恶性疟原虫msp2基因型和5岁以下儿童感染的多重性与简单的疟疾在基巴哈,坦桑尼亚

文摘

遗传多样性的恶性疟原虫可能构成挑战,通过化疗和免疫治疗和预防疟疾。我们评估恶性疟原虫遗传多样性和感染复数(MOI)恶性疟原虫感染和parasitaemia的关系恶性疟原虫msp2基因型以及感染克隆的数量。这项研究是进行基巴哈、坦桑尼亚。九十九年5岁以下儿童和简单的疟疾被招募。基因型的遗传多样性进行了分析msp2使用PCR-Restriction基因片段长度多态性。32个不同msp2等位基因。的msp23 d7等位基因频率(48.1%)和更普遍高于FC27 (27.3%) ()。百分之二十四的感染是混合等位基因。个人与FC27高相比寄生虫血症3 d7等位基因()。意味着我很低(1.4克隆,95%可信区间1.2 - -1.5)。的恶性疟原虫人口在基巴哈是由不同的儿童恶性疟原虫克隆,寄生虫有3 d7比那些FC27等位基因更频繁。个人寄生虫有FC27等位基因高表明寄生虫与寄生虫密度FC27基巴哈等位基因可能与疾病的严重程度。低莫伊基巴哈表明疟疾传播率低。

1。介绍

遗传多样性恶性疟原虫是一个主要的特点和一个因素的寄生虫在宿主的免疫反应。等位基因多态性的结果,重组,染色体重排,抗原变异1]。实验遗传学上截然不同的克隆行这个物种的穿越Walliker et al。(1987)2]建立了基因重组发生在减数分裂,形成寄生虫基因型的小说。遗传多样性的疟疾寄生虫是一个主要问题在理解疟疾感染和疾病传播动力学的几个方面,并影响疟疾疫苗的发展。在流行地区,个人不断暴露于感染蚊虫叮咬。由于高疟疾传播强度在坦桑尼亚的一些地方,一个人可能感染不同基因克隆,可能与临床疟疾的风险3- - - - - -6]。因此必须评估的压力/克隆多样性血液样本个体在疟疾地区。

机制控制寄生虫基因组内的遗传多样性和复杂很多。研究显示广泛的多态性在一些重要寄生虫抗原在血液寄生虫无性阶段(了7])。多态性的广泛程度指出在许多表面抗原导致免疫逃避和寄生虫艾滋病发病机理(8]。已经提出,多态性的2和3的基因编码msp1,msp2,glurp的P。恶性疟原虫可作为遗传标记基因分型领域的寄生虫数量(9]。研究表明,的轨迹msp2基因的恶性疟原虫非常多态(10),因此大多数的信息。理解遗传多样性和感染复数是重要的理解的流行病学恶性疟原虫感染在流行地区。

在目前的研究中,聚合酶链反应(PCR)限制片段长度多态性(RFLP)被用来定义的多样性和分布msp2等位基因的症状恶性疟原虫儿童感染和评估感染的多重性与简单的疟疾。的msp2基因型和感染复数与外围parasitaemia有关。

2。材料和方法

本研究在Mlandizi基巴哈,沿海地区、坦桑尼亚(图1)。Mlandizi是理想的网站在这项研究中,疟疾传播是常年平均年均昆虫的接种每人每年超过200人感染咬的11]。在这个地区,P。恶性疟原虫疟疾是占主导地位的物种。疟疾传播基巴哈山峰末期的长期和短期降雨。

2.1。血液样本集合

恶性疟原虫隔离期间,收集了周效磺胺(SP)的监测项目使用14天谁协议证明它的有效性。一百一十九(119)岁儿童6-59月参加Mlandizi健康中心是在2002年的雨季。入选标准是monoinfection恶性疟原虫至少有300寄生虫/μL,没有抗疟药物的摄入或sulphonamide-based药物在过去的4周,没有严重的疾病,出现腋窝温度≥37.5°C,但< 39.5°,没有过敏反应管理药物的历史,并同意参与的意愿。被感染的血液来自儿童呈现与疟疾在第0天者,在药品监督管理局。在演示日0时,厚,薄血涂片收集的手指戳破,沾染了染色显微寄生虫识别和量化。在厚涂片、寄生虫与200白细胞计数,统计假设这是8000 /μl .寄生虫密度记录为寄生虫的数量每200人白细胞(WBC)。以白细胞8000为转换因子,密度转换为寄生虫的数量/μ我的血液。寄生虫密度表示为寄生虫的数量/μl .治疗反应的评估是基于14天在活的有机体内协议。

