移到附近的受体PNAC*分子导致它激发导致排放的绿色的光受体(荧光染料)。在复合解决方案中,杂交的中立机构调查带负电ssDNA显著负PNAC之间创建一个静电吸引*/ DNA复杂和积极的项目,从而使荧光团和聚合物充分接近允许高效的烦恼,也就是说,在福斯特临界半径。的时间尺度能量从供体转移到受体取决于它们之间的距离。这个距离是接近福斯特临界半径时,能量转移发生在飞秒(26]。另一方面,捐赠者的激发态衰变PFP发生指数平均寿命 90 ps ( 30 ps的受体)[27]。静电能量,因此,从供体转移到受体前前可以发出其光致发光(PL)。PL发出的捐赠将淬火显著提供两个之间的距离在福斯特临界半径。

当亲民党添加到带负电荷PNAC*/ DNA复杂,它只是绑定到地区之间存在着互补DNA和PNAC*。光学放大由于担心是光的结果令人兴奋的聚合物(PFP),在有利的条件下(合适的供体和受体之间的距离在海里)染料转移能量,释放放大特性的绿光。另一方面,对于noncomplementary ssDNA,没有发生能量转移,因此没有或很弱的发射受体。传感器的详细示意图如图1。


图1
传感器使用聚合物和PNAC的示意图表示*探测器探测到互补DNA序列(28]。

2。实验

2.1。材料

为开发一个典型的传感器炭疽杆菌检测,我们选择了蓝色发光,水溶性,阳离子共轭聚合物(PFP),一个已知机构调查对应一段炭疽(炭疽杆菌)与荧光染料(荧光素),两个DNA引物,一个补充和其他noncomplementary机构序列。发光的水溶性阳离子共轭聚合物是购自美国染料来源,Inc .)、加拿大。的机构调查炭疽杆菌韩国从Panagene购买。20-mer链用荧光素标记染料时使用下列顺序对应: 机构序列,“N”代表自由氨基,对应于肽的氨基端和“C”是酰胺化羧基末端,对应的C端肽。已知机构显示疏水相互作用,导致聚合在高浓度时,表明实验必须在非常低的浓度(< 10−5米)。ssDNA对应以下序列来自班加罗尔Genei,印度:

ssDNA(引物序列5′到3′20 mer)

GCAACCCTAACACCATTTAC(互补),

ssDNA(引物序列5′到3′20 mer)

GACTCAATGGCGTTAGACTG (nDNA)。

2.2。光谱测量

PNAC的解决方案*在去离子水和DNA准备从TKA水过滤系统。亲,去离子水的溶剂混合物/乙醇(1:1 v / v)使用。PFP和PNAC的荧光测量*是用日本岛津公司Spectrofluorophotometer模式rf - 5301电脑配备了氙气灯激励源和吸收光谱观察用日本岛津公司UV - 2450紫外可见分光光度计模型为不同的摩尔浓度。光谱被记录在350 nm - 700 nm范围。光谱重叠项目供体的发射光谱与受体的吸收光谱PNAC*如图2。PNAC*实验中使用的pH值5.5用0.1 N盐酸和去离子水。优化后的浓度供体(2.3×10−7米)和接受者(2.5×10−8米),机构调查(pH = 5.5 10点−8退火70米)˚C,与其互补ssDNA和noncomplementary ssDNA (10−8米)。退火是35 - 40分钟完成为了提高ssDNA和PNAC之间的杂交*(28]。解决方案被允许慢慢冷却到室温和PFP添加25的小步骤μL (2.3×10−7米以上的解决方案,也就是说,150年μL每个PNAC*和ssDNA克分子数相等的浓度为2.5×10−8M。样本被放置在一个旋涡混合器之间荧光测量(每次添加聚合物)混合组件。由此产生的荧光发射光谱进行比较,观察到荧光素的增强发射是最大的,也就是说,烦恼成为饱和当受体(PNAC的比值*)到供体(PFP)大约是1:1之后没有变化是观察到的荧光强度从PNAC获得*如图3。


图2
项目吸收和发射光谱的(在10−7米)和PNAC的*(在10−8米)。

图3
PL排放强度变化的受体,PNAC*(在激发波长450 nm)不同的受体/捐赠者比率(D)从1:0 1:2 PNAC的解决方案*和补充ssDNA。在1:1比例,烦恼的饱和度是观察,没有进一步增加在PL发射高:D比率。

可能会提到,我们不得不使用激发波长450 nm获取供体和受体之间的烦恼。可以看到从图1在这个波长,捐赠者的吸光度降低超过90%相比其峰吸光度。然而,相比捐献者,受体有一个非常可怜的吸光度。项目峰吸光度的测量由我们在目前的实验是PNAC的2.8在376海里*,0.016在490海里,我们不得不选择激发波长以这样一种方式,在承兑人虽然有足够的吸光度的吸收成本捐献者。

