JPR 寄生虫学研究期刊》的研究 2090 - 0031 2090 - 0023 Hindawi 10.1155 / 2020/6842975 6842975 研究文章 建立一个实验的程序准备试验具体的血清诊断的血清样本 犬弓蛔虫外部质量评估方案 https://orcid.org/0000 - 0003 - 3509 - 1814 Vu Quang驾车 1 2 3 Tran Diep老爷 1 Tran 福和农德孟Sieu 1 4 勒 范Chuong 1 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 8173 - 4115 黄齐的 Thi吴廷琰永 3 中方通过 Quang唱 3 对峙 何塞·F。 1 大学的医学和药学在胡志明市 越南 hcmut.edu.vn 2 大学医学中心的胡志明市 越南 bvdaihoc.com.vn 3 医疗质量控制中心实验室卫生部监督下 大学的医学和药学在胡志明市 越南 hcmut.edu.vn 4 阮火车医院 胡志明市 越南 bvnguyentrai.org.vn 2020年 10 2 2020年 2020年 09年 08年 2019年 28 12 2019年 16 01 2020年 10 2 2020年 2020年 版权©2020广Huy Vu et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

背景。外部质量评估(EQA)提供了可靠的证据,为客户准确、精确结果使用的诊断测试 犬弓蛔虫。客观的。建立一个生产标准的过程 犬弓蛔虫血清样本EQA血清学检测。 方法。收集到的血清样本含有反 犬弓蛔虫抗体筛选ELISA和免疫印迹证实了。这些样本被发现是负其他寄生虫抗体,anti-HIV-1和2抗体,anti-HCV抗体,哈佛商学院抗原的抗体。血清是分裂,由冷冻干燥和冷冻处理方法,然后储存。样品的稳定性和均匀性进行评估后7天、1个月、3个月、6个月。一个 F 以及和 T 以及应用于评估他们的均匀性和稳定性。 结果。11份样品中积极通过ELISA,十人通过免疫印迹证实通过阳性反应5具体 犬弓蛔虫乐队。两个大量的试验标准包含特定抗血清 犬弓蛔虫成功产生的抗体。很多DK的浓度 31.01 ± 1.1 NovaTec单位(南大),很多DL的浓度 27.18 ± 0.9 南大。在-80°C存储后,样品准备的冷冻干燥方法稳定至少3个月,和样品准备的冻结方法稳定为6个月( p > 0.05 )。样品由这两种方法都稳定在30°C(7天 p > 0.05 )。 结论。特定的抗血清诊断样本 犬弓蛔虫EQA可以产生抗体,具有同质性和稳定持续3个月和6个月的冷冻干燥和冷冻方法,分别。在30°C,这两种方法生产的样品稳定7天,适合交付远程实验室。

 医学健康大学和药房在胡志明市 1。介绍

人类有关描述是最常见的一种公众和经济上重要的人畜共患寄生虫病引起的感染的幼虫 犬弓蛔虫和 弓蛔虫软件( 1]。人类获取有关通过一系列航线,如误食感染性的鸡蛋从受污染的土壤,水,生蔬菜或水果。大多数感染是无症状;两种截然不同的临床症状一般公认:内脏幼虫移民(一种全身性疾病引起的幼虫迁移通过各种主要器官,包括肺、肝脏、肌肉和中枢神经系统)和眼部幼虫移民(一种疾病限于眼睛和视神经)如葡萄膜炎。全球普遍存在的 犬蛔虫感染或暴露于人类,决定使用血清学检测,虽然还是断断续续的,不同比例从1.6到87年( 1]。反的患病率 犬蛔虫血清抗体据报道2012年在越南南部的45.2% ( 2]。旁边血清学或免疫学方法,有关的诊断和弓蛔虫感染可以通过组织病理学检查,执行的形态学评估幼虫(如果存在),或幼虫的具体检测组织或体液的DNA样本。其中,活检和视觉检测寄生虫是一个黄金标准确定。然而,这种方法是极其入侵,取决于感染的幼虫负载和阶段( 3]。因此,许多血清学方法开发并广泛应用于临床的方法。然而,血清学和免疫学检测的敏感性和特异性取决于抗原(例如,原油产品 犬蛔虫幼虫、本地或重组 弓蛔虫种虫害excretory-secretory (te)抗原,或多糖抗原或deglycosylated te抗原)和抗体的类型(例如,总免疫球蛋白、免疫球蛋白子类,或者IgM)被测量( 1]。使用TES抗原的ELISA一直被用作标准免疫方法。然而,产生的抗体对其他蠕虫感染可引起交叉反应本地te抗原( 4]。因此,特异性血清学检测是非常重要的。排除假阳性结果,确认需要通过免疫印迹( 3]。

