分子特征和危险因素贾第虫属duodenalis在学校的孩子们从哈瓦那,古巴

文摘

贾第虫属duodenalis被认为是全球最常见的原生动物感染人类。的分子特征g . duodenalis隔离的存在揭示了8组(组合到H)在宿主分布不同。横断面研究的639名儿童从哈瓦那2013年1月和12月之间。两个assemblage-specific pcr进行分子鉴定。的总体发病率贾第虫属感染是11.9%。DNA从63年的76(82.9%)样品被PCR -成功放大tpi从76年开始,而58(76.3%)检测到PCRE1-HF。得到了类似的结果由pcr在54 76个样本(71%)。根据这些分析,组合和混合组合A +占大多数贾第虫属感染的儿童进行测试。我们目前的研究发现B组合主要基因型在儿童感染贾第虫属。单变量分析表明,漏报吃饭前洗手,让狗呆在家里是重要的风险因素贾第虫属感染。在未来,新颖的分子工具更好的歧视在subassemblages级别组合需要验证可能的之间的相关性贾第虫属基因型和贾第虫病症状。

1。介绍

贾第虫属duodenalis是一个重要的全球人类引起的腹泻,特别是孩子,负责每年估计有200万例(1]。这种感染的患病率较高有利于发展中国家穷人的卫生条件与囊肿的污染的水和食物。这种寄生虫已经包含在被忽视疾病倡议的儿童由于其扩散在这些地区,并被腹泻和营养障碍的一个重要原因在机构和社区设置(2]。大约2亿人贾第虫病症状在亚洲,非洲和拉丁美洲,每年大约有500000新发病例报告根据世界卫生组织(世卫组织)(3]。

梨形鞭毛虫病产生重大的公共卫生影响,因为高患病率和疾病负担的感染及其倾向导致重大疫情和紧急反应(1]。贾第虫病的流行病学的一个重要方面是理解不同的宿主范围贾第虫属物种和品种/基因型,跨物种传播的可能性和风险环境因素参与病原体的接触。这是特别重要的在确定动物起源的寄生虫引起的人类疾病负担和人畜共患的潜力贾第虫属家畜感染(4]。

g . duodenalis,这是发现在人类和其他哺乳动物,包括宠物和牲畜,现在被认为是multispecies复杂,包括至少八种不同的遗传群体,称为组合到H (4]。超过一千的分析人类隔离从不同的地理位置,检查PCR扩增的DNA提取直接从凳子上,表明,在几乎所有情况下,只有g . duodenalisA和B组合与人类感染(2]。在这些研究过程中,发现多个基因的分析需要解决混合感染的发生在人类和临床症状之间的相关性的类型贾第虫属组合(4]。

人类贾第虫病的临床表现相对变量,从没有症状的急性或慢性腹泻,脱水,腹痛,恶心,呕吐,和减肥5]。孩子也可能遭受更严重的后果,包括生长阻滞和发展,认知功能差,不利影响营养状况(6]。

关于这个问题,组合之间的相关性和临床症状的研究报道有争议的结果。一些研究指出,更与集合相关症状(7),而其他人则发现,组合B感染(8更有可能症状。最近的研究由皮雷约et al。(2008)和普埃布拉et al。(2014)在一群孩子从哈瓦那发现孩子窝藏B的组合贾第虫属比儿童更有可能有症状感染隔离从组合(9,10]。

贾第虫病是一种流行在古巴肠道寄生虫感染患病率从10 - 55%在最近的研究中,主要是在首都和该国的西部省份(11- - - - - -13]。在过去的全国性调查的肠道寄生虫感染(IPI)在2009年进行的,贾第虫属duodenalis是最常发现病原原生动物(14]。

自识别遗传的组合被认为是一个主要元素在人类贾第虫病的研究,开发和应用是很重要的,与基本分子实验室设备,单步PCR方法,允许一个探测和区分a和B组合和混合感染从人类粪便标本通过放大产品的凝胶电泳(15]。这就是为什么目前的研究是探索是否有进行组合与临床表现性能的两个常规PCR检测和识别流行病学与感染有关的危险因素。

