首个商品化ELISA试剂盒的诊断价值焦annulata

摘要

目前的研究评估了SVANOVIR的疗效焦annulata-Ab，首个商品化的ELISA诊断试剂盒焦annulata牛的感染是基于一种重组蛋白t . annulata表面蛋白(TaSp)。作为参比试验，聚合酶链反应(PCR)测定取决于t . annulata应用裂殖子表面抗原(Tams-1)。随机采集468份牛的血液和血清样本，采用PCR和ELISA方法进行检测。此外，所有标本均采用常规吉氏染色血涂片进行分析。本研究结果显示，PCR和ELISA结果具有良好的相关性，所有PCR阳性样本在ELISA中均正确为阳性，125份PCR阴性样本中有73份正确为阴性。与PCR数据比较，灵敏度为91.25%，特异性为78.4%。总之，SVANOVIR焦annulata-Ab是一种适合用于诊断和流行病学调查的诊断试剂盒焦annulata慢性和带菌者动物感染。

1.介绍

热带黑蜱病是一种由原生动物寄生虫引起的蜱媒疾病焦annulata并通过蜱传播Hyalomma anatolicum［1，2］.在有感染风险的地区，这种疾病是限制畜牧业生产的主要因素。早期和准确的疾病诊断对控制感染至关重要。在感染的急性期，当寄生虫血症水平较高时，采用吉氏染色薄血涂片镜检更容易诊断感染，这是诊断血液寄生虫最常用的传统方法。然而，血清学检测更适合于在感染的慢性阶段的疾病诊断，在这一阶段，动物作为携带者。这些动物有较高的抗体滴度，而寄生虫血症的水平很低，显微镜下很难检测到[3.］.因此，分子识别工具是最好的技术[4- - - - - -6］.本研究的目的是评价商品化ELISA试剂盒的可靠性，根据其诊断的敏感性和特异性焦annulata自然感染牛的感染。此验证与Tams-1 PCR进行了比较。

2.材料和方法

2．1．研究区域和样本收集

本研究对从埃及Al-Wadi Al-Jadid省不同地点采集的468头牛样本进行了研究。取颈静脉全血2份，其中1份不使用抗凝剂制备血清，另1份使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂提取DNA。耳静脉穿刺取血后立即制作血涂片。

2．2.基于吉氏染色血涂片的常规诊断

对每只动物的三份薄血涂片进行检查，通过检测红细胞内的梨形质来确认感染。

2．3.使用SVANOVIR进行血清学诊断焦annulataab

使用SVANOVIR进行血清学诊断焦annulata-Ab(勃林格殷格翰Svanova，乌普萨拉，瑞典;该试剂盒尚未发布到市场)，利用重组焦annulata表面蛋白(TaSP)抗原，由厂家推荐。使用Multiscan Spectrum (Thermo Electron Corporation, Finland) ELISA阅读器在450 nm处测量光密度(OD)。结果以百分率(PP)表示，即重复检测样品的平均OD值除以阳性对照样品的平均OD值，再乘以100。使用比利时MedCalc软件bvba将临界值设为46 PP，特异性和敏感性均为100%。

２.４.基于Tams-1靶标PCR的分子诊断

2.4.1。DNA提取

根据商业试剂盒(QIA amp blood kit, Qiagen, Ltd, UK, Cat)的制造商说明，从全血中提取DNA。51104号)。

2.4.2。Tams-1靶向性多聚酶链式反应

用Tams-1引物进行标准PCR扩增，引物Tams-1 F (5ATG CTG CAA ATG AGG AT)和tspms1r (5GGA CTG ATG AGA AGA CGA TGA G)，扩增785 bp片段焦annulata30kda主要裂殖子表面抗原基因[7］.采用高效紫外反式光源(UV, INC, UK)检测特异性条带，利用图像采集软件(UVP, INC, UK) DOC-ItLS显示785 bp的DNA序列。

3.结果与讨论

分子技术被认为是诊断该病最敏感和最特异的诊断方法焦annulata感染(4，6，8］.因此，采用Tams-1 PCR作为评价SVANOVIR可靠性的参考试验焦annulata-Ab在野外条件下(图2)．为了比较，样本也用吉氏血液涂片进行分析(图)1)．Tabidi等人[9和Salih等人[10]以前曾报道传统方法的灵敏度较差。此外，关于交叉反应的问题焦物种也被记录下来。