EQA的关键元素之一是实验室质量管理体系,依照ISO 15189:2012 [ 5]。此外,EQA提供客观证据的可靠、准确、精确结果使用实验室的服务所有客户。反的特定的血清诊断 犬弓蛔虫抗体对EQA旨在提高筛查和诊断测试的质量 犬弓蛔虫,起着关键作用的质量控制和评价的一个实验室通过多个实验室的比较。所有医学实验室(EQA的参与是至关重要的 6]。实验室的质量报告进行血清学诊断弓形虫sp.了从2004年到2013年在中国由国家临床中心实验室。结果5384 Toxoplasma-specific IgM EQA测试报告和2666 EQA测试报告Toxoplasma-specific免疫球蛋白。IgM检测介于99.6%和84.3之间;免疫球蛋白检测介于99.3%和61.1之间。最常见的问题是未能检测低浓度的抗体( 7]。

理想样本EQA程序可以满足一系列条件:稳定的条件,他们将运输和存储所有产生的整除均匀,被分析物的浓度,包括预期的临床范围,包括适当的样本类型(如尿液、全血和血清),提供足够的容量,足够便宜的成本不是一个障碍,和行为在临床实验室测量程序以同样的方式作为患者样本。在实践中,它是不可能实现所有这些目标,需要一些妥协EQA材料的制备( 8]。迄今为止,没有研究试验样品的生产和发射EQA特定的抗血清诊断程序 犬弓蛔虫抗体在越南被报道。因此,我们开发了一个程序包含特定的反生产标准样品 犬弓蛔虫用于EQA的抗体。

 2。材料和方法 2.1。样品收集

本研究收集的血清样本进行捐助者已经在密切接触狗或相关物种和显示一些特定的有关症状( 9- - - - - - 11]。这些样本显示与特定的免疫球蛋白g反正面的反应 犬弓蛔虫抗体疟疾寄生虫学、昆虫学研究所的平定省省,越南。

从2017年9月至12月,收集血清样本符合入选标准设计被提取到埃普多夫管和储存在-20°C。所有的样本运送到医疗质量控制中心实验室在卫生部医学和药学大学胡志明市,后续步骤的过程。

发生溶血样本或血清转暗48小时后的存储被排除在本研究之外。为了确保血清样本的同质性,所有样品都保持在-20°C在运输和储存。样品都进行了测试 犬弓蛔虫免疫球蛋白ELISA (NovaTec Immundiagnostica GmbH,德国) 弓蛔虫免疫印迹免疫球蛋白(LDBIO诊断,里昂,法国)确认的存在特定的免疫球蛋白g反 犬弓蛔虫抗体( 12]。确保捐赠者没有与其他寄生虫感染,具有高患病率在越南 13, 14),以及防止潜在的交叉反应,样本测试通过使用ELISA技术和发现其他寄生虫抗体是负的,包括 有钩绦虫免疫球蛋白, 棘球绦虫免疫球蛋白, 小束免疫球蛋白, Paragonimus westermani免疫球蛋白, Clonorchis sinensis免疫球蛋白(美国纽约创意诊断) 15]。所有样品为hiv - 1抗体阴性,hiv - 2,丙肝病毒和乙肝病毒被选作进一步分析。

 2.2。这个过程

试验样本分为两个很多,然后存储在不同的条件。冻结法样本存储在-80°C和2 - 8°C,和冷冻干燥法样品也存储在-80°C和2 - 8°C。每批包含100管,100 μL(样本/个人管。

