JPR 寄生虫学研究期刊》的研究 2090 - 0031 2090 - 0023 Hindawi 10.1155 / 2018/2958026 2958026 研究文章 的识别 小束物种隔离乂安省,越南,ITS1序列的基础上使用一个简单的PCR-RFLP核糖体DNA的方法 http://orcid.org/0000 - 0001 - 6086 - 7659 无水的 做Ngoc 1 无水的 Le Tran 1 老爷 Le Quoc 1 Bac 阮Duy 2 天山 Tran越南 3 Phuong 吴悌太平 4 Duong Tran Thanh 5 卢克 阮Khac 1 广 阮英航 6 玛珊德 伯纳德 1 医学寄生虫学部门 越南军事医科大学 河内100000 越南 vmmu.edu.vn 2 解剖学系 越南军事医科大学 河内100000 越南 vmmu.edu.vn 3 传染病科 越南军事医科大学 河内100000 越南 vmmu.edu.vn 4 医学寄生虫学部门 太平大学医学和药店 410000年太平 越南 tbump.edu.vn 5 越南国家疟疾学研究所的寄生虫学和昆虫学 河内100000 越南 6 实验室医学系 越南国立医院的针灸 河内100000 越南 2018年 4 12 2018年 2018年 05年 09年 2018年 22 11 2018年 4 12 2018年 2018年 版权©2018 Ngoc安et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

Fascioliasis-a疾病引起的 小束spp。(扁形动物门:吸虫纲:复殖类)——视为最重要的蠕虫感染牛、羊,水牛在越南。本研究的目的是检测的基因型 小束种虫害孤立的牛和水牛乂安省,越南中部,利用PCR-RFLP和序列分析的第一个核核糖体内部转录间隔区(ITS1)。成人 小束种虫害是独立于胆管乂安牛和水牛的省,越南。总的来说,96只成年侥幸从屠宰场屠宰动物的肝脏被收集不同的地区。其中包括7样本受感染的牛,89感染水牛的样本。样品被确认为96/96 小束物种的ITS1 rDNA。在这项研究中,一个PCR-RFLP方法被用来区分 f .属的植物和 f . gigantica的ITS1 rDNA(680个基点) Rsa限制性内切酶。RFLP图案与 Rsa100年360年,我产生一个一致的模式,和60 bp碎片 f .属的植物,而 f . gigantica蠕虫的360、170和60英国石油(bp)的大小,分别。结果表明,使用基于PCR-RFLP第一内部转录间隔器(ITS1)核糖体RNA透露,93 96隔离的 小束gigantica类型,而三个隔离一个中间 小束。在目前的研究中, f . gigantica和中间形式共存的牛和水牛的明秀越南中部的一个省,而 f .属的植物没有检测到。

 越南军事医科大学 1。介绍

肝片吸虫病,疾病引起的肝吸虫属的 小束,是一个最重要的食源性和水源性寄生虫人畜共患病。 f .属的植物和 f . gigantica是两个主要物种感染人类和动物。 f .属的植物有一个世界范围内的分布和两个物种存在于非洲和亚洲的热带和亚热带地区 1, 2]。这两个物种的分化,根据形态特征如身体长度宽度的比值,是很困难的,由于其尺寸的变化,尤其是对侥幸成功的时代,涉及主机物种和固定技术( 3]。由于形态学方法的局限性,几个分子的方法,使用不同的分子靶点,开发的差异化 f .属的植物和 f . gigantica( 4]。

分子的方法可以通过DNA测序正确区分第一内部转录间隔器(ITS1) ITS2, 28 s核糖体核糖核酸基因( 5- - - - - - 7]。几项研究使用ITS1 rDNA显示 f .属的植物, f . gigantica,他们中间形式存在于不同国家包括越南( 8- - - - - - 10]。然而,报告位处义安省牛和水牛的存在。这个省位于越南的中心。以前,位处义安省的被称为一个重要的流行区域fasciolosis在牛 11),但非常有限的数据可用的分子特征 小束种虫害的水牛。

