比较分析的组学技术用于研究含锑的两性霉素B,喷他脒阻力利什曼虫

文摘

利什曼病是一种严重威胁发展中国家由于其特有的性质和衰弱的症状。进行了广泛的研究和调查,了解耐药的机制利什曼虫但在实验室结果不吻合的。也缺乏知识的模式行动的药物耐药性的研究更复杂。主要关注在最近一段时间一直对寄生虫的耐药性毒性的作用利什曼虫。研究人员采用各种技术来解开关于耐药性和毒性的事实利什曼虫。出现的先进和更具体的检测手段,进一步提示预计可能产生抗性的机制。本文旨在提供一个统一的画面以及比较的工作到目前为止研究锑的机制,两性霉素B,喷他脒电阻使用各种技巧。

1。利什曼病:发生率,原因,和阻力

利什曼病形式世界第九大疾病负担影响了除南极洲外,各大洲90多个国家和澳大利亚(见http://www.cdc.gov/parasites/leishmaniasis/epi.html)。它是一种流行疾病目前估计有1200万患者和全球每年高达200万个病人(见上升http://www.who.int/leishmaniasis/en/)。

疾病的主要原因利什曼虫寄生虫。的基础上的症状,可以分为两个forms-cutaneous和内脏利什曼病。l . donovani,l . infantum和l . chagasi内脏利什曼病的病原体(重要)。这种形式的疾病,其特征是发热、虚弱,盗汗,肝肿大,脾肿大和主要地区报道印度、孟加拉国、埃塞俄比亚、苏丹和巴西。皮肤利什曼病(CL),另一方面,出现虫咬的痛在现场可以进行严重的形式。CL可以采取两种形式:弥漫性CL或黏膜与皮肤的利什曼病。在漫射CL,皮肤损伤普遍存在类似麻风的身体。黏膜与皮肤的利什曼病始于溃疡的鼻孔收益进一步鼻中隔,咽、喉。它可以最终导致病人显著的缺陷。它通常报道在非洲,拉丁美洲和中东。CL的病原体被归类为新旧世界物种如下(1,2]:旧世界CL:l .主要l . tropica l . (l) aethiopica和l . infantum;新世界CL:l . (l)墨西哥l . (l) amazonensis原虫,l . (v) panamensis l . (v) peruviana l . (v) guyanensis l . (l) pifanoi l . (l) venezuelensis l . (l) shawi和l . lainsoni (v)。

女沙蝇作为致病寄生虫载波传输到主机。基本上,宿主的寄生虫进入人体metacyclic promastigote的形式。此后,它转换和繁殖无鞭毛体形式(2]。多年来,许多药物已经用于治疗的疾病在锑(某人)含有一种物质叫锑的全世界最首选药物。简单介绍一下,这些药物的作用机制和管理模式已经呈现在表1。

这些药物依赖的效率(一)宿主的免疫状态,(b)寄生虫的因素,(c)药物代谢动力学(1,3]。

尽管很多治疗方法,“耐药”,尤其是含锑的阻力,是一个严重的问题联系在一起利什曼虫研究。问题的严重性可以评估的事实,有些地区已报告的完全耐药治疗。就是这样一个地区的比哈尔邦(印度)据报道已响应对五价锑的治疗(3]。此外,几乎所有的现有药物的耐药菌株可以在实验室条件下获得的4- - - - - -8]。有趣的是,有不同毒力的实例利什曼虫寄生虫抗药性的程度(9- - - - - -12]。这支持的观点存在着毒性和耐药性的关系利什曼虫。一些科学家的意见,耐药性有健身成本。然而,没有多少工作已经进行了相关耐药性和毒性为了科学支持这一假设[12]。

本文旨在提供一个整体的技术使用到目前为止研究耐药的面积利什曼虫服用三个主要药物(含锑的两性霉素B,和喷他脒),突出各自的优点和缺点。尽管miltefosine被广泛用于利什曼病,我们没有报告的临床发生率的抵抗miltefosine [13,14]。因此没有多少是谈到miltefosine及其耐药性综述。