2。方法

2.1。研究设计和研究人口

一个描述性的横断面研究的639名儿童进行了4所小学坐落在城市环境中属于广场de la冗员时,河岸,Boyeros直辖市,在哈瓦那。他们受到常规检查作为肠道寄生监测计划的一部分,从2013年1月至2013年12月。在这项工作中,我们研究的频率g . duodenalis儿童从幼儿园到从每个学校4年级。本研究纳入标准是所有粪便样本阳性g . duodenalis。情况下,合并感染和其他肠道寄生虫感染之间被发现并不包括在调查组合和临床症状。

2.2。收集粪便样本

粪便收集容器都交给父母被要求把孩子当天的新鲜样本检查。三粪便样本每个孩子参与这项研究检查肠道寄生虫。标准问卷用于收集信息,对每一个孩子根据人口(如年龄,性别,和家庭成员的数量),环境(例如,可用性和厕所的家庭类型,类型的供水、垃圾处理,和国内的动物),个人卫生(例如,饭前洗手,排便后,玩动物之后,洗蔬菜和水果在消费之前,沸水在消费之前,和洗澡的地方),和一般健康状况的参与者(即。症状相关的腹泻等肠道寄生虫感染(根据世卫组织(1998)定义),恶心,呕吐,腹痛和接受打虫药治疗的历史)。症状儿童被定义为那些孩子至少有上述症状之一,包括在问卷中,而无症状的儿童被称为完全没有症状。

2.3。样品的处理

新鲜的粪便样本被收集在一个标签和容器无菌粪便。凳子的一部分被湿涂片染色检查现场Lugol的碘和紧随其后的是福尔马林乙酸乙酯浓度技术在10 x 40 x光显微镜下的放大。所有的腹泻粪便样本被改良抗酸的染色隐孢子虫spp。环孢子虫,Cystoisospora(16]。Kato-Katz涂片方法用于物种的特定识别寄生虫鸡蛋,包括蛔虫,鞭虫trichiura,和钩虫。所有样本测试当天,他们收集。所有贾第虫属阳性样本存储在重铬酸钾(2.5%)和存储在−20°C分子特性。

2.4。净化的贾第虫属duodenalis囊肿和DNA提取

贾第虫属囊肿被净化,从粪便样本集中蔗糖梯度比重为0.85米,然后用蒸馏水洗净,之后Babaei描述的协议等。17]。囊肿壁破坏了8 - 10在液氮冻融循环交替95°C水浴。与300年之后,纯化囊肿涨跌互现μL(缓冲溶菌作用(50毫米Tris-HCl, pH值7.5;25毫米EDTA、25毫米氯化钠和1%的钠十二烷基硫酸盐(SDS))和涡。后增加100μ蛋白酶K的g / mL,悬挂在56孵化°C 2 h。

DNA溶解产物然后用酚/氯仿/异戊醇(24:24:1),紧随其后的是氯仿/异戊醇(24:1)根据Sambrook和罗素协议(2001)(18]。DNA被添加冷冻1毫升乙醇沉淀并存储在−20°C到使用。干DNA resuspended 30μL蒸馏水和用作PCR模板。

2.5。分子分析

DNA分子进行了分析使用PCR-relevant出版协议(15,19]。总之,使用assemblages-specific引物的PCR分析放大,在PCR -tpi,148 - 81 -英国石油公司bp片段的组合和片段组合B (19]。另一个PCR (PCR -E1-HP165 - bp)放大组合和272 - bp片段的扩增子组合B (15]。

进行了PCR反应混合物使用AmpliTaq DNA聚合酶GeneAmp 10 x PCR缓冲设备(美国应用生物系统公司)的总量25μL和由10μL 10 x PCR缓冲(美国应用生物系统公司),0.2毫米的deoxynucleoside三磷酸(核苷酸)(美国应用生物系统公司),1 U的Taq(美国应用生物系统公司),0.4μM的底漆,5μL的DNA模板,用超纯水作为消极的控制。

DNA是放大使用thermocycler(美国应用生物系统公司Amp基因PCR系统9700)。PCR分析了产品2%琼脂糖凝胶电泳,沾染了0.5μ克/毫升的溴化乙锭,然后可视化在紫外线透照器(Syngene U:天才,比利时)。

