建立一个实验程序，准备试验血清样本，以进行特定的血清诊断犬弓蛔虫用于外部质素评估计划

抽象

背景。外部质量评估（EQA）提供的可靠，准确和精确的结果证据使用的诊断测试客户犬弓蛔虫。目的。要建立一个程序，生产标准犬弓蛔虫用于EQA血清诊断测试的血清样本。方法。将收集的血清样品含有抗犬弓蛔虫抗体通过ELISA筛选，并通过Western印迹证实。这些样品被发现是对其它寄生虫抗体，抗HIV-1和-2的抗体，抗HCV抗体和抗体HBs抗原阴性。血清被划分，通过两者冷冻干燥和冷冻方法进行处理，然后被存储。样品的稳定性和均匀性后7天，1个月，3个月，6个月进行了评价。一个 -测试和一个 -采用检验方法评价其均匀性和稳定性。结果。ELISA阳性的11份标本中，有10份经Western blotting鉴定为5种特异性阳性反应犬弓蛔虫乐队。两批试验标准血清含有特异性抗犬弓蛔虫抗体成功产生。DK Lot浓度为 NovaTec单位(NTU)和Lot DL的浓度 南大。冷冻干燥法制备的样品在-80℃保存后至少稳定3个月，冷冻法制备的样品至少稳定6个月( ）。两种方法制备的样品在30℃( ）。结论。抗的特定血清诊断样品犬弓蛔虫对于EQA抗体可以产生的且具均匀性和稳定性通过冷冻干燥分别持续3个月，6个月和冷冻方法。在30℃下，通过这两种方法制备的样品是稳定7天，适于递送至远程实验室。

1.简介

人类弓蛔虫病被描述为是最常见的公共的一个和由感染的幼虫经济临界人畜共患寄生虫病犬弓蛔虫和弓蛔虫软件[1]。人类通过多种途径，如来自受污染的土壤，水生蔬菜或水果感染性虫卵误食的收购弓蛔虫病。大多数感染是无症状的;两种截然不同的临床综合征的经典认识：内脏幼虫农民和眼幼体移民（一种全身性疾病通过各种主要器官，包括肺脏，肝脏，肌肉和中枢神经系统造成幼虫迁移）（疾病局限于眼和视神经）如葡萄膜炎。全球流行犬蛔虫感染或暴露于人类，使用血清学测定法确定的，虽然仍然局部变化从1.6到87百分比[1]。反犬蛔虫血清抗体已经报道45.2％，越南在2012年南部[2]。除血清学或免疫学方法外，弓形虫病和弓形虫感染的诊断可通过组织病理学检查、幼虫形态评估(如果存在)或从组织或体液样本中特异性检测幼虫DNA进行。其中，寄生虫的活检和目视检测是鉴定的金标准。然而，这种方法具有极强的侵入性，取决于幼虫的数量和感染的阶段[3]。因此，许多血清学方法被开发并广泛应用于临床。然而，血清学和免疫学检测的敏感性和特异性依赖于抗原(例如，来自犬蛔虫幼虫，原生或重组弓蛔虫属。排泄分泌（TES）的抗原，或任一聚糖抗原或去糖基化TES抗原）和抗体（的类型例如，正在测量的总IgG，IgG亚类或IgM）[1]。长期以来，在ELISA中使用TES抗原作为标准免疫学方法。然而，针对其他蠕虫感染产生的抗体可引起与TES抗原的交叉反应[4]。因此，血清学检测的特异性是极其重要的。为了消除假阳性结果，需要Western blotting确认[3]。

EQA是实验室的质量管理系统的关键要素之一，按照ISO 15189：2012 [五]。此外，EQA提供的使用实验室的服务所有客户可靠，准确和精确的结果客观证据。抗的具体血清学诊断犬弓蛔虫对于EQA抗体旨在提高筛查质量和诊断测试犬弓蛔虫，它对通过实验室间比较来控制和评价实验室的质量起着关键作用。EQA的参与对所有医学化验室都至关重要[6]。上执行弓形虫属的血清学诊断实验室的质量报告。从2004年临床实验室在中国进行到2013年由国家中心。结果是5384个弓形虫特异性IgM EQA测试报告和2666个弓形虫特异性IgG EQA测试报告。84.3和99.6％之间的IgM的检测范围;61.1和99.3％之间的IgG检测范围内。最常见的问题是未能及时发现的抗体[低滴度7]。

Ideal samples for an EQA program would satisfy a range of criteria: stable for the conditions under which they will be transported and stored, homogeneous across all the aliquots produced, have analyte concentrations that include the expected clinical range, include appropriate sample types (e.g., urine, whole blood, and serum), available in sufficient volume, inexpensive enough for cost not to be an impediment, and behave in clinical laboratory measurement procedures in the same manner as patient samples. In practice, it is impossible to achieve all these goals, and some compromises are required in the preparation of EQA materials [8]。到目前为止，还没有针对抗-的特异性血清诊断的试验样品的生产和EQA项目的开展犬弓蛔虫据报道，在越南的抗体。因此，我们开发了一个程序用于生产含有特异性抗标准样品犬弓蛔虫抗体在EQA使用。

