遗传性吸虫的组织化学研究Alloglossidium renale

摘要

祖先吸虫的组织化学研究Alloglossidium renale已证明在成虫和宿主(淡水虾)触角腺小管之间没有任何分泌物质。宿主组织仅受寄生虫的挤压、磨损和吞食影响，靠近寄生虫的宿主小管细胞与远离寄生虫的小管细胞具有相同的染色模式。吸虫有时在宿主体内死亡，留下一个坏死团块，其组织化学染色与活体明显不同。在坏死肿块中，唯一可识别的特征是卵和卵黄，它们萎缩并导致肿块内酪氨酸阳性染色。使用专门的铁-铁氰化物染色，在宿主中未观察到黑色素反应。宿主对感染的唯一明显反应是一层受损的鳞状宿主细胞粘附在坏死的蠕虫上。结果证实了良性的宿主-寄生虫效应和宿主和寄生虫之间高度进化的关系，可能接近共生关系。

1.介绍

Alloglossidium renale是在草虾触角腺内成熟的吸虫祖先吗卡迪亚肯斯宫殿酒店和p . paludosus［1，2]．许多文章都集中在生态学上答:renale或者这种吸虫与其他吸虫的系统发育关系[2- - - - - -7]但是，只有一个单一的检查原位宿主-寄生虫关系解剖学[8]．

在阿拉巴马州南部，答:renale感染淡水虾的触角腺卡迪亚肯斯［8]这是亚拉巴马州南部河流和溪流中常见的一种虾[9］．已知的生命周期答:renale从尾蚴感染阶段开始卡迪亚肯斯．尾蚴侵入宿主，在触角腺内发育，在触角腺成熟为子代囊蚴阶段[6，10]．蠕虫在六周后达到性成熟[10这时它会产大量的卵，这些卵会从虾的排泄孔中释放出来。早些时候有报道称，从塑料包埋标本中提取的切片材料无法观察到宿主反应[8]目前的研究使用了多种组织化学染色来检查宿主组织、成熟寄生虫和坏死寄生虫（吸虫死亡后），并报告了蠕虫衰老后宿主-寄生虫关系期间发生的变化。

2.材料和方法

2．1．收藏的网站

卡迪亚肯斯宫殿酒店采集自阿拉巴马州派克县的Olustee Creek（北纬31°56′38′，西经86°7′6′）。该地点是一个可涉水的路边位置，在之前的研究中用于感染草虾答:renale［8]宿主生物是通过在小溪边用浸网收集来的。宿主通过从现场收集的水被运送到特洛伊大学。虾是用Pennak进行鉴定的[11]．

2．2.感染的实验室鉴定

用解剖显微镜检查虾的感染情况。Alloglossidium renale位于宿主触角腺（触角腺或肾）内，位于触角鳞片后方和头胸两侧鳃室前方。卡迪亚肯斯宫殿酒店有半透明的外骨骼，使外部诊断成为可能。在一项较早的研究中，olustecreek的感染流行率约为13%，虾的一个或两个触角腺通常携带多种吸虫[8]．凭证标本答:renale在该实验室的早期研究期间，从该地点感染的虾中提取的寄生虫被保存在马里兰州贝尔茨维尔的美国国家寄生虫收集中心（USNPC 101574）[8]坏死寄生虫被鉴定为触角鳞片底部的黑色肿块，没有明显的子宫。

２．３．石蜡切片

将感染宿主的头胸取出，根据所使用的特定组织化学试验，使用布因固定剂或10%缓冲福尔马林固定24小时。鱼(阿奎洛纳石首鱼)固定肠道，进行选择对照试验。然后将组织用50%、70%、95%和两种100%异丙醇溶液分别脱水24小时，转移到Safeclear溶剂、60°C Safeclear-石蜡溶液(1:1比例)和两种60°C石蜡溶液各24小时。然后用石蜡块浇铸组织，在10处切片μm厚度的旋转切片机(美国光学)，并贴到载玻片上。