2。锑的阻力利什曼虫

五价的锑的(某人(V))是治疗利什曼病的第一行。研究表明,锑的抑制至关重要的代谢过程如脂肪酸氧化,糖酵解和能量代谢13]。但这种药物的作用方式仍然是未知的。添加到问题是“耐药的问题。“已经进行了很多尝试研究耐药的机制利什曼虫但真正的现象仍然是模糊的。讨论了该领域的重大突破在以下段落。

2.1。进步研究锑抗性机制

2.1.1。基因扩增(图1)

基因组研究揭示了基因扩增获得耐药的主要机制之一利什曼虫。基因被发现被放大MRPA和gsh1(15,16)和基因结果已通过各种蛋白质组分析研究(rt - pcr和SILAC) (17- - - - - -19]。MRPAABC转运蛋白基因编码,有助于封存metal-thiol复杂的细胞内细胞器最终会导致删除从细胞质中药物分子15]。类似的gsh1沉重的亚基的基因编码ϒgcs病原反应酶的谷胱甘肽(GSH)的生物合成途径,帮助在戒毒中心16]。

然而,当类似的研究与临床分离株的重复l . donovani的表达水平,没有明显的变化MRPA和gsh1建立了基因(20.]。这是假设突变利什曼虫寄生虫是一种专一性从而导致这种矛盾。近年来,随着新一代测序的出现,这个假设可以在一定程度上是合理的。事实上从全基因组比较最近的一项研究结果的S -和R-strains进行利什曼虫支持这一事实寄生菌株的遗传背景可能是普遍的异质性的主要原因在antimony-resistance表型(21]。

2.1.2。细胞封存或流出Metal-Thiol共轭的细胞(图1)

抗性和敏感菌株的基因组进行比较利什曼虫指向基因的超表达喜欢ODC(鸟氨酸脱羧酶),耐SAHH,台塑线(15,22]。ODC对trypanothione合成至关重要这是一个主要的硫醇metal-thiol复杂从而导致细胞挤压形成的药物分子(22]。提高水平的硫醇新陈代谢酶和oligopeptidase B (OPB)曾被观察到在耐药行2 de和LC-ES MS / MS的比较。OPB被发现在免疫逃避扮演一个角色,健身,和毒性l . donovani和l .主要(23]。事实上对耐药菌株的代谢组学研究也观察到成倍地增加耐药寄生虫的硫醇水平(24]。

研究已经证明ODC超表达的重要性和thiol-conjugated射流泵各利什曼原虫的锑抗性菌株(17,25]。最近的一项研究发现一个新的half-transporter, ABC14、参与锑阻力。ABC14已经发现负责流出的锑antimony-resistant细胞l .主要的形式drug-thiol共轭(25]。这些发现支持细胞的作用封存和随后流出寄生虫的药物形式的细胞质metal-thiol共轭。

2.1.3。锑前体药物(图的激活下降1)

现在还不知道是否激活锑前体药物,也就是说,某人向某人(V)转换(III),发生细胞或细胞外。然而很明显,阻碍在激活某人前体药物形式第一的耐药性利什曼虫。一个胞内酶,TDR1已被确认,帮助某人向某人(V)的转换(III)和被认为是underexpressed R-cells [26]。

2.1.4。减少药物的吸收Underexpression AQP1的(图1)

Gourbal等人表明,过度的AQP1(aquaglyceroporin)基因的耐药菌株l . tarentolae,l . infantum,l .主要导致更加敏感的细胞对三价锑的(某人(III))药物27]。近年来各种研究证实这些发现(17,18]。这样的差别,对这些基因AQP1在锑抗性中起着重要作用利什曼虫因为它会阻止某人(III)进入寄生细胞。

最近的发现。最近一些新的机制(如减少DNA碎片和程序性细胞死亡已确定授予某人阻力利什曼虫(20.]。

此外测序研究揭示新的耐药机制。例如,小说终端删除染色体31最近报道三antimony-resistant突变体l .主要通过下一代测序和比较基因组杂交(CGH) (28]。

的R - S-strains比较蛋白质组分析利什曼虫进行了各种研究。这些研究揭示了羧肽酶新陈代谢重要蛋白的过度表达,烯醇酶,特性,6-bisphosphatase,Hsp70,和Hsp83动基体的差别,对这些膜蛋白(KMP11)和钙调磷酸酶在R-strains [29日- - - - - -31日]。