因此,这项研究已经完成检测的基因型 小束种虫害隔绝牛和水牛乂安省,越南中部,利用PCR-RFLP和序列分析的第一个核核糖体内部转录间隔区(ITS1)。

 2。材料和方法 2.1。侥幸

成人侥幸从5水牛和7(89侥幸侥幸从一个牛)被孤立在屠宰场的胆管乂安在越南(图 1),其中的人类fasciolosis最近病例报道。侥幸在生理盐水洗广泛,随后固定在70%乙醇和保存在4°C到提取基因组DNA。

越南(a)的地图。乂安省,越南中部(b)。

 2.2。DNA提取

大约25毫克组织样本被从每个成人侥幸。总DNA提取使用QIAamp DNA迷你包(51304号、试剂盒、德国)根据制造商的指示。中提取DNA在双重蒸馏水稀释,维持在-20°C到用于PCR。

 2.3。PCR扩增

放大一个大约680个基点的ITS1序列,使用一组执行PCR ITS1-F(5 '测试公司治理文化TGA TTA CGT CCC TG-3)和ITS2-R (5 GCT GCG CTC TTC ATC GAC-3 ttg)(综合DNA技术,美国)作为意识和反义引物(Itagaki et al ., 2005) 12),分别。总量的PCR反应是50 μl包含5 μl DNA的解决方案,25岁 μl mastermix 2 x(美国热费希尔科学),1.0 μ每个引物(0.2 l μ18.0 M), μl的蒸馏水。进行PCR扩增的是热Mastercycler梯度(美国热费希尔科学)。反应周期如下:最初的变性步骤在94°C 5分钟,其次是35周期为30秒94°C(变性),55°C 30秒(退火)和72°C 60秒(扩展)和最后一个扩展72°C的15分钟。

 2.4。限制片段长度多态性(RFLP)分析

RFLP执行根据川米等人描述的方法来区分 f .属的植物从 f . gigantica在ITS1 Rsa我酶( 8]。执行RFLP分析,总量的16 μl,包括5 μl (ITS1 PCR产品,增加了1 μl ( Rsa我,1 μl 10 x探戈缓冲区(热费希尔科学、美国),和9 μl的蒸馏水。管是在37°C孵化12小时,以确保完全切割的片段,和 Rsa我在65°C heat-inactivated 15分钟。6 μ我的每个产品和1 μl装货染料缓冲区在2%琼脂糖凝胶电泳在此种缓冲100 V为60分钟,可视化紫外线光照溴化乙锭染色后(UVP、加拿大)。每个乐队的大小是由50个基点+阶梯分子量标记(美国热费希尔科学)。DNA类型的 小束根据片段模式种虫害是杰出的,三个乐队360年100和60 bp碎片 f .属的植物,而 f . gigantica蠕虫的360、170和60英国石油(bp)的大小,分别。

 2.5。DNA测序

PCR产品两个隔离的ITS1 10 b-na1.2隔绝牛和15 tr-na5水牛隔绝,被送往一垒实验室Sdn Bhd-service (Kembangan 43300,雪兰莪州,马来西亚)净化和自动测序在两个方向上,使用相同的引物PCR中使用。序列在ABI 3130基因分析仪软件(SeqScape 2.1)。数据的准确性是双向测序证实的。代表序列存入基因库在加入数字MH790325和MH790326。

 2.6。序列和系统发育分析

独立获得的序列进行了分析,与相关的基因库中可用的序列数据库使用爆炸指南( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。邻居加入(NJ)和最大似然(ML)基于Tamura-Nei模型ITS1序列的系统发育树构建使用大型软件7.09版本。引导分析(1000复制)进行了确定找到的鲁棒性。rDNA序列 Paragonimus westermani(AF040935.1)被用作一个外围集团。

 3所示。结果 3.1。PCR和PCR-RFLP

一个地区约680个基点的ITS1 rDNA成功放大(图96年样本 2)作为预测。负控制并没有产生任何乐队在凝胶上。PCR-RFLP乐队的简介 小束用限制性内切酶 Rsa我是执行。结果PCR产品消化 Rsa我是大约60、100个基点和360个基点的片段 f .属的植物;60、170个基点和360个基点 f . gigantica;和60、100、170和370个基点(图中间形式 3)。