2.4.染色和摄影

用Safeclear从组织中取出石蜡（三次改变，30 然后在染色前，将组织在异丙醇：蒸馏水系列中水合（表1）1)．除了检查的基本解剖开始与哈里斯苏木精(HH),各种各样的污渍被选为酸性测试mucosubstances(阿尔新蓝pH值1.0(有所),阿尔新蓝pH值2.5 (AB2.5),甲苯胺蓝(TB)),中性糖(周期性acid-Schiff[不]),DNA(福尔根氏核反应或HCL-Schiff (FL)),蛋白(茚三酮-希夫[NS]，沃德蛋白染色[WPS])，脂类(锇四氧化物[OS])，酪氨酸/黑色素(铁铁氰化物[FF])。染色协议遵循各种来源[12，13]．没有使用反渍剂。永久制剂采用标准脱水、清除和安装技术制备[14]．用四氧化锇固定组织的塑料切片从为以前的研究准备的材料中进行了检查[8]．照片是用尼康DXM 1200数码相机安装在尼康E600光学显微镜上拍摄的。使用Adobe Photoshop Elements调整图像的亮度、对比度和伽马值，以帮助解释染色。用半定量的方法对组织化学结果进行分级:+++:强烈染色，++:中度染色，+:浅色染色，−:无染色。

3.结果

３．１．的总结Alloglossidium renale组织化学（图1和2、表2）

Harris苏木精为解释组织化学染色结果提供了基础(图)1)．蠕虫的外合胞体缺乏位于表面以下的核。在宿主的触角腺小管和寄生虫的被毛之间没有发现囊壁的痕迹。寄生虫的薄壁组织疏松，染色较浅。其他可识别的结构包括卵黄、吸盘、生殖腺、卵子和肠。

碳水化合物AB1、AB2.5、PAS和TB染色提供了一致的结果。AB染色的酸性黏液物质主要存在于蠕虫的外表皮、肠内壁和生殖小管(图)2(一个))．AB染色时，薄壁组织中酸性糖呈阴性。阿利新蓝2.5也能染色体外的黏液物质，但被困在吸盘的杯中。甲苯胺蓝显示出粉红色或浅蓝色外膜，下面是较暗的层，表明合胞体中含有负电荷物质。PAS反应显示中性糖遍布整个蠕虫(图2 (b))，外被膜合胞体染色较亚表面区域浅。

使用NS和WPS进行蛋白质染色，以检查是否有任何外分泌物被检测为残余或形成不良的囊壁。未检测到此类外分泌物，并且对寄生虫内大多数结构的蛋白质染色是一致的（图1）2 (c))．NS染色较PAS染色弱，但卵黄染色强烈。

用FL染色证实了HH程序的结果，即外合胞体下的被膜核凹陷。细胞核分散在松散的薄壁组织中，并在蠕虫的其余部分的典型位置发现。在用四氧化锇进行电镜固定的蠕虫塑料切片中偶尔观察到油滴。

使用FF染色在卵黄中检测到黑色素或酪氨酸等黑色素成分(图)2 (d))．此外，FF程序染色蛋壳材料。寄生虫的其他部位没有阳性染色。

3.2.宿主触角腺组织化学总结（表3.,数据1和2）

哈里斯苏木精被用作卡迪亚肯斯一般天线腺结构(图1).触角腺小管细胞顶端的微绒毛和小管细胞的细胞质轻度染色，基底边缘染色稍深（图1）1 (b)).肾小管细胞核内的DNA呈深色染色。这种染色的特点是健康的细胞核呈圆形结构，周围有清晰的核质。小管内腔内容物轻度染色。受损的小管细胞致密，不呈立方形。它们在寄生虫附近转化为鳞状细胞（图1 (c))，可能是由于蠕虫的生长和宿主肾小管的压迫。在一些感染中，大部分的触角腺被寄生虫吞噬，蠕虫直接与肌肉相连或被一层薄的鳞状小管细胞层隔开(图)1 (d))苏木精染色显示受损小管细胞的细胞核扁平致密，没有大面积的轻核质。FL DNA染色证实了扁平细胞核的特性。