从无菌文化的DNAg . duodenalis菌株WB-C6(组合)和GS (B)组合作为积极的控制,在超纯水中消极的控制。

2.6。统计分析

所有的数据进行了分析使用EPINFO 6.04和3.1 EPIDAT统计项目。卡方检验和比例测试是用来评估的意义关联。确切概率法被使用在需要时由于数据不足。

单变量分析使用所有可用的输入变量。使用引入多元逻辑回归测试是用来确定每个独立变量显著相关的结果变量。比值比(或)和95%可信区间(CI)被用来近似相关的相对风险敞口。的值小于0.05被视为所有测试的统计学意义。

2.7。道德的考虑

研究协议经伦理委员会批准的“佩德罗Kouri”研究所。书面知情同意得到父母/监护人对儿童参与这项研究。每个症状的孩子被发现,而且被一位儿科专家。

3所示。结果

3.1。研究人口的特征

总共有639儿童检查,76人感染g . duodenalis整体患病率为11.9%。在两种情况下,合并感染隐孢子虫种虫害和痢疾阿米巴/大肠dispar都被记录下来。从76年贾第虫属来华的孩子包括在这项研究中,41(53.9%)和35例(46.1%)症状没有出现症状。

之间存在无显著相关g . duodenalis感染与性别、居住地区、年龄、或开发之间的腹泻症状和无症状的孩子()(表1)。

3.2。结合PCR -结果tpi和聚合酶链反应-E1-HP聚合酶链反应

显微镜下呈阳性76份粪便样本贾第虫属分析了通过PCR使用两个位点(tpi和E1-HP)作为目标。从这些样本,63(82.9%)和58(76.3%)取得积极的PCR -tpi(图1)和PCR -E1-HP(图2),分别提供累积积极性的85.5%(表2)。总共43阳性样品(56.6%)透露,经pcr基因分型结果。相反,22个样本(28.9%)基因分型结果显示不一致的结果。11个样品(14.5%)得分- pcr, 10显示很少有囊肿的淫秽的考试。

g . duodenalis组合B是最经常被两个PCR: PCR - 47.6%tpi,通过PCR - 67.3%E1-HP。我们只发现7例(8.6%)经PCR -组合a类型的感染tpi通过PCR和5例(11.1%)-E1-HP只有。有趣的是,这两个组合组成的混合感染被发现在一个相对较高的比例(41.3% PCR -tpi和24.1%多聚酶链式反应-E1-HP、职责)。

3.3。组合与症状之间的相关性

我们也关注分析的临床意义g . duodenalis儿童感染存在贾第虫属基因型一致pcr(表中确认3)。由于较少的独家组合a类型感染中发现孩子人口,没有统计这个组合之间的相关性和贾第虫病的典型症状是可能的。腹泻是唯一临床统计组合B与感染相关的特征g . duodenalis()至少比A + B混合感染。其他变量的分析,没有发现相关症状和感染之间特定的组合。

3.4。相关危险因素贾第虫属duodenalisA和B组合感染

表4表明,单变量分析表明,吃饭前洗手的遗漏(或= 1.6,95% CI: 1.00—-2.64;)和让狗呆在家里(或= 2.6,95% CI: 1.23—-5.36;)的重要危险因素贾第虫属感染。多变量分析使用介绍测试逻辑回归接触狗协会的批准(或= 2.1,95% CI: 1.11—-4.76;这种肠道感染)。

4所示。讨论

贾第虫属duodenalis直到1978年,最初被视为共生的微生物,是贾第虫病的病原体,人类和动物的胃肠道疾病(1]。贾第虫病导致全球重大公共和兽医卫生问题。通过粪口途径传播是直接,或间接通过摄入受污染的水或食物。在发展中,贾第虫属感染期间获得早期阶段,其患病率山峰高达30%在10岁以下的儿童。除了腹泻、鞭毛虫感染儿童在这些国家可能导致摇摇欲坠的长期增长和认知功能障碍[1,20.]。这就是为什么重要的是评估这种寄生虫的流行的儿童人口,以及感染的组合,以阐明发达症候学和基因群之间的关系贾第虫属这可能会导致改变和减少治疗的儿童的需求。