PCR的放大模式ITS1核糖体。莱恩M: 50个基点梯子分子量标记;巷1 (a, b): -控制;通道2 - 8 (a)和(b) 2 - 7日表示不同的侥幸样品放大作为一个乐队680年的英国石油公司位处义安省的牛和水牛。

肝吸虫PCR RFLP图案的产品来自布法罗牛(a)和(b)乂安省,越南、消化后 Rsa我的酶。莱恩M: 50个基点梯子分子量标记;通道1、3、4、5、7 (a)来表示的 f . gigantica;道2和6 (b)表示的 小束sp。(中间形式);通道1 - 6 (b)表示的 f . gigantica。

表 1说明了确定肝吸虫与他们的起源和明确的主机。因此,96年 小束隔离研究从位处义安省的牛和水牛,越南。96位处义安省标本进行分析,确定为93(96.88%)侥幸 f . gigantica和3(3.12%)作为中间 小束(表 1)。

的频率 f . gigantica和 f .属的植物在越南被PCR-RFLP在不同动物宿主。

主机 牛 水牛 成人侥幸的总数
f . gigantica 5 88年 93年
小束sp。 2 1 3
f .属的植物 0 0 0
总数 7 89年 96年
3.2。完整的rDNA ITS1序列

DNA测序两ITS1完成。爆破结果表明, f . gigantica从泰国(AB207144.1)拥有序列最相似在这些2蠕虫FasVN09身份99.31% (10 b-na1.2)隔离(MH790325)和100%的身份FasVN14 (15 tr-na5)隔离(MH790326)。

系统发生的树由使用ITS1序列 小束物种如图 4。所有的隔离 小束在不同的国家聚集在一起,支持引导价值高(> 78%)。Neighbor-Joining树的系统树构建方法支持爆炸结果通过显示ITS1序列之间的相似性(乂安省,越南)和埃及的ITS1 (LC076127.1),泰国(AB514854.1)、越南(AB385614.1)和印度尼西亚(AB207143.1)。核苷酸序列在当前研究中获得的数据被存入基因库下加入数字MH790326.1 (15 tr-na5隔离)和MH790325.1 (10 b-na1.2隔离)。

ITS1序列的系统发育关系 小束从越南使用Neighbor-Joining树方法。 Paragonimus westermani(AF040935.1)用作外围集团。

 4所示。讨论

基于dna分子方法为了解不同种类的准确和可靠 小束在流行地区,被认为是控制程序( 13, 14]。PCR-RFLP试验是一种强大的方法来区分 f .属的植物和 f . gigantica。在这项研究中,基于部分rDNA PCR-RFLP ITS1和限制 Rsa我酶是用于区分和识别 小束位处义安省的物种。这些技术已经用于中分化 小束种基于生成的配置文件内切酶对这些寄生虫的基因的影响 15]。川et al。(2011)使用 Rsa我酶基于ITS1地区明确区分 f .属的植物和 f . gigantica在缅甸,没有报告 f .属的植物在他们的研究。在一项研究中在伊朗,Aryaeipour et al .(2014)显示 Rsa我限制酶可能是用于两个物种的分化 16]。日本米酒等。 (2011)使用 艾娃二世和 半径标注二号区分 f .属的植物和 f . gigantica在28 s DNA ( 17]。Ghavami et al。(2009)显示,230年消化模式,bp是特定于340年和341年 f .属的植物物种和没有影响 f . gigantica( 18]。Ashrafi et al。(2004)使用ITS2核苷酸测序识别 小束spp。在他们的研究中,两种 f .属的植物和 f . gigantica被认为在Guilan,伊朗北部[ 19]。

我们的研究做了检测 f . gigantica位处义安省和混合模式而不是 f .属的植物。我们的研究结果类似于一些先前的研究在越南 20., 21]。大多数的 小束本研究物种在分子识别 f . gigantica这是整合与知识 f . gigantica在越南主要感染水牛和牛 。此外,混合的形式 小束已经证实ITS1序列分析的基础上。人间病例和动物的中间形式已报告在越南 10, 22]。缺席的情况下 f .属的植物在当前的研究中得到了大量的最近的研究 小束从动物的国家 10)和一些周边国家如缅甸和泰国 3, 23]。中间 小束据报道形式共存两分布区重叠的领域 f .属的植物和 f . gigantica比如一些亚洲国家(日本、韩国、中国和伊朗)( 12]。在这项研究中,中间的共存 小束和 f . gigantica在缺乏 f .属的植物检测在越南和泰国和缅甸( 3, 23]。