伦理批准是由国家医学研究所,间隙引用没有。指出/总部/ R.8a / Vol.1X / 107。口头知情同意了从村里的领导和书面同意得到父母或监护人。

2.2。DNA的提取和基因分型msp2基因

在招生,指尖血也发现在3毫米绘画纸滤纸(英国绘画纸国际有限公司,梅德斯通),干,在室温下分别以避免污染。寄生虫基因组DNA提取的116个样本chelex提取所述其他地方(12]。简单、样品寄生虫煮在chelex面前,重金属螯合剂。大约3毫米的涂抹滤纸²被切断,放置在1.5毫升容量microfuge管包含1毫升的PBS (pH值7.4)和50μL 10%的皂苷和孵化一夜之间在4°C。管子被离心机送气音红PBS /皂素。此后,1毫升的PBS是添加到每个管每次倒,然后在4°C的环境中发生了两个小时。解决当时离心机两分钟再一次液体的愿望,干燥滤纸的液体。100年μL无菌水被添加到每个管一起50μL 20% chelex。Chelex然后转移到microfuge管使用黄色的提示,锥形接头剪掉,反相的Chelex每次传输的解决方案。然后,寄生虫DNA被孵化提取管20分钟在100°C热块大力涡流每个样本每两分钟。

孵化后,管子被离心10分钟2分钟,然后每分钟14000转移除chelex树脂,留下寄生虫DNA在上层清液。这种寄生虫DNA被存储在microfuge管−20°C, PCR扩增。基因型的不同形式恶性疟原虫在这些示例中,多态重复区域的裂殖子表面蛋白2 (msp2)是由一个嵌套PCR扩增分析(13使用指定的寡核苷酸引物配对恶性疟原虫RFLP和等位基因决定。最初的放大使用最外层的5′和3′底漆,S2和S3(表1)20日进行μ第九卷包含PCR Buffer-MgCl L反应₂(表达载体),1.5毫米MgCl₂,125年μ0.25 M的混合物deoxynucleoside磷酸盐,μM的一对引物(S2和S3), 0.02 U的Taq DNA聚合酶,和5μL的基因组DNA。PCR反应涉及30放大周期由最初的变性在94°C 5分钟,一个变性的步骤在94°C 1分钟,其次是退火55°C 2分钟,和一个扩展步骤2分钟72°C。在第二轮扩增反应,2μL的DNA扩增子从主PCR被用作模板30μL反应体积在初选中包含相同的反应混合反应,使用嵌套的保守区域5′和3′S1和S4引物(表1放大的中部地区msp2基因。相同的循环参数被用作主要的聚合酶链反应。嵌套PCR产品然后监控在2%琼脂糖凝胶之前限制消化。一个Hinf我(新英格兰生物学实验室)限制消化进行识别msp2等位基因在寄生虫隔离。一夜之间进行消化和消化产品运行在10% PAA凝胶(Q-Bio基因,加拿大)使用1.5 mm间距器,与溴化乙锭染色,然后观察紫外线照射下,拍照。1 Kb的梯子被用作DNA的大小被用作标记所有凝胶。Hinf我限制消化的嵌套PCR产物FC27-type等位基因产生两个守恒的碎片115和137个碱基对(bp)和一个重复单位的96个基点,这代表放大的5′和3′末端产品,分别。成员3 d7-type等位基因产生两个守恒限制片段长度(70年和108年英国石油公司的13]。

2.3。数据分析

香农赢家指数被用来计算多样性指数msp2等位基因。分析差异的出现频率3 d7 FC27等位基因在样品分离,分数统计测试使用。双向方差分析是用来比较的意思是寄生虫FC27儿童之间的密度,3 d7,和混合使用棱镜5(图垫软件)等位基因。感染复数计算等位基因的数量最多恶性疟原虫隔离。

3所示。结果

3.1。msp2恶性疟原虫的基因型

评估恶性疟原虫msp2基因型99寄生虫隔离(血液样本)进行分析。聚合酶链反应分析表明,样本阳性(82)81%恶性疟原虫。所有82个阳性样品受到RFLP分析定义msp2基因型/多重感染寄生虫隔离。的Hinf我酶导致genotype-specific模式允许识别多种不同的乐队msp2等位基因。个人等位基因命名为根据的大小更大Hinf我片段,等位基因之间的差异。

的msp2等位基因是分组根据相似性PCR-RFLP模式。发生的频率msp2基因型图所示2。大多数孩子被寄生虫感染的3 d7等位基因家族;结果的分布msp2基因型在不同年龄组显示3 d7等位基因类型是最普遍的在每个年龄组(图3)。总的来说,51个不同msp2等位基因被检测到Hinf我限制消化一个嵌套PCR产物。15msp2等位基因属于FC27和17等位基因属于3 d7等位基因和19涨跌互现3 d7和FC27(表2)。