均匀性和稳定性测试方法是符合ISO指导35和ISO 13528 ( 16]。十管每批随机选择。ELISA试验,在波长为450 η米,被用来评估同质性。吸光度值被转换成NovaTec单位(南大)指定的制造商使用以下公式: 病人 样品 的意思是 吸光度 价值 × 10 / 的意思是 吸光度 价值 的 的 减少 − 从 控制 = 南大 (> 11南大被视为积极的为指定的制造商)。稳定性评估后1个月、3个月、6个月,从每批随机测试三管决定南大ELISA和南大的平均值计算值在相应的时间点。

 2.3。数据分析

的 F 以及(单向方差分析)进行了评估样本的同质性( F 统计数据 < F 分布 )。的 T 以及(独立样本 t 以及), 团体 2 − 跟踪 > 0.05 ,在 α = 0.05 ,允许我们评估样品的稳定性。美国纽约SPSS 20.0软件(IBM)是用于数据分析。

 3所示。结果 3.1。Anti-Toxocara canis-Specific抗体评估

十一个血清样本阳性反 犬弓蛔虫高浓度的抗体,抗体由ELISA:最低的样品的浓度为31.52南大,和样品浓度最高的是56.58南大(表 1)。特定的免疫球蛋白抗体 犬弓蛔虫抗原被发现阳性5乐队从24到35 kDa,需要具体问题具体分析 犬弓蛔虫蛋白免疫印迹技术(图 1)。然而,样本2号有一个消极的结果。所有的样本阳性抗体其他寄生虫除了样本9(表 2)或对艾滋病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒。

反的结果 犬弓蛔虫特殊抗体的评估。

没有 ELISA 西方墨点法
截止 OD 南大 结果
1 质量控制 积极的
2 0.547 2.18 39.82 积极的 负
3 0.547 3.04 55.54 积极的 积极的
4 0.547 2.61 47.69 积极的 积极的
5 0.547 2.86 52.36 积极的 积极的
6 0.547 3.09 56.58 积极的 积极的
7 0.547 3.04 55.56 积极的 积极的
8 0.547 2.99 54.63 积极的 积极的
9 0.547 1.72 31.52 积极的 积极的
10 0.547 2.34 42.79 积极的 积极的
11 0.547 1.91 34.91 积极的 积极的
12 0.547 2.56 46.78 积极的 积极的

对应的蛋白质乐队被西方墨点法 犬弓蛔虫抗原。条1和2是积极的和消极的控制,分别,带3到12代表积极的血清样本。

ELISA反应结果 犬弓蛔虫和寄生虫抗原。

寄生虫抗原 样品没有。 不。(%)的正样本 OD ( 的意思是 ± SD )
犬弓蛔虫免疫球蛋白 2、3、4、8、6、7、8、10、11、12 11 (100) 2.74 ± 0.5
Clonorchis sinensis免疫球蛋白 0 0
Paragonimus westermani免疫球蛋白 0 0
有钩绦虫免疫球蛋白 0 0
小束免疫球蛋白 9 1 (9.1) 2.09
棘球绦虫免疫球蛋白 0 0

只有9号样品显示出反应 小束免疫球蛋白,而其他样本显示反应 犬弓蛔虫免疫球蛋白和其他寄生虫(表没有反应 2)。

其中11个样品,带数字3 - 12显示积极的反应在ELISA和免疫印迹,而带2号显示一个积极的和消极的免疫印迹结果ELISA结果;带数字1代表一个积极控制样本(图 1)。

反应的血清样本中的5乐队从24到35 kDa西方墨点法,确认它们含有特定anti-Toxocara抗体,被分为微型离心机管和冷冻或冷冻干燥处理。这产生两个大量的试验样品含有特定的抗体免疫球蛋白 犬弓蛔虫:

很多1:冷冻干燥法产生的样本(100管),与每一个包含100管 μ血清样本浓度为31.01 L南大

很多2:冻结法产生的样本(100管),与每一个包含100管 μ血清样本浓度为27.18 L南大

3.2。均匀性评价

表 3显示了同质样本DK的评估结果和DL。样品产生的凝固法(DL)了 F 团体 2.52,小于 F α 3.02。冷冻干燥法生产的样品(DK)了 F 团体 0.59,小于 F α 3.02(表 3)。我们假定 H 0 假设被接受。这一发现表明EQA的试验样品是由冷冻干燥和冷冻方法是均匀的。

评估冷冻和冷冻方法样本的同质性。

指数 DK(冻干样品) DL(冷冻样品)
的意思是 ± SD 31.01 ± 1.1 27.18 ± 0.9
简历(%) 3所示。7 3所示。7
F 团体 2.52 0.59
F α df 1 = 9 , df 2 = 10 , α = 0.05 然后 F α = 3.02
3.3。稳定性评价 3.3.1。血清样本的长期稳定

当存储在-80°C,冻干样本稳定至少3个月,6个月冷冻样本稳定( p > 0.05 )。这两种方法生产的样品稳定在30°C(7天 p > 0.05 )。

表 4表明血清样本由冷冻干燥稳定1月储存在-80°C时,用一个 p > 0.05 。产生的血清样本稳定冻结6个月储存在-80°C时,用一个 p > 0.05 。6个月后的抗体浓度降低。在-80°C,冻干样品浓度的31.87南大在1个月,28.48南大在3个月,在6个月和28.02南大,而冷冻样品浓度的27.3南大在1个月,3个月26.79南大,在6个月(表26.44南大 4)。这些结果表明,冷冻样品(DL)稳定的为6个月。

在研究期间南大的结果值。

时间 指数 DK(冻干样品) DL(冷冻样品)
储存在-80°C 储存在2 - 8°C 储存在-80°C 储存在2 - 8°C
1个月 的意思是 ± SD 31.87 ± 1.4 28.85 ± 1.2 27.3 ± 0.3 26.08 ± 0.9
简历(%) 4.4 4.1 1.2 3所示。5
p 价值 > 0.05 < 0.05 > 0.05 < 0.05
3个月 的意思是 ± SD 28.88 ± 1.1 25.43 ± 0.7 26.8 ± 0.3 24.56 ± 1.1
简历(%) 3所示。9 2。8 1.2 4.5
p 价值 > 0.05 < 0.05 > 0.05 < 0.05
6个月 的意思是 ± SD 28.02 ± 1.1 23.86 ± 0.7 26.44 ± 0.3 24.0 ± 1.0
简历(%) 3所示。9 2。8 1.2 4.4
假定值 < 0.05 < 0.05 > 0.05 < 0.05

在30°C,产生的血清样本冷冻干燥和冷冻方法稳定(表7天 5)。

血清样本的稳定性在30°C。

时间 指数 DK(冻干样品) DL(冷冻样品)
5天 的意思是 ± SD 25.47 ± 0.7 26.26 ± 1.0
简历(%) 2。6 3所示。9
p 价值 > 0.05 > 0.05
7天 的意思是 ± SD 25.5 ± 0.7 26.31 ± 1.1
简历(%) 2。6 3所示。9
假定值 > 0.05 > 0.05
3.3.2。审判的结果在生产血清样本包含Anti-Toxocara犬属EQA的抗体

生产的样品的过程特定的抗血清诊断 犬弓蛔虫抗体通过外部质量评估方案(图了 2)。

工作流包含一个反试验样品的制备 犬弓蛔虫抗体用于EQA。

 4所示。讨论 4.1。试验样品的质量测定含Anti-Toxocara犬属EQA中使用的抗体 以下4.4.1。试验样品

制造的过程包含抗血清 犬弓蛔虫抗体从收集血清样本取自病人没有添加防腐剂。人类血清是最好的选择,但这是推荐只在当动物血清是不合适的。的免疫反应 弓蛔虫sp.在狗、猫、兔子、和人类是完全不同的 17- - - - - - 19]。在这项研究中,血清来自病人。我们没有使用混合血清混合可能会影响反的特异性 犬弓蛔虫抗体。搅拌时应执行所有的已知样本包含反 犬弓蛔虫,特定的抗体,这将会增加生产成本。最初的黄色血清没有包含血细胞和不发生溶血或多云。血清样本浓度为10毫克/毫升血红蛋白,5毫克/毫升甘油三酯,0.2毫克/毫升胆红素可能干扰ELISA结果。样本筛选和发现为阴性抗体HbsAg和anti-HCV anti-HIV-1/2抗体。然而,这些样品必须具有潜在传染性的产品处理。