 5。结论

使用ITS1标记已经确定 f . gigantica和中间形式的 小束共存的明秀越南中部的一个省。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

本研究支持越南军事医科大学,河内,越南。本文中描述的结果是KC10.26/06-10项目的一部分。

 Mas-Coma 年代。 Bargues m D。 瓦莱罗能源 m·A。 肝片吸虫病和其他plant-borne吸虫人畜共患病 国际寄生虫学杂志 2005年 35 11 - 12 1255年 1278年 2 - s2.0 - 25844451175 10.1016 / j.ijpara.2005.07.010 Mas-Coma 年代。 瓦莱罗能源 m·A。 Bargues m D。 小束,lymnaeids和人类肝片吸虫病,疾病传播全球概览,流行病学、进化遗传学、分子流行病学和控制 寄生虫学的进步 2009年 69年 41 146年 10.1016 / s0065 - 308 x (09) 69002 - 3 市川 M。 Itagaki T。 分子分析aspermic小束侥幸成功的基础上,从韩国核ITS1地区和线粒体DNA标记和比较与日本aspermic小束侥幸 兽医医学科学杂志》上 2012年 74年 7 899年 904年 2 - s2.0 - 84864811222 10.1292 / jvms.11 - 0523 22446395 黄 w . Y。 他 B。 王 c·R。 朱 x Q。 描述2小束物种来自中国大陆的核糖体DNA序列 兽医寄生虫学 2004年 120年 1 - 2 75年 83年 2 - s2.0 - 1442301734 10.1016 / j.vetpar.2003.12.006 15019145 人工智能 l 陈 M.-X。 Alasaad 年代。 Elsheikha h . M。 李 J。 李 H.-L。 林 R.-Q。 邹 F.-C。 朱 X.-Q。 陈 J.-X。 基因鉴定、物种分化和检测的小束分子种虫害的方法 寄生虫和向量 2011年 4 1,货号。101年 2 - s2.0 - 79958154317 10.1186 / 1756-3305-4-101 21658284 Itagaki T。 Kikawa M。 寺崎 K。 Shibahara T。 福田 K。 的分子表征parthenogenic小束sp.在韩国的基础上核糖体ITS1和线粒体NDI基因的DNA序列 兽医医学科学杂志》上 2005年 67年 11 1115年 1118年 2 - s2.0 - 28744447166 10.1292 / jvms.67.1115 Marcilla 一个。 Bargues m D。 Mas-Coma 年代。 的PCR-RFLP分析区分肝片吸虫和小束gigantica 分子和细胞探针 2002年 16 5 327年 333年 2 - s2.0 - 0036813010 10.1006 / mcpr.2002.0429 12477436 市川 M。 Itagaki T。 歧视的ITS1类型的小束种虫害基于PCR-RFLP方法 寄生虫学研究 2010年 106年 3 757年 761年 2 - s2.0 - 77949273984 10.1007 / s00436 - 010 - 1724 - 2 20107839 Itagaki T。 坂口 K。 寺崎 K。 佐佐木 O。 俊井 年代。 范粪 T。 发生精子的二倍体和aspermic三倍体形式的小束在越南和基于核和线粒体DNA的分子特性 寄生虫学国际 2009年 58 1 81年 85年 2 - s2.0 - 59449102951 10.1016 / j.parint.2008.11.003 19087891 阮 年代。 阿米尔- 年代。 市川 M。 Itagaki T。 福田 Y。 南开 Y。 分子识别的小束spp。(复殖类:扁形动物门)在牛从越南 寄生虫 2012年 19 1 85年 89年 2 - s2.0 - 84861999043 10.1051 /寄生虫/ 2012191085 中方通过 t D。 越南 p . N。 Saegerman C。 Losson B。 在越南fasciolosis现状:一个更新和观点 寄生虫学杂志》 2016年 90年 5 511年 522年 2 - s2.0 - 84946771910 10.1017 / S0022149X15000929 Itagaki T。 