的识别小束物种隔离乂安省,越南,ITS1序列的基础上使用一个简单的PCR-RFLP核糖体DNA的方法

文摘

Fascioliasis-a疾病引起的小束spp。(扁形动物门:吸虫纲:复殖类)——视为最重要的蠕虫感染牛、羊,水牛在越南。本研究的目的是检测的基因型小束种虫害孤立的牛和水牛乂安省,越南中部,利用PCR-RFLP和序列分析的第一个核核糖体内部转录间隔区(ITS1)。成人小束种虫害是独立于胆管乂安牛和水牛的省,越南。总的来说,96只成年侥幸从屠宰场屠宰动物的肝脏被收集不同的地区。其中包括7样本受感染的牛,89感染水牛的样本。样品被确认为96/96小束物种的ITS1 rDNA。在这项研究中,一个PCR-RFLP方法被用来区分f .属的植物和f . gigantica的ITS1 rDNA(680个基点)Rsa限制性内切酶。RFLP图案与Rsa100年360年,我产生一个一致的模式,和60 bp碎片f .属的植物,而f . gigantica蠕虫的360、170和60英国石油(bp)的大小,分别。结果表明,使用基于PCR-RFLP第一内部转录间隔器(ITS1)核糖体RNA透露,93 96隔离的小束gigantica类型,而三个隔离一个中间小束。在目前的研究中,f . gigantica和中间形式共存的牛和水牛的明秀越南中部的一个省,而f .属的植物没有检测到。

1。介绍

肝片吸虫病,疾病引起的肝吸虫属的小束,是一个最重要的食源性和水源性寄生虫人畜共患病。f .属的植物和f . gigantica是两个主要物种感染人类和动物。f .属的植物有一个世界范围内的分布和两个物种存在于非洲和亚洲的热带和亚热带地区1,2]。这两个物种的分化,根据形态特征如身体长度宽度的比值,是很困难的,由于其尺寸的变化,尤其是对侥幸成功的时代,涉及主机物种和固定技术(3]。由于形态学方法的局限性,几个分子的方法,使用不同的分子靶点,开发的差异化f .属的植物和f . gigantica(4]。

分子的方法可以通过DNA测序正确区分第一内部转录间隔器(ITS1) ITS2, 28 s核糖体核糖核酸基因(5- - - - - -7]。几项研究使用ITS1 rDNA显示f .属的植物,f . gigantica,他们中间形式存在于不同国家包括越南(8- - - - - -10]。然而,报告位处义安省牛和水牛的存在。这个省位于越南的中心。以前,位处义安省的被称为一个重要的流行区域fasciolosis在牛11),但非常有限的数据可用的分子特征小束种虫害的水牛。

因此,这项研究已经完成检测的基因型小束种虫害隔绝牛和水牛乂安省,越南中部,利用PCR-RFLP和序列分析的第一个核核糖体内部转录间隔区(ITS1)。

2。材料和方法

2.1。侥幸

成人侥幸从5水牛和7(89侥幸侥幸从一个牛)被孤立在屠宰场的胆管乂安在越南(图1),其中的人类fasciolosis最近病例报道。侥幸在生理盐水洗广泛,随后固定在70%乙醇和保存在4°C到提取基因组DNA。

2.2。DNA提取

大约25毫克组织样本被从每个成人侥幸。总DNA提取使用QIAamp DNA迷你包(51304号、试剂盒、德国)根据制造商的指示。中提取DNA在双重蒸馏水稀释,维持在-20°C到用于PCR。

2.3。PCR扩增

放大一个大约680个基点的ITS1序列,使用一组执行PCR ITS1-F(5 '测试公司治理文化TGA TTA CGT CCC TG-3)和ITS2-R (5 GCT GCG CTC TTC ATC GAC-3 ttg)(综合DNA技术,美国)作为意识和反义引物(Itagaki et al ., 2005)12),分别。总量的PCR反应是50μl包含5μl DNA的解决方案,25岁μl mastermix 2 x(美国热费希尔科学),1.0μ每个引物(0.2 lμ18.0 M),μl的蒸馏水。进行PCR扩增的是热Mastercycler梯度(美国热费希尔科学)。反应周期如下:最初的变性步骤在94°C 5分钟,其次是35周期为30秒94°C(变性),55°C 30秒(退火)和72°C 60秒(扩展)和最后一个扩展72°C的15分钟。

2.4。限制片段长度多态性(RFLP)分析

RFLP执行根据川米等人描述的方法来区分f .属的植物从f . gigantica在ITS1Rsa我酶(8]。执行RFLP分析,总量的16μl,包括5μl (ITS1 PCR产品,增加了1μl (Rsa我,1μl 10 x探戈缓冲区(热费希尔科学、美国),和9μl的蒸馏水。管是在37°C孵化12小时,以确保完全切割的片段,和Rsa我在65°C heat-inactivated 15分钟。6μ我的每个产品和1μl装货染料缓冲区在2%琼脂糖凝胶电泳在此种缓冲100 V为60分钟,可视化紫外线光照溴化乙锭染色后(UVP、加拿大)。每个乐队的大小是由50个基点+阶梯分子量标记(美国热费希尔科学)。DNA类型的小束根据片段模式种虫害是杰出的,三个乐队360年100和60 bp碎片f .属的植物,而f . gigantica蠕虫的360、170和60英国石油(bp)的大小,分别。

