印度孟买疟疾诊断中改良的定量Buffy Coat和两种快速检测与外周血涂片比较研究

摘要

为了找到一种快速、可靠、准确诊断疟疾的方法，研究了ttp总检测(HRPII & aldolase Ag)、优势mal卡(parasite特异性LDH)、改良QBC等检测方法的有效性，并与常规血涂片镜检进行了比较。100个感染了间日疟原虫101人感染了恶性疟原虫被列入这项研究。命中总次数，优势卡，修改QBC的敏感度恶性疟原虫检出率为70.3,95%，98%，特异性分别为98%，98%，96%。命中总次数，优势卡，修改QBC的敏感度间日疟原虫检出率分别为73%、97.0%、98%，特异性均为98%。恶性疟组第15天，优势mal卡和截击总假阳性8例(7.92%)，假阳性59例(58.41%)。在第15天，间日疟组，截击总显示52%的假阳性。研究表明，只有在有适当设施的情况下才能使用经修改的QBC。马尔卡是较截击总次数更好的随访工具。

1.介绍

印度的国家病媒传播疾病控制规划(NVBDCP)每年报告约200万疟疾寄生虫呈阳性病例，其中约50%为阳性病例恶性疟原虫(1]。

疟疾检测的黄金标准是显微镜检测，这既繁琐又依赖技术专长。在此基础上，介绍了截击总数、优势mal卡、QBC等测试方法。鉴于疟疾感染的严重性和印度各地诊断设施的缺乏，我们在基线和8天和15天的随访中对上述显微镜检查进行了比较研究。

2.材料和方法

本研究是一项前瞻性的、盲评估的、比较的研究，评估各种用于诊断疟疾的技术在患有无症状疟疾的患者中的应用恶性疟原虫或间日疟原虫，经独立的伦理委员会批准后进行。

2.1。参与者

2010年5月至2011年11月，在印度孟买Kasturba医院传染病科(OPD)，在获得书面知情同意后，对18岁至70岁的疑似疟疾发热史患者进行筛查。有症状的、无并发症的疟疾患者，经下列任一或同时存在的标准被包括在内:(一)血液涂片呈阳性恶性疟原虫或间日疟原虫无性寄生虫血症和/或性寄生虫，(b)24小时内发烧或有发热史。有严重临床表现需要立即转诊的患者被排除在研究之外。

知情同意是从谁参与研究的所有患者服用。重要参数，如温度，脉搏和血压，在研究（一天）的开始被记录下来。

样品收集。采用手指针刺法采血供研究用。

的血液两三滴置于载玻片上，五μL到移液管为优势MAL卡，五μL到施用器用于Parahit总，和55-65 μL直接加入QBC试管，盲评者检测。患者在治疗后第8天和第15天被要求随访。这样做是为了评估阴性测试所显示的治疗成功程度。

2.2。测试方法

2.2.1。用染色的薄厚外周血涂片(PBS)进行镜检诊断

在同一载玻片上制备厚膜和薄膜，姬姆萨染色，在油浸透镜下用光学显微镜观察。

无性期和性期寄生虫的密度是通过对200个白细胞分别计算寄生虫的数量来确定的，然后以微升表达(μL).如果在200个白细胞中检测到小于或等于的扁桃体寄生虫，则计数到500个白细胞。如果在至少100个连续的油浸油田中没有发现寄生虫，厚膜被认为是阴性的。

2.2.2。定量褐皮大衣(QBC)

QBC (Becton Dickinson)采用微血细胞比容离心，是一种直接检测疟原虫的有效手段。它使用一根内部涂有EDTA和吖啶橙的毛细管[2]。使用染料的前提是，受感染的红细胞比未受感染的细胞密度小，主要集中在界面区域——靠近RBC柱顶的一到两毫米的小区域。由于吸收了染料，这些寄生虫发出绿色和橙色的荧光。

2.2.3。修改QBC技术

在改良的QBC中，QBC管中填充55μ我的血液。在管的两端放置塞子和浮子，然后在当地可用的rm - 12c REMI微型离心机中，而不是parafuge, 12000 RPM离心5分钟。将离心管置于夹管架中，在Labomed公司生产的60倍紫外显微镜下观察。寄生虫的细胞核发出亮绿色荧光，而细胞质呈橙色。排除阴性的总检查时间是7到10分钟。对上述技术的结果进行了如下报道:(1)有无寄生虫和(2)形态。