2.材料和方法

2.1。样品采集

这项研究是从与狗或相关物种有密切接触并显示某些特定弓形虫病症状的献血者那里收集的血清样本进行的[9-11]。这些样品都示出为具有特定的阳性反应的IgG抗犬弓蛔虫越南平定省疟疾寄生虫学和昆虫学研究所的抗体。

九月至2017十二月，即满足所设计的纳入标准所收集的血清样品提取到Eppendorf管中并储存在-20℃。所有样品被运到卫生，医药大学胡志明市部下属的质量控制中心医学实验室，在过程中的后续步骤。

该储存48小时后已变成暗溶血样品或血清被排除在本研究中。为了确保血清样品的均匀性，所有样品运输和储存期间保持在-20℃。样品通过两个测试犬弓蛔虫IgG ELISA (NovaTec Immundiagnostica GmbH, Germany)弓蛔虫Western印迹的IgG（LDBIO诊断，法国里昂）来确认特定的存在的IgG抗犬弓蛔虫抗体(12]。以确保捐献者没有感染其他在越南流行的寄生虫[13，14，以及为了防止潜在的交叉反应，使用ELISA技术对这些样本进行了检测，发现对其他蠕虫抗体呈阴性，包括有钩绦虫IgG抗体，细粒棘球绦虫的IgG，小束IgG抗体，Paragonimus westermani免疫球蛋白,Clonorchis sinensisIgG (Creative Diagnostics，纽约，美国)[15]。其结果为阴性的抗体对HIV-1的所有样本，HIV-2，选择HCV和HBV用于进一步分析。

2.2。步骤

将试验样品分为两批，在不同的条件下存放。冷冻法样品保存在-80℃和2-8℃，冷冻干燥法样品保存在-80℃和2-8℃。每批含100管，每100管μ每根管子的样品。

均匀性和稳定性的测试方法符合ISO指南35和ISO 13528 [16]。从每批十管随机选择。ELISA测定，读取在450波长η米，被用来评估均一性。使用如由制造商规定的下式的吸光度值转化成单位NOVATEC（NTU）： (>11 NTU被认为是阳性的，由制造商指定)。1个月、3个月、6个月后进行稳定性评估，每个批次随机抽取3支试管，采用ELISA法测定NTU，并计算相应时间点的NTU平均值。

2.3。数据分析

该 -进行单因素方差分析(one-way ANOVA)以评估样本的同质性( ）。该 -测试(独立样本 -测试), ，在 ，让我们来评价样品的稳定性。SPSS 20.0软件（IBM，纽约州，美国）用于数据分析。

3.结果

3.1。反犬弓蛔虫特异性抗体评估

11份血清检出抗-阳性犬弓蛔虫ELISA测定:最低样本为31.52 NTU，最高样本为56.58 NTU(表)1）。特异性IgG抗体犬弓蛔虫antigens were found to be positive for 5 bands between 24 and 35 kDa that were specific to犬弓蛔虫免疫印迹技术(图1）。然而，试样编号2具有否定的结果。没有样品呈阳性抗其它蠕虫抗体以外的样品9（表2或对抗艾滋病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。

只有样品9显示出与反应小束IgG，其他样品与犬弓蛔虫IgG和对其他蠕虫没有反应（表2）。

在这些11个样品，条数3-12表明在ELISA和Western印迹的阳性反应，而带材号2显示阳性ELISA结果和负Western印迹结果;条数1表示阳性对照样品（图1）。

该serum samples that reacted with the 5 bands between 24 and 35 kDa in the Western blotting, confirming that they contained specific anti-Toxocara antibodies, were divided into microcentrifuge tubes and processed by freezing or freeze-drying. This produced two lots of trial samples containing IgG antibodies specific to犬弓蛔虫：（一世）批次1：样品通过冷冻干燥法（100管）产生的，用含有100每个管 μ血清样品L的与31.01 NTU的浓度(2)批次2：样品通过冷冻方法（100管）产生的，用含有100每个管 μ血清样品L的与27.18 NTU的浓度

3.2。均一性研究

表3节目同质样本的评估结果DK和DL。通过冷冻法（DL）中产生的样品具有一个的2。52，小于3.02。用冻干法(DK)制备的样品具有an的0。59，小于的3.02（表3）。我们假设假设被接受。这一发现表明，通过冷冻干燥和冷冻方法都被生产，对于EQA试验样品是均质的。

3.3。稳定性评价

3.3.1。血清样品的长期稳定性

当储存在-80℃下，冷冻干燥的样品至少3个月是稳定和冷冻样品稳定6个月（ ）。通过这两种方法制备的样品在30℃下为7天稳定（ ）。

表4结果表明，冻干后的血清标本在-80℃保存1个月时间内保持稳定 。通过冷冻制备的血清样品稳定6个月时贮存在-80℃，用一 。6个月后抗体浓度下降。在-80℃条件下，冻干样品1个月浓度为31.87 NTU, 3个月浓度为28.48 NTU, 6个月浓度为28.02 NTU，冷冻样品1个月浓度为27.3 NTU, 3个月浓度为26.79 NTU, 6个月浓度为26.44 NTU(表)4）。这些结果表明，冷冻样品（DL）是稳定6个月。