以避免SVANOVIR的交叉反应焦annulata-Ab，本研究中作为抗原的TaSp蛋白检测了与其他病原体可能的交叉反应。用taspp重组蛋白进行酶联免疫分析，未发现交叉反应巴贝西虫实验感染动物的血清或血清焦变形和焦parva．［11，12］.用Ta-LFD法检测实验性感染动物血清未见交叉反应牛巴贝斯虫，双芽巴贝斯虫，布鲁氏锥虫，边缘无原体，变形泰莱虫和细小泰莱虫以及动物血清，在ELISA检测阳性的感染焦lestoquardi．有趣的是，没有一个血清样本焦annulata-阴性对照动物可以进行阳性测试[13］.此外,SVANOVIR焦annulata-Ab被验证对单特异性血清布鲁氏锥虫、边缘无形体、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和细小泰勒氏虫．在ELISA中未检测到针对这些病原体的抗体(数据未显示)。我们的研究结果证实了Tams-1 PCR所证实的类似模式焦annulata468份样本中有343人感染(73.29%)。的SVANOVIR焦annulata-Ab阳性340例(72.65%)，giemsa血涂片阳性145例(30.98%)。Tams-1 PCR检测阴性125份。在SVANOVIR焦annulata-Ab 128例为阴性，giemsa染色血涂片阴性323例(见表2)1)．343份Tams-1 PCR阳性标本中有313份在SVANOVIR中转为阳性焦annulata-Ab, 125份PCR阴性标本中有98份ELISA阴性。的SVANOVIR焦annulata与Tams-1 PCR相比，-Ab检测27份样品假阳性，30份样品假阴性，敏感性为91.25%，特异性为78.4%。另一方面，Giemsa血液涂片检测Tams-1 PCR阳性样本漏检率超过一半，敏感性为42.27%，而125份PCR阴性样本均正确评分为阴性(特异性100%)3.)．如果考虑到PCR检测出的DNA非常少，那么检测出的寄生虫血症也很低。虽然ELISA的特异性(78.4%)低于血液涂片(100%)，但它与PCR的相关性更好。在ELISA中，57份样本获得了不同的状态，而在血液涂片中，与PCR相比，多达198份样本的评分错误。因此，ELISA被认为是一种很好的检测工具焦annulata抗体，特别是在慢性动物和带菌者身上。在疾病的急性期，建议使用另一种检测方法，因为在感染的第一周，ELISA不太可能检测到抗体。我们的结果证实，薄血涂片是一种特异性但中度敏感的诊断试验(见表)2)．尽管它是一种廉价、简单和快速的检测方法，但当寄生虫血症水平高到足以用显微镜检测时，它对急性感染的检测是有限的。这些研究结果与[10，14］.预测值通常表明测定结果的准确性。阳性预测值(PPV)对检测呈阳性时疾病存在的概率进行评分，而阴性预测值(NPV)对获得阴性检测结果时疾病不存在的概率进行评分。SVANOVIR焦annulata-Ab显示相对较高的PPV(92%)，如预期的一样，Giemsa血涂片也显示为100%(表1)3.)．这些发现表明，在进一步的调查中，SVANOVIR焦annulata-Ab有能力正确地识别真阳性的情况。SVANOVIR的净现值焦annulata-Ab为76.56%，相对于薄血涂片的38.70%，-Ab相对较高。这些结果清楚地表明SVANOVIR焦annulata-与薄血涂片相比，ab检测真阴性的能力更强。SVANOVIR的联合预测值分别为87.82%和57.69%焦annulata-Ab和giemsa染色血涂片。

4.结论

的SVANOVIR焦annulata-Ab是检测慢性和带菌者体内寄生虫抗体的一个极好的工具。显微镜检查giemsa染色的薄血涂片有助于急性感染的日常检查，快速判断和确认感染。这个重要的信息对于决策者是否开始控制程序是至关重要的。的SVANOVIR焦annulata-Ab是高度推荐的流行病学研究的热带牛血吸虫病，特别是检测慢性和带菌者病例。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了瑞典乌普萨拉Boehringer Ingelheim Svanova和DFG项目“促进和支持提供活疫苗的分子流行病学网络”的支持焦parva和焦annulata东非和北非的感染”(DFG SE862/2-1)。

参考文献

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14. A. A. T. AL-Hosary，上埃及牛瘟的分子分型[博士论文]，阿西尤特大学动物医学院，2013。

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