先前的研究表明贾第虫属作为主要的肠道原生动物感染儿童的患病率报道全国各地10 - 55% (11- - - - - -13]。在这个调查中,11.9%的频率被发现在所有的孩子中。这个结果较低相比,最近的一项研究由普埃布拉et al。(2014)从哈瓦那有症状和无症状的儿童,显示整个梨形鞭毛虫病患病率为22% ()。确认这种疾病在年轻孩子的特有现象和相对较高的患病率贾第虫属古巴感染孩子。

的分子特征贾第虫属从粪便样本产生的放大63的76个样本(82.9%)tpi76(76.3%)的基因和58 assemblage-specific PCR试验报告万尼et al。15]。在这里,g . duodenalis组合B寄生虫优先发现在这两个PCR (PCR - (47.6%tpi)和67.2% (PCR -E1-HP),职责)。这个观察是按照最大规模研究的分布组合B是更常见的在发展中国家(58%)比在发达国家(55%)和更高的患病率比组合(37%比40%)(21]。

在目前的研究中,我们发现了一个高的部分混合感染(PCR - 41.3%tpi和24.1%多聚酶链式反应-E1-HP、职责;见表2)在孩子们学习。在之前的调查中,我们发现17.8%的混合感染的频率(10]。最近的研究使用常规PCR与assemblage-specific引物(22)或实时PCR包括测序结果放大产品(23)表现出更大程度的混合组合感染人类之前报道(8,24,25]。

混合感染的发生还指出最近在一些使用assemblage-specific调查tpi引物(26,27),允许检测的混合组合a和B感染人数高于方法的基础上,使用更一般的引物PCR (8,25]。其他assemblage-specific pcr由万尼et al。(2012)甚至可以检测个体组合时9次代表样本与组合B (15]。

混合感染的情况下的可靠检测受到几个因素的影响,包括标本中的每个组合的比例和有偏见的扩增效率的一个组合。在目前的研究中,使用tpi基因PCR检测非常重要,因为它允许更高的混合感染人数比设计的PCR万尼et al。(2012)。此外,的高可变性tpi序列(Geurden et al ., 2008)使各自的PCR的理想分子工具组合a类型与组合b型感染的鉴别诊断。

在目前的研究中,基因分型结果不一致的结果在pcr应用观察在22个分离株(28.9%),代表更高比先前报道的病例数(10 30%)(28,29日]。这种差异可能是由于偏见的PCR -E1-H向检测组合B(见表2)。

的分子特征g . duodenalis是复杂的,我们不完全理解这种生物的基因。很多研究都是基于单个位点的分析,特别是18 s rDNA轨迹。如今,通过应用茎的PCR分析有一个更高的混合识别组合引起的感染a和B,然后可能导致不一致的结果,比如组合(甚至物种)的决心贾第虫属隔离(29日]。

基因分型不一致结果观察到在人类和动物(特别是狗还牛)隔离g . duodenalis(29日),可以正式解释为两种截然不同的现象:(i)基因的存在不同的囊肿粪便样本结合优惠放大特定assemblage-specific标志基因相比,另一个象征第二个组合(即标记基因。,一个真正的混合感染之后,有偏见的PCR扩增);或(ii)之前发生性复合在两个贾第虫属组合,导致混合基因型两个PCR目标而言。混合感染的证据,肥胖盛行程度特别高的感染者生活在发展中国家经常提供(8,30.]。然而,第二个可能性也不应被低估,因为性基因交流贾第虫属隔离之前(和现在)讨论了作为一个现实的场景(31日]。

贾第虫病的症状差异与不同的组合对荷兰病人最初描述。这里,组合与轻度间歇疾病有关,但组合B与严重持久的疾病(32]。从那时起,几项研究已经报道组合和症状之间的相关性,但一直缺乏一致性的数据(9,32,33]。然而,这些发现是由数据对比,counterindicate症状和感染之间的关系组合(33,34]。在此,我们之间做了相关分析贾第虫属组合和症状表现在孩子。43岁的孩子相同的基因分型结果,我们发现B组合与腹泻相关的更多(由组合)相比,混合感染。需要更多的数据来确定组合引起的混合感染可以减少症状。

在以前的研究在我国皮雷约et al。(2008)和普埃布拉et al。(2014),密切联系组合B和学校的孩子们被发现症状。然而,混合感染的比例在调查报道进一步复杂症状的归因感染特定的组合。相比我们的先前的研究9,10),我们目前的数据显示下降的流行组合B症状儿童虽然这些研究有不同的总体患病率贾第虫属和遗传特征采用不同的标记。尽管如此,组合B仍被视为主要的组合中贾第虫属在我们国家来华的孩子。相反,在这个调查只是一个统计上微不足道的数量组合a类型感染被发现,因此不包括一个协会的组合与特定的症状。