三种组织化学方法对触角腺微管染色的结果最为显著：AB2.5、PAS和FF。用AB2.5对酸性粘液物质进行染色，发现触角腺微管细胞中有一种有趣的模式，在这种模式中，沿触角腺微管顶端边缘以及触角腺微管基部边缘都有明显的染色he细胞，但不在细胞的主要胞体内（图2(一个))．触角腺小管细胞的细胞核染色明显清晰。这种染色模式在接触寄生虫和远离寄生虫的细胞中都存在，可能表明寄生虫对肾小管的影响很小。这种染色模式的例外适用于由于物理创伤而致密和扁平的细胞。在扁平和鳞状细胞中，胞体和细胞边界的染色差异不明显。PAS染色也显示刷状边缘和基底侧比小管细胞胞浆内的染色更强烈(图)2 (b)和3（c）)．AB2.5和PAS染色均显示小管细胞刷状边缘被蠕虫刮掉的区域，尽管小管细胞完好无损。第三个重要的组织化学结果是宿主没有黑色素反应，如FF染色所示(图)2 (d))．这项测试很重要，因为众所周知，由于寄生虫感染，十足动物的触角腺会产生黑色素。

３．３．的总结Alloglossidium renale寄生虫死亡后的组织化学（图3.、表4）

一个坏死答:renale回收和处理各种污渍(表4)．这个坏死的蠕虫是一团无法辨认的物质与卵子和碎片(图)3(一个))．苏木精染色内团块呈褐色，但寄生虫的细胞核和器官无法识别，且肿块的外观与健康寄生虫完全不同。残余的被皮围绕在肿块周围，染色较浅。受损的鳞状宿主小管细胞与残余的被膜融合。坏死肿块附近的小管腔内容物染色较浅。

HH染色无法识别寄生虫内部结构的完整性，这在组织化学测试中也得到了证实。具体来说，寄生虫的表面发生了变化，AB2.5染色不再突出蠕虫的表面，并出现了外部坏死块的PAS和NS染色变暗(图)3（b）和3（c）)．外表面PAS染色存在于虫被和贴壁的宿主细胞中，外表面NS染色可归因于贴壁的宿主细胞。这些变化以及HH染色显示了结构的破坏。未被磨损或挤压的宿主组织在碳水化合物染色中变化不大，宿主小管细胞的刷状边缘和基底层被AB2.5和PAS突出。

值得注意的是，FF染色显示坏死块内的黑色素或酪氨酸产物，其形态与完整的成熟蠕虫不同。铁氰酸铁染色内坏死团块、坏死被膜残余和细胞质为绿色，而卵黄染色为强烈的绿色(图)3（d）)没有FF染色可归因于宿主组织。此外，未发现任何表明宿主即使在蠕虫死亡后也会对其产生反应的染色结构，也未发现用于隔离或隔离坏死寄生虫的结构，附着在肿块表面的扁平宿主小管细胞除外。

4.讨论

本报告为异花蛇舌草组织化学性质揭示了寄生虫对寄主的良性作用，这表明这种共生关系已经很好地建立起来，并可能朝着共生的方向发展。这项研究报告了在寄生虫活着的时候和感染的后期，当吸虫坏死时，但不是在触角腺组织本身，铁氰化铁阳性反应。黑色素是甲壳类动物组织损伤的结果，一些种类的虾对损伤或疾病产生黑色素反应[15，16]．之前对吸虫的研究丝状异Corrigia在小龙虾的触角腺中Procambarus clarkii在触角腺的间隙中记录的分泌黑色素的卵周围的宿主血细胞[15]．兰德斯和琼斯[8]报道没有可见的黑色素与答:renale由于没有在草虾的塑料部分使用特定的染色剂，因此草虾感染的痕迹可能没有被观察到。铁氰化铁与黑色素反应强烈[12]我们的结果表明，这种反应也发生在黑色素产生的前体酪氨酸上。在卵黄中发现了酪氨酸，因为这个器官不仅产生蛋黄，而且还产生蛋壳前体，其中含有酪氨酸，因为吸虫蛋壳是通过醌鞣制产生的[17]因此，我们在卵黄体内观察到强烈的亚铁氰化物反应，在蛋壳内的反应程度较小。在坏死块中观察到的反应是意外的，在宿主中观察到的反应也是阴性的。整个坏死寄生虫的阳性反应很可能是由萎缩的卵黄囊引起的。缺乏宿主反应表明宿主能很好地适应这种寄生虫感染。