Hsp70已经知道有immune-stimulatory作用吗l . infantum和要求进一步的研究表明它的重要性在耐药性。蛋白质组比较,DNA碎片化验,线粒体膜电位的分析两种l . donovani表现出过度的Hsp83和减少耐药寄生虫的DNA碎片和膜电位(20.,29日]。

KMP11属于一个高度保守的家庭的膜糖蛋白定义毒性利什曼虫(30.]。

Downregulation钙调磷酸酶的报告首次在文学。它是一种钙依赖蛋白磷酸酶参与多种多样的细胞存活和凋亡等细胞活动。因此相信underexpression钙调磷酸酶可以防止耐药寄生虫antimony-induced细胞凋亡的31日),尽管在这方面需要做进一步的工作。

完整的代谢物比较的敏感和耐药的临床分离株l . donovani了两个表型之间的差异(32- - - - - -34]。主要区别在两个表型的脂质成分。鞘脂类水平下降和鞘磷脂和提高水平的卵磷脂和不饱和脂肪酸观察耐药菌株表明参与改变膜流动性和特征赋予某人电阻(32]。

水平的表面glycoconjugates被发现在R-strains增强。这些glycoconjugates metacyclogenesis中发挥一些作用和毒性的寄生虫33]。

最近的一个代谢组学比较耐药菌株和敏感l . infantumpromastigotes使用CE-ESI-TOF-MS展出各种氨基酸的变化水平,这在以往的研究没有显示(35]。另一项研究显示,增加代谢产物参与鸟氨酸循环和半胱氨酸transsulfuration通路(34]。这样的结果因此鼓励未来的耐药性研究和需求的帮助下在这个领域进一步探索现代分析技术。

3所示。两性霉素B阻力利什曼虫

两性霉素B (AmB)是防御的第二行利什曼病(36]。这多烯的药物具有较高的亲和力对膜结合麦角固醇导致小膜孔隙的形成,改变对阳离子膜透性,水,葡萄糖分子(5]。因此,渗透细胞的完整性破坏导致泄漏的镁和钾离子,最终导致细胞死亡37]。

AmB阻力在字段或临床分离株并不常见利什曼虫。几项研究证明相反AmB易感性依然不受影响,即使重复政府的药物(38,39]。尽管艾滋病毒/六世合并感染患者AmB治疗后复发率很高可能最终导致电阻(39]。最近的一份报告来自印度已经确定病人AmB耐药菌株感染的l . donovani这礼物的可能性出现的这种情况在未来40]。

3.1。进步AmB阻力的研究机制

3.1.1。膜流动性的改变(图2)

AmB毒性依赖药物的相互作用与寄生膜。因此初步研究AmB电阻依赖于流仪分析调查的膜电位利什曼虫细胞(39]。Mbongo et al。(1997)使用MS分析证明AmB-resistant promastigotesl . donovani富含cholesta-5 7 24-trien-3吗βol(麦角固醇的生物合成的前体),导致膜流动性增加。此外发现细胞内AmB浓度较低耐药细胞(5]。gc - ms研究甾醇分析证明了大量methylcholesta甾醇在耐药promastigotes和无鞭毛体在体外条件。有趣的是在活的有机体内研究执行与野生型和耐药无鞭毛体和promastigotes显示传染性减少耐药promastigotes和无法引起感染耐药无鞭毛体(4]。确切的原因减少传染性还不得而知,但这是推断,膜微粘度降低耐药寄生虫可能呈现膜受体非功能影响的传染性5]。

3.1.2。硫醇和ROS水平下降和增加药物流出细胞(图2)

最近AmB耐药性的机制在临床分离的l . donovani研究了膜流动性的增加和减少钾泄漏R-strains观察。胞内硫醇和活性氧(活性氧)水平低耐药细胞中证明tryparedoxin级联可能有效防止有害的过氧化物的氧化损伤,消除细胞(41]。

此外,rt - pcr AmB-resistant株临床分离株的结果显示基因的upregulation trypanothione生物合成和tryparedoxin级联。凋亡的mRNA水平(ABC转运蛋白)被发现高4倍R-strains支持增加药物流出的观察。最后SCMT的表达,一种酶负责C24转甲基作用在甾醇生物合成途径,进行了测试。它有两个transcripts-SCMT和SCMT b表达分析显示缺乏表达为SCMT SCMT和增加表达式b的表达改变SCMT基因的抗性支持的观点中有缺陷的相关酶的表达甾醇生物合成途径导致没有细胞膜麦角固醇R-cells [41]。进一步研究SCMT和其他酶参与甾醇生物合成有可能提供一些关于耐药性结果。