2.2.4。疟疾快速诊断试验的评价

根据制造商的说明书进行并解释这两种疟疾快速诊断。

(1)优势Mal卡。批号ACM15101, J Mitra & Co ltd，印度，是一个单独包装的测试盒，诊断疟原虫感染的pLDH检测，区分恶性疟原虫和其他疟疾物种间日疟原虫,malariae,或疟原虫那。它需要五μL用试剂盒提供的移液管采集全血。测试结果需在20分钟后读取。

(2)截击总数测试。(批号4000006623,SPAN Diagnostics Ltd，印度苏拉特)该测试是使用商业提供的试纸和试剂，按照制造商的说明进行的。它也是一个单独包装条诊断恶性疟原虫HRP-II(富含组氨酸蛋白-2)检测和Pan疟疾抗原醛缩酶对其他物种的感染。它需要五μL用检测试剂盒提供的样点器采集全血。测试结果需在20分钟后读取。

2.2.5。访问日程安排

所有患者在第一天就诊，并要求在第8天和第15天随访。每个患者样本都在随访当天进行了所有的测试。

快速测试是由两个独立的盲法研究助理阅读，以尽量减少偏差。血膜通过在实验室盲经验丰富的显微镜不参考的快速试验和患者的病史，结果检查。该测试通过快速测试或所有积极的幻灯片，通过快速测试呈阴性阳性全部转阴幻灯片由不了解显微镜的结果另一位专家显微镜再次检查。

2.2.6款。统计方法

大部分分析是由Instat 3.2版本(加州GraphPad软件公司)和Epimax计算器(美国新泽西州临床与经济软件解决方案公司)完成的。灵敏度也计算手动TP / (TP + FN)×100%,特异性为TN / (TN + FP)×100%,阳性预测值(PPV) TP / (TP + FP)×100%,阴性预测值(NPV)作为TN / (FN + TN)×100%,假阳性率(玻璃钢)FP / (FP + TN)×100%,准确性(ACC) (TP + TN) /(正面+负面)×100%,和错误发现率(罗斯福)FP / (FP + TP)×100%。敏感性和特异性用于计算阳性检验结果[敏感性/(1 -特异性)]和阴性检验结果[(1 -敏感性)/特异性]的似然比。还计算了比值比。所有试验参数均以显微检查为金标准进行评估。

3.结果

3.1。参与者

2010年5月至2011年11月，共对1301例疑似疟疾患者采用厚、薄PBS(外周血涂片)筛查疟疾寄生虫。经筛查，符合入选标准(知情同意、诊断为阳性、发热、发热史)的266例患者入组研究;216名患者疟原虫呈阳性;50例疟疾寄生虫呈阴性。在216例阳性患者中，201例完成随访，101例感染恶性疟原虫,有100人感染了间日疟原虫如该图所示1。

被诊断为恶性疟疾患者的年龄从18岁到70岁，（31.94±11.37），并与间日为32.01±12.21不等。The mean baseline, that is, on day one, asexual parasite density in falciparum group was 4436.16 ± 11996.87 (0–112000), sexual density was 335.2 ± 769.75 (0–6000 µL), mean asexual density in vivax group was 2728 ± 3157.15 (40–13040 µL), and sexual density was 3610 ± 4407.55 (80–19200 µL) (Table1)。

3.2。测试结果

在对50名阴性患者，一个假阳性检测用PBS显微镜相比。的敏感性，特异性，PPV，NPV，和恶性疟原虫和间日疟原虫臂的阳性似然比和似然比负已使用2×2表，外周血涂片为金标准（表计算2,3.和4)。

恶性疟组中，优势mal卡未检出5例恶性疟阳性。第8天，9例患者恶性疟原虫采用优势mal卡片检测配子细胞。除此之外，在第8天还发现了15个假阳性。第15天镜检出8例假阳性。