30℃时，冷冻干燥和冷冻法制备的血清标本稳定7天(表)五）。

3.3.2。结果制备了犬弓形虫抗抗体的试验血清样品

生产的样品进行的抗血清学诊断的具体程序犬弓蛔虫通过外部质量评估方案的抗体已发展（图2）。

4。讨论

4.1。试用样品含有抗弓蛔虫质量的测定犬抗体用于EQA

4.1.1。该样品试用

生产含有抗血清的方法犬弓蛔虫从抗体取自患者不添加防腐剂的血清样本的收集开始。人血清是最好的选择，但这只是建议在情况下，当动物血清是不合适的。免疫反应，弓蛔虫狗、猫、兔子和人类的sp.是完全不同的[17-19]。在这项研究中，血清取自患者。我们没有使用混合血清，因为混合可能会影响抗的特异性犬弓蛔虫抗体。当所有的样品都含有抗氧化剂时，应进行混合弓首canis-特异性抗体，这将增加生产成本。原始的黄色血清不含血细胞，未溶血或混浊。血清中血红蛋白10 mg/mL、甘油三酯5 mg/mL、胆红素0.2 mg/mL可能会干扰ELISA结果。对标本进行筛选，发现HbsAg抗体、hcv抗体和hiv -1/2抗体均为阴性。然而，这些样品必须作为潜在的传染性产品处理。

10份血清均含抗犬弓蛔虫ELISA鉴定的抗体在Western blotting分析中有5条24 ~ 35kda的条带。这些条带成组且分离良好，具有特征性且通常容易观察到[20.，21]。因此，特异性的抗评估犬弓蛔虫当制造用于…的血清时，原始血清中的抗体是必要的犬弓蛔虫外部质量评估。

下一阶段是按照ISO / IEC 17043实施：2011 [22和ISO 13528: 2015 [16]。

4.2。冷冻干燥和冷冻方法生产的样品的均匀性和稳定性

冻干和冷冻是世界范围内用于外部质量评价的样品的两种生产方法。经冷冻干燥和冷冻制备的血清标本经费希尔试验发现均质。这是合理的，因为我们的样本材料是从患者的血清中提取的，没有添加防腐剂，因此保持了相同的底物，确保了同质性。冷冻法制得的样品比冷冻干燥法制得的样品更均匀。冻干法制备的样品均一性较差，这可能是由于冻干和还原的影响。冷冻法制得的样品比冷冻干燥法制得的样品更稳定:水中的氢键对蛋白质结构的稳定性有显著的贡献。在这种情况下，在冷冻干燥方法中，水分的去除往往会导致蛋白质的物理不稳定性。此外，即使在冷冻干燥成功后，蛋白质的结构也可能受到合成、氧化、美拉德反应和水解等因素的影响。因此，冻干方法的长期稳定性可能仍然受到限制，特别是在高温下。这些问题可以通过选择最佳pH值和保留水分来最小化，更重要的是，通过添加稳定剂来防止在冷却过程中组织冻结和细胞破坏[23]。

4.3。用于EQA的犬弓形虫抗体试验样品的生产过程

试样的生产流程已经完成。该方法可用于大量生产含抗-的标准血清样品犬弓蛔虫在未来EQA。整个过程满足了实验室生物安全手册的要求[24]。通过使用免疫印迹在4^th步骤，抗的特异性犬弓蛔虫血清标本中抗体增加。ISO/guide 35:2017和ISO 13528: 2015是我们评价样品均匀性和稳定性的标准。因此，生产的样品在贮藏期间保持了质量。

5.结论

（1）特异性IgG抗体犬弓蛔虫Western blotting分析发现血清中抗原呈阳性，有5条条带，条带在24 ~ 35kda之间（2）冻干法制备的样品比冻干法制备的样品均匀、稳定:冻干法制备的样品在-80℃条件下稳定3个月，冻干法制备的样品在-80℃条件下稳定6个月。在30℃下，两种方法制备的试验样品均稳定7天（3）介绍了抗氧化剂EQA试验样品的制备过程犬弓蛔虫抗体可用于生产用于寄生虫病评估的血清学EQA样本

缩写

ELISA:	酶联免疫吸附试验
EQA:	外部质量评估
HBs抗体：	乙肝病毒表面
乙肝病毒:	乙型肝炎病毒
胡志明市：	胡志明市
丙肝病毒:	丙型肝炎病毒
艾滋病病毒：	人类免疫缺陷病毒
ISO / IEC：	国际标准化组织/国际电工委员会
NTU：	NovaTec单位
SPSS：	社会科学统计软件包。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在本文中。

利益冲突

作者声明没有利益、经济或其他方面的冲突。

致谢

我们要感谢卫生部下属的医疗实验室质量控制中心——胡志明市医药大学提供的资金和设施支持。我们要特别感谢国民党疟疾、寄生虫学和昆虫学研究所二级医学博士Dao Trinh Khanh Ly。

参考

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