3.1.3。基因在染色体外圆(图放大2)

另一种耐药机制进行了测试l . tarentolae。基因扩增研究阻力确定两个菌株表现出放大DNA染色体外的寄生虫。的在体外阻力水平被发现直接成正比的拷贝数扩增子和阻力达到高度稳定42]。然而,确切的区域进行放大仍然未知。

sds - page结果来自印度的情况下最近的一份报告显示超表达的蛋白质在65到80 kDa, AmB-resistant样本。这个乐队是公认的半胱氨酸蛋白酶。但不知道这种蛋白质的机械的意义已经报道了耐药性利什曼虫日期(40]。这只是一个案例报告,这些数据不能完全依赖,因为它可能只是一个个人主义的观察。

4所示。喷他脒阻力利什曼虫

喷他脒(PMD)已经被用作替代治疗六世在某人阻力的情况下。其具体作用方式是未知的,但报告显示,它能抑制酶活性S-adenosyl-L-methionine脱羧酶,干扰聚胺合成,降低线粒体膜电位(43]。因此药物的主要目标似乎是寄生虫线粒体(44]。抵抗PMD的证据已经被报道,但耐药性的机制并不理解正确(45,46]。

4.1。喷他脒阻力的研究进步机制

以下4.4.1。kDNA基因组序列(图的变化3)

早期的实验使用分子模拟、生物物理分析和分子生物学揭示了PMD的交互at富集区的DNA小沟,kDNA。因此初步尝试对PMD的阻力利什曼虫关注kDNA比较。印迹kDNA野生型和PMD-resistant细胞之间的比较l . donovani和l . amazonensis证明了重大的变化。序列同源性结果很低(32 - 51%)从而支持看法kDNA序列带来阻力的变化在这些物种8]。

4.1.2。药物外排泵(图3)

在一项研究中执行l .主要、角色命名的新基因PRP1编码一个ABC转运蛋白,确定耐药(47]。在体外研究上执行l . infantum展出,PRP1转染寄生虫拥有三倍抵抗PMD。也获得了类似的结果l .墨西哥和l . amazonensis(44]。因此它是确认PMD PRP1扮演一个明确的阻力利什曼虫。存在其他的转运蛋白具有类似的功能被假设但尚未被认可(7]。

4.1.3。降低线粒体摄取(图3)

喷他脒积累在线粒体原因其寄生细胞的毒性。药物吸收的研究表明,喷他脒是抑制耐药细胞的线粒体摄取导致快速清除的药物存在于胞质(48]。另一项研究进行l . amazonensis表示修改的亚精胺和腐胺PMD-resistant寄生虫。喷他脒被耐药克隆了吸收载体介导和能源的依赖43,49]。喷他脒阻力的参与聚胺生物合成途径是进一步研究和发现细胞内鸟氨酸和精氨酸水平对PMD-resistant腐胺的增加而减少l . donovani和l . amazonensis细胞(49]。我们已经了解到,喷他脒竞争性抑制精氨酸运输和非竞争性抑制亚精胺和腐胺运输。因此增加精氨酸水平和减少腐胺水平是防止喷他脒的吸收机制的线粒体。耐药细胞显示降低线粒体膜电位再次帮助药物排斥。生化研究表明减少了PMD在耐药细胞的线粒体摄取。已经表明,线粒体代谢抑制剂如叠氮化钠和KCN管理降低了PMD吸收从而凸显它的重要性作为抵抗机制。然而结果与22泵抑制剂(异搏定)变化。同时,一方面,维拉帕米逆转PMD抗性表型l .墨西哥另一方面,显示了没有这样的效果l . donovani(50]。这证明耐药利什曼虫物种的影响因素。

各种酶化验证明,酶的水平参与聚胺生物合成中改变PMD-resistant寄生虫。ODC(鸟氨酸脱羧酶)的水平,把鸟氨酸腐胺,降低PMD-resistant细胞占耐腐胺水平下降的细胞(51]。大多数酶的活动参与维护线粒体可能也被发现在R-strains减少从而导致降低膜电位(50]。

5。毒性和耐药性:他们是相关的吗?