截击总未能检测出30例恶性疟原虫阳性。Parahit total8天检测出68个假阳性，15天检测出59个假阳性。

改良的QBC在第一天没有发现两个阳性结果。第八天，所有9名患者恶性疟原虫配子细胞被检测到，然而在第15天，所有寄生虫都是阴性的。

在疟原虫密度小于200的间日疟组中，Parahit total和Advantage mal card均未检测到阳性，而QBC的敏感性为33%。

在疟原虫密度超过200的间日疟组中，Parahit total的敏感性为75.25%，而Advantage mal card和QBC的敏感性为100%。

在疟原虫密度小于200时，Parahit total显示出非常低的灵敏度，只有5%，而优势mal卡和QBC分别显示出75%和90%的灵敏度(表)5)。

当寄生虫密度大于200时，Parahit total的敏感性为86.41%，而Advantage mal card和QBC的敏感性为100%。

在间日疟组，100例完整随访患者中，Advantage mal card PBS镜检未检出间日疟阳性3例。第8天，4例患者为假阳性，第15天所有患者均为阴性。

Parahit总无法拾取27个样品，其是由间日疟原虫镜检阳性。它检测到的1作为混合感染，其为阳性间日疟原虫通过显微镜。

第8天，有67例假阳性，镜检为阴性，第15天，截击总检测出52例假阳性。

一天一个修饰QBC臂无法拾取已检测到阳性两个样品间日疟原虫通过显微镜。其中一例为假阳性，镜检为阴性。

间日疟组和恶性疟组对截击总灵敏度和特异性分别为73%和98%，恶性疟组分别为70%和98%。与外周血涂片相比，mal卡片对间日疟组的敏感性和特异性分别为97%和98%，对恶性疟组的敏感性和特异性分别为95%和98%。间日疟组和恶性疟组的敏感性和特异性分别为98%和96%，是一种较好的诊断试验。

4.讨论

疟疾的准确诊断是发热病人的抗疟疾药物，以降低其发病率和死亡率的及时治疗很重要，也能够有效地管理nonfebrile疾病。PBS显微镜是非常繁琐和耗时。各种灵敏的方法已被用于疟疾的简单，可靠，快速的诊断。最有前途的这些都是快速诊断试验和QBC [3.与Giemsa染色PBS显微镜进行比较，以诊断间日疟原虫和恶性疟原虫感染。

改良QBC法未检出2例PBS间日疟原虫阳性。这可能是由于晚期滋养体的比重较小间日疟原虫与褐毛的白细胞层相似，导致寄生虫在离心后被掩盖在粒细胞层中。它们也变得难以识别，因为它们在离心过程中被压缩并失去了变形虫的形状[4]。改良的QBC也未能检测到两种PBS恶性疟原虫的阳性，这可能是由于低寄生虫血症所致。首次使用者也可能无法识别寄生虫，特别是当寄生虫浓度较低时[5]。

据Gurung等人报道，QBC的敏感性高达90% [6]，96.22％，通过班达等人。(7， Benito等人的研究结果为99.7%。[8]。在我们的研究中发现改良的QBC具有类似的敏感性。在本研究中间日疟组和恶性疟组的敏感性和特异性分别为98%和96%，是一种较好的诊断试验。

修正QBC检测1个样本为假阳性间日疟原虫和两个为误报恶性疟原虫镜检结果为阴性。

结果也可以在8到15分钟内得到，这只是厚膜方法所需时间的一小部分。培训资源也减少了，因为受训3-5天的人员可以产生可与经验丰富的显微镜工作者相媲美的结果。改良的QBC有望成为吉姆萨染色PBS的良好替代品，因为它作为常规的QBC具有速度、敏感性和特异性，特别是在患者负荷极高的情况下。

我们对常规QBC方法的修改在一个小型实验室设置中降低了每次测试48%的成本[9]。

在两种评估的抗原检测中，与外周血涂片相比，优势mal卡在间日疟组的敏感性和特异性分别为97%和98%，在恶性疟组分别为95%和98%。与QBC比较，优势mal卡片试验的灵敏度几乎相同。抗原试验的局限性在于它不能区分活动性感染和新近治疗的感染，这仍然是显微镜和QBC的一个重要优势。此外，RDT不能检测疾病的严重程度，只能用于诊断疟疾。此外，寄生虫计数也不能做使用RDT，这是特别需要恶性疟原虫感染。