的患病率贾第虫属强烈相关的各种与主机相关的风险因素,如社会人口、环境和人畜共患疾病(3]。因为水过程中起着重要作用贾第虫属传输(1),水的质量是一个重要的风险因素评估参数在梨形鞭毛虫病35]。除此之外,卫生行为的孩子必须被认为是这一疾病的主要危险因素。令人惊讶的是,然而,大多数肠道寄生虫进行手卫生相关的研究到目前为止还没有特别强调贾第虫病(36]。指的临床意义g . duodenalis儿童在我们的国家,我们决定调查上述风险因素以及各种其他流行病学参数关于传播这种疾病的相关性。最后,漏报饭前洗手和保持狗内部是唯一因素显著相关的更高贾第虫属感染率。这些结果与最近发现在学生人群从亚洲发展中国家37,38]。

的动物传染病的传播g . duodenalis已经得到了越来越多的证据,特别是家养动物的作用而言。此外,据报道,狗可以人畜共患或canine-specific港贾第虫属组合(4]。有明显的证据表明,人畜共患的囊肿贾第虫属污染环境的地区传播人畜共患的可能存在。在过去,许多对贾第虫病的流行病学研究都能够识别为人畜共患该疾病的传播风险。然而,证据表明这一现象发生的频率需要强烈的焦点研究定义流行地区传播动力学和主持人参与的范围贾第虫属感染是已知的(4]。

考虑到兴趣解开有关的流行病学的复杂问题g . duodenalis,研究主要集中在应用分子方法洞察遗传多样性的隔离和公共卫生意义,主要在人口生活在发展中国家。目前的研究提供了信息贾第虫属组合与人类感染,更具体地说,感染的流行病学协会的参数贾第虫属在学校的孩子。进一步对贾第虫病的流行病学研究,特别是相关危险因素的调查贾第虫属组合、subassemblages和基因型,将有助于更好地理解这种疾病的特点。这些信息肯定会非常有利于在贾第虫病的预防和控制策略的发展。

总之,贾第虫病是一种最常见的肠道寄生虫感染在古巴的孩子。的决心g . duodenalis组合是一种有价值的方法来理解复杂的动力学基本的传播贾第虫属感染。在我们的研究中,组合B是主要创始的小组在古巴学校的孩子,但也发现了高频率的混合感染。漏报饭前洗手和让狗呆在家里被当成获取的重要危险因素g . duodenalis感染。为了验证人畜共患的可能性传播和家庭宠物宿主的潜力,进一步大规模研究涉及显微镜色情文学和pcr、基因分型结果茎贾第虫属隔离在各自的粪便样本推荐和几个序列结合的系统发育分析,看看古巴相关隔离贾第虫属隔离标识在世界上其他地方。这些调查预计在未来的研究提供明确的证据人畜共患贾第虫病的传播。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

论文中列出所有作者实验设计作出了巨大贡献,它的实现,或数据的分析和解释。菲德尔·a . Nunez博士(风扇),卢西亚博士Ayllon巴尔德斯(LA),地方政府投资公司。路易斯恩里克·赫雷斯普埃布拉(LEJ),博士Lazara罗哈斯Rivero (LR)和诺伯特•穆勒(NM)博士设计的研究中,路易斯恩里克赫雷斯普埃布拉,博士Yuliet门德斯苏蒂尔(YM),伊莎贝尔博士马丁内斯席尔瓦(IM),地方政府投资公司。玛尔塔马丁内斯冈萨雷斯(毫米),博士Irais Atencio文澜(IA)进行寄生虫学的粪便样本。菲德尔·a·涅斯、诺伯特·穆勒和路易斯恩里克赫雷斯普埃布拉数据结果的分析和解释;菲德尔·a·涅斯和诺伯特•穆勒批判性知识内容的修订了论文。所有作者阅读和批准了期末论文。

承认

本研究在一定程度上由瑞士国家科学基金会的资助(批准号31003 a_138353)。

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