意思是寄生虫密度之间有显著差异与FC27个体间,3 d7,和混合基因型(方差分析,)在儿童携带寄生虫密度高恶性疟原虫寄生虫属于FC27等位基因(图4)。等位基因多样性计算由香农维纳指数()。FC27等位基因的多样性高(比3 d7 ()),但差异无统计学意义(特殊以及,df = 53岁)。

3.2。感染复数(MOI)

感染的多重性代表的实际数量coinfecting在个体基因型循环。这是计算每个等位基因的数量最多恶性疟原虫隔离。大多数孩子是由至少两种不同的感染寄生虫的基因型。百分之五十()受感染的血液样本包含单一感染,47% ()双重感染,3% ()三重并发感染的基因型。(即意味着数量的并发感染。MOI)为1.4 (95% CI 1.2 - -1.5)(图5)。观察最高的1.6我在两岁的孩子。我最小的孩子之间有显著差异(经历几个月),我发现在其他年龄组(以及,)。

4所示。讨论

的疟疾感染血液分析揭示了PCR-RFLP在我们的研究中已经显示出相当大的异质性恶性疟原虫感染。我们发现51个不同msp2等位基因的恶性疟原虫- - - - - -msp2从五岁以下儿童收集血液样本中的基因与临床疟疾。在这项研究中,恶性疟原虫窝藏3 d7寄生虫比FC27寄生虫更频繁的在血液样本收集与简单的五岁以下儿童的疟疾基巴哈。我们的研究结果与其他研究协议进行了简单的疟疾患儿在各种疟疾流行地区14,15),这表明3 d7疟原虫可能是常见的基因型在疟疾流行地区传播。

虽然FC27寄生虫不频繁在基巴哈五岁以下儿童中,孩子有这些寄生虫的基因型有更高意味着寄生虫密度()。协会FC27寄生虫与寄生虫密度高可能会建议缺乏抗原抗体在儿童由于缺乏接触和寄生虫免疫抑制效应(16,17),条件可能允许乘法的寄生虫在这些感染者在更高的密度。Soulama et al . 200918)观察高频的寄生虫有FC27等位基因家族在重症疟疾有无贫血小于5岁的儿童在布基纳法索,暗示FC27可能与疾病的严重程度相关。进一步的研究在其他流行地区必须进行确认这些观察。

Mlandizi总的意思是莫伊在基巴哈,较低(1.4寄生虫克隆)相对于其他holoendemic领域包括坦桑尼亚的一些地区。Felger et al。(1999)13]报道莫伊4在基隆贝罗,坦桑尼亚和9.4 Muheza,坦噶(4]。在塞内加尔,莫伊报告为5 (19)在肯尼亚和2.1 (20.,21]。意味着我的空间变异性在疟疾流行地区可能归因于生态参数变化和人为因素。在基巴哈,semiurban地区,传播强度可能较低,因为按蚊密度较低的向量。导致低的另一个原因指出了莫伊Contamin et al。(1995)22)和Magesa (1999) (4),这种效果可能会造成工件在临床情况下掩盖了一个占主导地位的克隆PCR模板发生在低密度。这可能导致识别一些基因型,尽管存在其他基因型的样本。最低的莫伊Mlandizi是观察到的最小的孩子(经历)。这可能最有可能是由于短期内接触感染,最年轻的孩子。也防止母源性免疫,这可能会限制一些基因型的发展,不能忽视它的存在。

有一个weak-negative莫伊和寄生虫密度之间的联系,但关系不显著(见图6)。弱者莫伊和寄生虫密度之间的联系可能源于在这项研究中使用的小样本大小。然而,低莫伊的趋势在寄生虫密度较高的隔离表明乘法的一个主导克隆高竞争的缺失。这种趋势也被观察到在儿童患有严重疟疾在达喀尔由罗伯特·et al。(1996)23]。最近的研究由Rono et al . 201324)与高我五岁以下儿童预防严重疾病,进一步展示我的角色在临床疟疾。

5。结论

我们已经证明了遗传的多样性恶性疟原虫从五岁以下儿童隔离基巴哈广泛存在了更大的多态性在寄生虫msp2基因。此外,我们发现3 d7基因型比FC27更频繁的基因型在基巴哈五岁以下儿童。然而,FC27基因型与更高的寄生虫密度在1≤4年基巴哈的孩子。我们的数据是重要的理解的分子流行病学恶性疟原虫疟疾在基巴哈,间接证明简单的疟疾患儿的免疫状态和疟疾的传播强度,这是空间不同的在流行地区。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者想给衷心感谢Zul普教授克里斯托弗•Membi Hassan Mshinda博士和分子寄生虫学小组Ifakara卫生研究所的技术援助。这项研究受到德意志的财政援助。

引用

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