Parahit总的灵敏度和特异性分别为73％和在间日疟原虫臂98％和70％，而在恶性疟原虫臂98％。优势MAL卡的灵敏度比Parahit总用于检测疟疾感染好得多。用于低灵敏度恶性疟原虫这可能是由于17例患者中只有配子细胞未被截击总数检测到所致。由于该抗原(Pf HRP-II)仅在无性红细胞期存在，并在一定程度上存在于早期配子细胞中，因此该检测无法检测到疟疾专利前期患者或血液中只有成熟配子细胞的患者[10]。

优势mal卡(pLDH Ag)比截击总卡(HRP-II Ag)的主要优点是在后续研究中假阳性较少。

恶性疟原虫在截击总数中的高假阳性可能是机体在清除寄生虫后缓慢清除HRP-II所致。研究表明，HRP-II会持续存在，并在疟疾临床症状消失、寄生虫明显从宿主体内清除后可检测到[11]。胡马尔等。检测到对28天七一天，并在27％的治疗的患者的68％循环HRP-II抗原。HRP-II的持久性仍然是[不清楚12]。

如Gerstl等人所建议[13在疟疾流行地区，重要的是在寄生虫被清除之后有短时间的寄生虫抗原清除时间，以便卫生保健人员能够解释快速的检测结果。因此消除了以前治疗感染的假阳性结果。

Ashley等[14的研究表明，在单日疟原虫感染中检测pLDH抗原的OPTIMAL的敏感性为92.2%。CareStart(检测pLDH抗原)检测恶性疟的敏感性为93.5%，但检测非恶性疟的敏感性较差，仅为78.5% (95% CI = 73-83.1)，这限制了其在非恶性疟高流行地区的应用[14]。在我们的研究中间日疟原虫检测不仅仅是恶性疟原虫因此，它是唯一具有如此高灵敏度的快速测试间日疟原虫。

在本研究中，优势mal卡的灵敏度为97%间日疟原虫，从而使其成为优势物种所在地区的良好诊断工具间日疟原虫比如印度的孟买。因此，Advantage mal card明显优于Parahit total，也优于其他疟疾pLDH检测试验，特别是对非恶性疟原虫感染的检测。很少RDTs报告超过90%的敏感性间日疟原虫。但本研究显示，优势mal卡对两者都有很高的敏感性和特异性间日疟原虫和恶性疟原虫这可能归因于诊断技术的改进，因为我们的所有试验都是在医院环境中按照适当的储存条件和制造商的指示进行的。所有RDTs的结果都具有可比性。

5.结论

需要采用更敏感的检测方法，这些方法除了快速之外还将能够检测低水平的寄生虫血症。Giemsa染色显微镜的替代品有PCR、QBC和RDTs。PCR作为一种研究工具，不适合在现场或临床实验室进行常规应用。QBC法比外周血膜法更快速，因为离心可使疟原虫聚集在毛色层下的一个小而致密的区域。这增加了解释的速度和容易，特别是在低寄生虫血症的情况下。改进的QBC并没有改善背景和形态学外观。常规QBC的背景和形态学表现与改良QBC基本相似。我们对常规的QBC技术进行了修改，使其在不影响该技术的敏感性和特异性的前提下降低成本。它与常规的QBC一样灵敏。它也比常规的QBC更具成本效益，后者是印度诊断实验室的要求。 Therefore modified QBC could be the method of choice for laboratory setting in India as an alternative to conventional microscopy. However Giemsa stained microscopy is the gold standard.

抗疟药物开发方面的投资有所增加，但应同时投资于改进诊断工具。考虑到诊断方法的优点和缺点，可以从这项调查中得出结论，在适当的设施可用的情况下，改进的QBC可以取代显微镜检查。然而，在没有足够的实验室备份的情况下，可以使用更简单和用户友好的技术，如优势mal卡，它具有很高的敏感性和特异性。本研究的结果也将有助于为国家和国际消灭疟疾方案作出政策决定。

关键信息

需要更多的投资来改进疟疾诊断的检测。实验结果表明，改进的QBC是一种具有成本效益和准确性的检测方法，可以在设备适当的实验室中使用。mal卡是一种更好的后续试验，但可以使用，即使没有实验室设置。

利益冲突

作者宣称没有关于本文的发布利益冲突。

致谢

作者的感激之情是由于两个厂家RDT提供他们的评价，并吉里什Patwardhan博士测试为评估提供QBC测试。他们非常感谢谁参加了考试疟疾研究的患者。

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