“毒性”、“健身”,“寄生能力”是不同的术语用来描述的集合特征出现在分裂和传播疾病的寄生虫。研究病毒有指向降低病毒复制和分化上实现对抗逆转录病毒药物产生耐药性。预计类似的观察利什曼虫也(12]。事实上,许多在体外研究证明这种想法是正确的。

在一份报告中关于美国种锑抗性利什曼虫(l . v . guyanensis,l . l . amazonensis,l . v . Braziliensis)发现耐药寄生虫会减少传染性比他们的祖52]。类似的结果在ricin-resistant是可用的l .主要,glucantime-resistantl . (V) guyanensis和AmB-resistantl .墨西哥(12]。然而在药物缺乏后续段落之后,耐药菌株被发现能够成长得更快,证明一些补偿性突变耐药菌株的存在。因此这使得对推理的假设耐药寄生虫的毒性可能小于野生型。因此人们认为健身成本可以用作抗利什曼病(一种手段52]。然而,在活的有机体内模型显示一个完全不同的画面。而假设关于健身的抗利什曼病细胞,减少的一个重要事实的简单性在体外模型是被忽视的。耐药性在现实中并非如此简单,而是通过免疫反应之间复杂的相互作用,实现营养可用性和氧化压力施加的环境利什曼虫。

利什曼虫是一个高度自适应寄生虫。几千年来,它已经发展机制来克服遇到的充满敌意的环境在昆虫中肠和宿主巨噬细胞(11]。因此不难相信它可以开发耐药性不支付健身成本的回报。在一项研究中有关metacyclogenesis(传染性参数)锑抗性l . donovani它成立的分化能力明显高于antimony-resistant细胞(10]。另一份报告关于临床分离株来自尼泊尔的l . donovani表明,耐药细胞有能力达到一个更高的寄生虫密度,包含更多的metacyclics,和拥有的能力增加在活的有机体内感染比敏感细胞。(11]。进一步的工作由同一组研究人员成功地证明了耐药菌株l . donovani高毒性和疾病负担而敏感的的帮助吗在活的有机体内模型(53]。这些报告证明耐药机制推导出在该领域有很大的不同从一个观察到在实验室条件下(54]。此外它甚至问题的真实性研究到目前为止关于耐药性,因为大多数的研究都在进行在体外条件。

徘徊在心里的另一个问题是关于增加字段传染性隔离的原因。提示关于提供的可能的原因是在代谢组学比较临床分离株的耐药性和敏感l . donovani寄生虫。这一组观察到表面的数量增加glycoconjugates耐药菌株。众所周知,利什曼虫糖基化的蛋白和蛋白聚糖与metacyclogenesis相关联,从而反过来与毒性33]。问题出现,这是增加在细胞表面糖基化手段,提高熟练程度?这并不是一个单独报告已经指出,涉及蝶啶还原酶的代谢途径和trypanothione还原酶的变化实现电阻在扮演一个角色利什曼虫。这些有一个亲密的关系与寄生虫的毒性和可以被认为发挥特定作用影响传染性。因此可以认为这样的代谢参数可以预测细胞水平的变化与耐药有关。然而,这种关联的本质仍然是未知的(12]。

这些发现对增加耐药的传染性利什曼虫寄生虫是一个报警信号。到目前为止我们已经学习了两个phenomena-virulence和药物resistance-separately利什曼虫。但是最近的报道证明两者之间的密切联系。因此有必要设计未来的研究来预测耐药毒性的影响利什曼虫下在活的有机体内条件。

6。结论和未来的前景

耐药性是一个高度复杂的机制,与寄生传染性拥有一个强大的协会。相反在体外结果,现场隔离显示增加毒性和携带致命的病原体的潜在的风险选择通过化疗干预措施。生物技术的三个分支,用于日期耐药性研究基因组学、蛋白质组学和代谢组学。比较表中给出了这些技术2。