吸虫的被膜通常覆盖有刺，并含有分泌囊泡和颗粒[18，19]，及答:renale，当宿主组织受到挤压和磨损时，被膜有助于破坏宿主的触角腺小管[8]。表皮的碳水化合物染色显示酸性硫酸化粘液物质（AB1）、酸性羧化粘液物质（AB2.5）和中性糖（PAS）呈阳性，可能归因于分泌囊泡。我们观察到AB2.5阳性物质位于蠕虫外部，并被困在吸盘内，但寄生虫周围不存在均匀的覆盖物。囊壁或产生不完整的囊壁或囊膜的问题在寄生虫感染的情况下很重要答:renale，因为寄生虫是遗传的，绕过囊尾蚴阶段，在第二中间宿主（该生命周期中的最终宿主）内直接发育成成虫。据报道，该物种不产生囊尾蚴壁[8，10]早期的研究表明，囊蚴囊肿可能含有酸性粘液物质和蛋白质[20.]，可用阿利新蓝、PAS、茚三酮和酪氨酸特异性染色[21]．这项研究并没有发现囊尾骨壁或任何残余的囊尾骨壁围绕着被膜。

健康吸虫与坏死吸虫的组织化学差异明显。坏死吸虫体内除了萎缩的卵黄囊外，没有可识别的器官或细胞。残体的外层由虫皮和附著的受损的宿主小管细胞组成。NS和HH染色强烈。鳞状小管细胞将坏死肿块壁隔开似乎是宿主对感染的唯一反应。在一项研究中也报道了类似的宿主反应Nanophyetus salmincola，宿主（鲑鱼）在寄生虫囊蚴周围形成肾上皮细胞膜[21]．

感染的答:renale引起触角腺小管的组织学改变，但仅对那些与寄生虫直接接触的细胞。宿主小管的损失是由于寄生虫的进食、磨损和生长挤压造成的，被挤压的小管细胞总是位于靠近寄生虫被膜的位置。小管细胞受压后发生明显的形态学改变，与既往研究一致[8，但触角腺细胞的组织化学变化不明显。没有发现由于感染而引起的器官范围的影响，也没有观察到其他祖性吸虫肾感染所引起的炎症反应[22]．这揭示了剩余的触角腺组织对感染的总体耐受性。宿主小管是已知的功能，即使大多数器官已被寄生虫破坏，从观察到的卵子从寄生虫下游。

根据早期的研究，寄主和寄生虫之间的关系被认为是很确定的答:renale为这一解释提供支持[10]．兰德斯和琼斯[8]在受感染和未受感染的虾之间没有显示出显著的体长差异，并且显示寄生虫在寄生虫死亡和坏死之前并不总是破坏宿主触角腺。此外，该研究和目前的研究报告了受感染触角腺体内的功能性小管。目前的研究没有发现宿主反应限制了寄生虫的生长或发育，这表明触角腺体用于葡萄糖的再吸收、排泄和离子调节[23]，对主机来说不是必需的。一些种类的帕拉莫尼虾利用鳃进行离子调节和排泄[24，25，它的鳃有可能卡迪亚肯斯用于补偿触角腺体的损失。

5.结论

这是第一次组织化学检查答:renale周围的宿主组织没有囊壁或分泌物将寄生虫与宿主分离。此外，除了那些靠近蠕虫的细胞外，没有发现宿主小管组织学上的差异，而且感染没有引起宿主反应。坏死团块的组织化学染色显示蛔虫体内卵黄囊的破坏，但没有显示蛔虫周围或小管内的其他酪氨酸基础结构，提示宿主黑色素反应。唯一的宿主反应似乎是坏死蠕虫周围的鳞状细胞包膜的发展，这可能是被动的。这些结果支持了答:renale与宿主的关系高度进化，对宿主造成的伤害很小。

利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者感谢A. Diamond博士在收集方面的帮助卡迪亚肯斯宫殿酒店以及特洛伊大学对出版费用的财政支持。

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