高效烦恼的条件满足时,显著增强受体荧光强度和荧光强度下降的捐赠者观察到由于淬火的荧光供体如图4。


图4
PL捐赠PFP和受体PNAC的排放强度*(在激发波长450 nm)对应:D比率,1:0.08和1:1。最大的烦恼时,供体由7次淬火。

比较PNAC的发射光谱*的补充和noncomplementary ssDNA如图5。强烈的发射荧光素荧光染料由于高效的烦恼在互补DNA链的存在。烦恼的效率依赖于逆6次方供体和受体之间的距离,是由 在哪里 是距离的一半的能量转移。福斯特临界半径 (纳米)相关的光谱重叠的关系(29日]: 在哪里 描述的相对取向是一个因素在空间跃迁偶极之间的供体和受体, 重叠积分供体的发射光谱与受体吸收波长(纳米),η介质的折射率, 量子产率的捐献者。如果供体和受体之间的距离是在福斯特临界半径 计算为6.4 nm之间PFP和荧光素使用(2),担心能源将提高受体发射和淬火的PL捐赠项目。如果杂化之间的平均距离复杂和亲民党分子比福斯特半径,就没有有效的能源从供体转移到受体,因此没有发射的荧光团。因此,这个距离已经被不同的浓度优化解决方案的供体和受体如图6。我们也计算了能量传递效率为不同浓度的捐赠的使用(1),它可以观察到从图6施主浓度的增加,能量传递的效率也会增加,直到饱和的烦恼,没有观察到变化超出了acceptor-donor比例1:1,为1:3,进一步。


图5
PL PFP和PNAC的发射光谱*在存在互补(a)绿色(如图所示)和noncomplementary ssDNA (b)蓝色(如图所示)。PNAC的发射光谱*在缺乏直接激发聚合物也显示(通过(c)红色)。

图6
能量转移效率,烦恼从供体与受体的浓度的变化。插图显示了分离的距离R供体和受体之间的对应不同的:D比率。

3所示。结果与讨论

最大重叠的条件项目供体的发射光谱与受体的吸收光谱PNAC*发生有效的烦恼的满意是很清楚从图2。荧光研究执行PFP / PNAC的综合解决方案*/ ssDNA(互补和noncomplementary激发波长450 nm)表明,荧光发射PFP / PNAC约12倍*/ ssDNA(互补)相对于PFP / PNAC*/ ssDNA (noncomplementary)复杂,只观察到微弱信号(图5)。实验重复了四次获得一致的结果在5%以内。这个大区别排放强度(互补和noncomplementary ssDNA)验证我们所使用的技术检测的DNA序列有可能利用共轭聚合物的光学放大检测DNA杂交。它可以看到从图6担心浸透超出:D比例1:1,也分离距离计算使用(1供体和受体之间)减少到这个比例。这项技术不仅是简单,但需要非常低(10−7-10年−8米)的浓度PFP、机构和ssDNA从而使传感器的成本效益。记者(PNAC物*)“打开”只有当目标ssDNA出现在解决方案。该技术不需要多个探针和复杂的DNA结构。有趣也将确定传感器的检测极限,也就是说,PNAC的最低浓度*可用于本实验。我们试图激发PNAC PL*解决方案有一个10的浓度−9M。将看到图7,仪器不能探测PL发射和只观察到的噪音。因此,我们得出这样的结论:PNAC的检出限*是~ 10−8M。


图7
PL发射PNAC的*摩尔浓度为2.5×10−8M和2.5×10−9(在激发波长492 nm)。

4所示。结论

FRET-based传感器的典型机构调查炭疽杆菌已成功测试了。同样,等各种细菌,机构调查大肠杆菌,铜绿假单胞菌,金黄色葡萄球菌将被用于规范传感器对其他未知的DNA序列。可能会提到,我们提出了一种低成本的便携式传感器(30.基于上述技术,在一个小的紫外灯作为来源激动人心的聚合物。条件下高效的烦恼,亲民党的PL淬火,染料和能量转移的重要受体的排放强度是观察到的变化。这种技术是快速和成本效益比其他传统的诊断技术,不仅昂贵而且耗时和不可靠。

确认

作者要感谢部门生物技术(印度生物技术部),印度的金融支持(BT / PR6440 /地中海/ 14/812/2005)。作者也要感谢王妃Gupta博士和教授r K Saxena(德里大学微生物系南校区,新德里,印度)为他们的有益的建议和实验工作提供帮助。