比较完整的蛋白质组和代谢组的最近。但是基因组分析已经流行了很长一段时间。基因组数据能够提供证据的耐药表型的根源利什曼虫。还寄生物种的系统分类有助于预测物种相关的基因功能。因此,20利什曼病的病因物种只有7完全测序(55]。这些物种的基因组的比较揭示了高比例的身份。例如,平均核苷酸之间的身份l .主要和l . infantum为94% (l .主要和原虫是77%,l . infantum和原虫是77%)56]。但是尽管这样高水平的身份,每个大大不同的发病机制。这也意味着发病机理利什曼虫是由数种特异的基因或者基因扮演配角的角色在决定疾病的临床结果。此外利用Sanger测序获得的序列信息不提供知识基因拷贝数。使用新型测序方法可以克服这一缺点,但目前缺乏数据不支持工作人员(57]。

蛋白质组学,另一方面,侧重于功能单元的输出。本质上,它已经被观察到的大部分监管利什曼虫转译后的获得。因此蛋白质组研究提供更多的知识之间的差异相比抗性和敏感寄生虫基因组数据(58]。这是一个很好的指标对蛋白质丰度和表达,可以产生一个洞察物种差异,分化阶段,耐药性和毒性59]。然而,缺点是,大量的差异表达蛋白质蛋白质组比较后发现缺少一个带注释的功能(57]。大部分的凝胶蛋白质组的比较只突出丰富的蛋白质,而似乎not-so-abundant的蒙面[58]。因此需要做进一步的研究在描述身份不明的蛋白质,not-so-abundant蛋白质,与未知函数和蛋白质。

非常具体的检测方法的出现,像质Orbitrap, gc - ms,等等,代谢组学数据似乎是非常有益的利什曼虫研究。代谢可以给最近的相关生物体的表型。代谢地图提供了一个快速和有效的方法来可视化代谢变化,从而预测其生物的影响。也由于代谢产物质量精度高,质量获得使用最新技术,从头开始代谢网络的扩展是可能的。这可以用来制造假想的连接和预测代谢转换相关的观测质量的山峰。但尽管有这些优点,还有很多需要进步。当前的质不允许使用有效的量化检测代谢物。许多信号从而获得对应分析物同位素等衍生品,碎片加合物等等。生物这没有意义,需要过滤。质谱结果生成大量的数据无法使用可用的生物信息学工具处理和解释。因此新的和复杂的数据库和生物信息学工具需要开发处理、过滤和处理数据轻松(57]。从个人观察,它可以添加虽然研究基于两个或两个以上的策略比基于单一的信息战略。

最后可以得出结论,耐药性在利什曼病是世界范围的一个主要关心医生和研究人员。已经完成了大量的工作来理解为主要药物耐药性的机制利什曼虫但一直尝试在耐药毒性研究。最近这引起了科学家们的注意和进一步的工作在这一领域可能揭示重要的事实。基因组、蛋白质组学和代谢组学方法使用到目前为止已经相当丰富。另外随着技术的进步,更好、更有效的方法来检测和鉴定的基因,蛋白质和代谢物是可用的。因此,它可以相信,在这个领域共同努力,我们会设法制定新的药物,确定良好的生物标记物,开发有效的疫苗来对抗这种疾病并最终克服耐药性的问题目前是普遍的。

术语表

AQP1基因:	Aquaglyceroporin基因
耐药性:	减少药物的有效性在治疗一种疾病或症状
气相:	气相色谱分析-质谱法
谷胱甘肽:	谷胱甘肽
GSH1基因:	Gamma-glutamylcysteine合成酶基因
kDa:	公斤道尔顿
kDNA:	Kinetoplastid脱氧核糖核酸
凋亡:	耐多药蛋白1
Metacyclogenesis:	的分化metacyclic promastigotes
微粘度:	摩擦所经历过的一个粒子进行扩散,因为它与环境互动长度在微米尺度
药物动力学:	分支的药理学与药物体内的运动有关
前体药物:	一种生物活性化合物,可以在体内代谢产生药物
PRP1:	喷他脒抵抗蛋白1
复发率:	的速度再度出现疾病症状的病人治疗后
SCMT:	S-Adenosyl-l-methionine: C-24-delta-sterol-methyltransferase
序列同源性:	序列相似性的共同祖先
TDR1酶:	硫醇还原酶的依赖。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢Richard Burchmore博士对他的指导和实验室成员格拉斯哥大学功能基因组学实验室的所有援助。作者还要感谢J K斯利瓦斯塔瓦博士评审论文。

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