2.5。DNA测序

PCR产品两个隔离的ITS1 10 b-na1.2隔绝牛和15 tr-na5水牛隔绝,被送往一垒实验室Sdn Bhd-service (Kembangan 43300,雪兰莪州,马来西亚)净化和自动测序在两个方向上,使用相同的引物PCR中使用。序列在ABI 3130基因分析仪软件(SeqScape 2.1)。数据的准确性是双向测序证实的。代表序列存入基因库在加入数字MH790325和MH790326。

2.6。序列和系统发育分析

独立获得的序列进行了分析,与相关的基因库中可用的序列数据库使用爆炸指南(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。邻居加入(NJ)和最大似然(ML)基于Tamura-Nei模型ITS1序列的系统发育树构建使用大型软件7.09版本。引导分析(1000复制)进行了确定找到的鲁棒性。rDNA序列Paragonimus westermani(AF040935.1)被用作一个外围集团。

3所示。结果

3.1。PCR和PCR-RFLP

一个地区约680个基点的ITS1 rDNA成功放大(图96年样本2)作为预测。负控制并没有产生任何乐队在凝胶上。PCR-RFLP乐队的简介小束用限制性内切酶Rsa我是执行。结果PCR产品消化Rsa我是大约60、100个基点和360个基点的片段f .属的植物;60、170个基点和360个基点f . gigantica;和60、100、170和370个基点(图中间形式3)。

表1说明了确定肝吸虫与他们的起源和明确的主机。因此,96年小束隔离研究从位处义安省的牛和水牛,越南。96位处义安省标本进行分析,确定为93(96.88%)侥幸f . gigantica和3(3.12%)作为中间小束(表1)。

3.2。完整的rDNA ITS1序列

DNA测序两ITS1完成。爆破结果表明,f . gigantica从泰国(AB207144.1)拥有序列最相似在这些2蠕虫FasVN09身份99.31% (10 b-na1.2)隔离(MH790325)和100%的身份FasVN14 (15 tr-na5)隔离(MH790326)。

系统发生的树由使用ITS1序列小束物种如图4。所有的隔离小束在不同的国家聚集在一起,支持引导价值高(> 78%)。Neighbor-Joining树的系统树构建方法支持爆炸结果通过显示ITS1序列之间的相似性(乂安省,越南)和埃及的ITS1 (LC076127.1),泰国(AB514854.1)、越南(AB385614.1)和印度尼西亚(AB207143.1)。核苷酸序列在当前研究中获得的数据被存入基因库下加入数字MH790326.1 (15 tr-na5隔离)和MH790325.1 (10 b-na1.2隔离)。

4所示。讨论

基于dna分子方法为了解不同种类的准确和可靠小束在流行地区,被认为是控制程序(13,14]。PCR-RFLP试验是一种强大的方法来区分f .属的植物和f . gigantica。在这项研究中,基于部分rDNA PCR-RFLP ITS1和限制Rsa我酶是用于区分和识别小束位处义安省的物种。这些技术已经用于中分化小束种基于生成的配置文件内切酶对这些寄生虫的基因的影响15]。川et al。(2011)使用Rsa我酶基于ITS1地区明确区分f .属的植物和f . gigantica在缅甸,没有报告f .属的植物在他们的研究。在一项研究中在伊朗,Aryaeipour et al .(2014)显示Rsa我限制酶可能是用于两个物种的分化16]。日本米酒等。(2011)使用艾娃二世和半径标注二号区分f .属的植物和f . gigantica在28 s DNA (17]。Ghavami et al。(2009)显示,230年消化模式,bp是特定于340年和341年f .属的植物物种和没有影响f . gigantica(18]。Ashrafi et al。(2004)使用ITS2核苷酸测序识别小束spp。在他们的研究中,两种f .属的植物和f . gigantica被认为在Guilan,伊朗北部[19]。

我们的研究做了检测f . gigantica位处义安省和混合模式而不是f .属的植物。我们的研究结果类似于一些先前的研究在越南20.,21]。大多数的小束本研究物种在分子识别f . gigantica这是整合与知识f . gigantica在越南主要感染水牛和牛。此外,混合的形式小束已经证实ITS1序列分析的基础上。人间病例和动物的中间形式已报告在越南10,22]。缺席的情况下f .属的植物在当前的研究中得到了大量的最近的研究小束从动物的国家10)和一些周边国家如缅甸和泰国3,23]。中间小束据报道形式共存两分布区重叠的领域f .属的植物和f . gigantica比如一些亚洲国家(日本、韩国、中国和伊朗)(12]。在这项研究中,中间的共存小束和f . gigantica在缺乏f .属的植物检测在越南和泰国和缅甸(3,23]。

5。结论

使用ITS1标记已经确定f . gigantica和中间形式的小束共存的明秀越南中部的一个省。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究支持越南军事医科大学,河内,越南。本文中描述的结果是KC10.26/06-10项目的一部分。

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