所有包含反十血清样本 犬弓蛔虫抗体的ELISA反应5乐队从24到35 kDa的免疫印迹分析。这些乐队、分组和隔离,特点和一般容易看得见的( 20., 21]。因此,评估反的特异性 犬弓蛔虫血清抗体在原始制造血清用于时是必要的 犬弓蛔虫外部质量评估。

下一阶段实施按照ISO / IEC 17043:2011 [ 22)和ISO 13528: 2015 ( 16]。

 4.2。的均匀性和稳定性样品由冷冻干燥和冷冻方法

冷冻干燥和冷冻两种方法用于制造样品用于外部质量评估。血清样本由冷冻干燥和冷冻费舍尔被发现是齐次的测试。这是合理的,因为病人的血清样本材料没有添加防腐剂,因此保留相同的基质和确保同质性。样品由冻结被冷冻干燥比生产更均匀。样品由冷冻干燥方法有同质性较低,这可能是由于冷冻干燥法和重建的影响。样品由冻结比那些由冷冻干燥:更稳定的氢键在水在很大程度上造成了蛋白质结构的稳定。在这种情况下,在冷冻干燥方法中,水的去除往往导致蛋白质的物理不稳定。此外,即使成功的冷冻干燥,蛋白质结构可能影响因素,包括合成、氧化、美拉德反应和水解。因此,冷冻干燥方法的长期稳定可能仍然是有限的,尤其是在高温下。这些问题可以通过选择最佳pH值和最小剩余水分,更重要的是,通过添加稳定剂,防止组织冷冻和冷却过程中细胞的破坏 23]。

 4.3。试验样品的生产过程包含Anti-Toxocara犬属用于EQA的抗体

试验样品的生产过程已经完成。这个过程可用于大规模生产的标准血清样本包含反 犬弓蛔虫EQA的未来。整个过程满足实验室生物安全手册的要求( 24]。利用免疫印迹的4th一步,反的特异性 犬弓蛔虫抗体血清样本的增加。ISO /指导35:2017和ISO 13528: 2015标准我们跟着当评估样品的均匀性和稳定性。因此,生产的样品的质量是保存在存储期间。

 5。结论

特定的免疫球蛋白抗体 犬弓蛔虫抗原在收集血清样本被发现反应5乐队从24到35 kDa的免疫印迹分析

样品产生的冻结方法更均匀和稳定比由冷冻干燥法:冻干样品稳定3个月,而样本稳定冻结6个月的-80°C。在30°C,这两种方法生产的试验样品稳定了7天

准备试验的过程EQA反的样本 犬弓蛔虫抗体可以用来产生寄生虫病的血清学EQA样本的评估

缩写 ELISA:

酶联免疫吸附试验

 EQA:

外部质量评估

 哈佛商学院:

乙肝病毒表面

 乙肝病毒:

乙型肝炎病毒

 阮:

胡志明市

 丙肝病毒:

丙型肝炎病毒

 艾滋病毒:

人类免疫缺陷病毒

 ISO / IEC:

国际标准组织/国际电工委员会

 南大:

NovaTec单位

 SPSS:

社会科学统计软件包。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

 的利益冲突

作者声明没有利益冲突,金融,或以其他方式。

 确认

我们要感谢下的医疗质量控制中心实验室医学健康大学和药房在胡志明市资金和设备的支持。我们欠一个特别感谢刀陈同庆Ly,医学博士专家II级疟疾学研究所的寄生虫学、昆虫学Quy Nhon。

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