Kikawa M。 坂口 K。 Shimo J。 寺崎 K。 Shibahara T。 福田 K。 的遗传特征parthenogenic小束sp.在日本的基础上的核糖体、线粒体DNA序列 寄生虫学 2005年 131年 5 679年 685年 2 - s2.0 - 27644536728 10.1017 / S0031182005008292 彭 M。 一宫 M。 Ohtori M。 市川 M。 Shibahara T。 Itagaki T。 肝片吸虫的分子特征,小束gigantica, aspermic小束sp.基于核和线粒体DNA 寄生虫学研究 2009年 105年 3 809年 815年 2 - s2.0 - 70349245425 10.1007 / s00436 - 009 - 1459 - 0 19424719 Shafiei R。 Sarkari B。 Moshfe 一个。 一致的PCR-RFLP分析基于2核糖体DNA小束物种的分化 伊朗基础医学科学杂志》上 2013年 16 12 1266年 1269年 2 - s2.0 - 84890574653 Dar Y。 阿米尔- 年代。 梅西埃 一个。 Courtioux B。 更有 G。 分子识别 小束spp。(复殖类:Fasciolidae)在埃及 寄生虫 2012年 19 2 177年 182年 10.1051 /寄生虫/ 2012192177 2 - s2.0 - 84862136713 Aryaeipour M。 Rouhani 年代。 Bandehpour M。 Mirahmadi H。 齐米。 B。 Rokni m B。 基因分型和系统发育分析的小束spp。与绵羊和牛使用PCR-RFLP Ardabil省、西北伊朗 伊朗公共卫生杂志》上 2014年 43 10 1364年 1371年 2 - s2.0 - 84911487995 日本米酒 J。 Khademvatan 年代。 Yousefi E。 分子识别动物的小束孤立伊朗西南部 澳大利亚基础和应用科学杂志》上 2011年 5 11 1878年 1883年 2 - s2.0 - 84155184585 Ghavami m B。 拉希米 P。 Haniloo 一个。 Mosavinasab s . N。 小束分离株的基因型和表型分析 伊朗寄生虫学杂志》 2009年 4 3 61年 70年 2 - s2.0 - 73449134441 Ashrafi K。 调查人类和动物肝片吸虫病Fasciolids和基因型和表型特征及其关系Lymnaeid蜗牛Gilan省[博士。论文) 2004年 伊朗北部 博士,德黑兰大学医学科学 勒 t·H。 Van De N。 Agatsuma T。 布莱尔 D。 Vercruysse J。 Dorny P。 阮 T·g·T。 麦克马纳斯 d . P。 分子确认小束gigantica可以在人类宿主进行异常迁移 临床微生物学杂志 2007年 45 2 648年 650年 2 - s2.0 - 33847064203 10.1128 / JCM.01151-06 17135435 阮 T·g·T。 van de N。 Vercruysse J。 Dorny P。 勒 t·H。 基因型特征和物种的识别 小束种虫害的影响对于隔离感染山羊在越南 寄生虫学实验强调 2009年 123年 4 354年 361年 10.1016 / j.exppara.2009.09.001 2 - s2.0 - 70349954768 勒 t·H。 德 n V。 Agatsuma T。 这阮 t·G。 阮 问:D。 麦克马纳斯 d . P。 布莱尔 D。 人类肝片吸虫病和混合/ introgressed的存在形式的肝片吸虫和小束gigantica在越南 国际寄生虫学杂志 2008年 38 6 725年 730年 2 - s2.0 - 41349108669 10.1016 / j.ijpara.2007.10.003 18031748 Wannasan 一个。 Khositharattanakool P。 Chaiwong P。 Piangjai 年代。 Uparanukraw P。 Morakote N。 识别小束物种基于线粒体和核DNA揭示了中间小束的共存和小束gigantica在泰国 寄生虫学实验强调 2014年 146年 64年 70年 2 - s2.0 - 84908310134 10.1016 / j.exppara.2014.09.006 25300764