互动Leishmania Braziliensis.巨噬细胞依赖于细胞骨架和肌球蛋白Va

抽象的

利什曼病是一种被忽视的热带疾病，没有有效的疫苗。研究肌动蛋白、微管和肌动蛋白为基础的分子运动肌球蛋白Va参与Leishmania Braziliensis.巨噬细胞相互作用。结果显示，不管巨噬细胞的激活状态如何，当巨噬细胞没有F-actin或微管时，其关联指数均降低。在没有F-actin的情况下，非激活细胞中NO的产生增加，而在激活细胞中，NO的产生减少，这与寄生虫无关。在没有微管的情况下，可以观察到一氧化氮产量增加的相反效果。在激活的细胞中，细胞骨架成分的丢失抑制了寄生虫相互作用中IL-10的释放。在未激活的巨噬细胞中，如果没有肌动蛋白或微管，IL-10的生成也会减少。只有肌动蛋白的破坏改变了TNF-的产生α在活化的巨噬细胞中。肌球蛋白Va尾部的表达导致转染巨噬细胞之间关联指数的急性下降原虫promastigotes。这些数据揭示了F-actin，微管和肌球蛋白va的重要性，提示细胞骨架的调节可能是一种机制原虫克服巨噬细胞建立感染的自然反应。

1.介绍

利什曼病是由该属的几种不同的原生动物寄生虫引起的利什曼虫．利什曼虫寄生虫维持由Dipteran昆虫（杂种）中的相的生命周期和哺乳动物宿主的相。当受感染的桑迪咬人时，发生传输。这可能导致巨噬细胞的感染，其中寄生虫在吞噬症的敌对环境内茁壮成长[1］．LeishManiaisis是最重要的热带疾病之一，全球88个国家的3.5亿人患有发展众多形式疾病之一的风险[2］．

利什曼病的多种形式依赖于尚不清楚的因素，包括寄生虫的种类和最初感染时宿主的健康状况。寄生虫病可以从自我愈合的皮肤损伤到可导致死亡的全身器官感染。Leishmania Braziliensis.是美洲粘膜皮肤病的致病因子。尽管它非常重要，但由于困难，它的研究比其他菌株在于在体外培养(3.，4］．

的利什曼虫寄生虫显示在形态，生物化学，细胞内组织和行为中不同的多种形式。在沙糊中，复制形式利什曼虫SPP。，Promastigote，被鞭打和动机。Promastigotes的子集通过差异化进入，成为不明显的传染性阶段春季春季。在Sandfly咬伤之后，这些阶段Promastigotes传输到哺乳动物主体。当寄生虫通过募集到咬伤部位的巨噬细胞经历常规吞噬作用时，感染过程开始。在吞噬作用后，寄生虫位于经典的吞噬细胞内，并经历分化成神经塔基托形式，其对这些细胞结构中存在的酸性pH和溶酶体酶抵抗力进行抗性[5］．Amastigotes没有外部鞭毛，并在各种哺乳动物细胞中作为细胞内寄生虫生活，最特别是在巨噬细胞等专业吞噬细胞内[6］．

吞噬作用发生在细胞外粒子周围的质膜的延伸，随后粒子内化成为一个膜边界的细胞内囊泡，即吞噬体。在巨噬细胞中，不同的细胞表面受体刺激不同类型的吞噬反应[7］．巨噬细胞Fc受体介导IgG涂覆颗粒的吞噬作用。CC受体的连接引发了一个细胞内信号级联，最终撞击肌动蛋白细胞骨架[8］．关于利什曼虫，吞噬响应响应与其他细胞事件偶联，防止致命抗微生物剂等诸如一氧化氮（NO）和许多细胞因子诱导巨噬细胞，这对于开发有效的免疫应答是必要的。这使得寄生虫能够逃避原生性免疫应答并分裂在感染的巨噬细胞的吞噬细胞内，从而从其可以传播和传播宿主内的疾病[9］．

众所周知，脂多糖(LPS)和IFN-γ促进经典巨噬细胞活化(即M1巨噬细胞活化)。M1巨噬细胞的表型包括高分泌IL-12和IL-23，低分泌IL-10(一种抗炎细胞因子)。这些细胞能够产生效应分子，如氧和一氧化氮(NO)的反应种，以及炎症细胞因子，如IL-1β肿瘤坏死因子-α和il - 6。M1巨噬细胞作为细胞免疫应答诱导物，促进辅助性T细胞1 (Th1)分化，介导对细胞内病原体和肿瘤细胞的抵抗[10］．

对所有形式的LeishManiaisis的抵抗力或敏感性与细胞和体液免疫反应之间的平衡有关[11］．几项研究L.主要使用BALB/c和C57/BL6小鼠感染模型显示了与免疫应答相关的良好预后，免疫应答主要是由IL-12和TNF-的产生水平决定的Th1α细胞因子。对LeishManiaisis的更严重表现的易感性与基于抗炎细胞因子IL-4和IL-10的产生的T辅助2淋巴细胞（TH2）的激活相关[12- - - - - -16］．利什曼病是由原虫，观察到一个主要的差异。可以观察到一种加剧的TH1响应（Hiperergy），其促进显示高水平寄生抗原的区域附近的组织损伤的增加。该观察是与高水平的IFN相关的古典粘膜LeishManiais的特征γ和tnf-α和低水平的IL-10。此外，从呈现这种类型的Leishmaniaisis的个体收集的细胞显示对抑制IFN的细胞因子的差异差γ分泌(17］．

Leishmaniaisis没有有效的疫苗，治疗依赖于肠外药物，呈现出高毒性，低功效，以及在某些情况下广泛的阻力[18，19］．最常见的药物是肾，肝和心脏毒性[20.］．对两者关系的调查研究利什曼虫它的宿主细胞对于识别可能干扰入侵过程的潜在目标至关重要。许多研究表明，干扰寄主与寄主的相互作用是有效的。例如，关联指数的下降利什曼虫当使用4,5,6,7-四溴苯苯并三唑（TBB），使用特定酪蛋白激酶2（CK2）抑制剂时，观察到巨噬细胞[21］．TBB还能够逆转这种类型的细胞相互作用中的正血小板活化因子(PAF)作用[22］．用1,10-邻菲罗啉(phen)和1,10-邻菲罗啉-5,6-二酮(phendio)也报道了类似的抑制作用，这是一种离子螯合剂，可抑制金属依赖性肽酶[23］．

TBB还引起了细胞形状和细胞骨架的变化，这对吞噬过程很重要。吞噬作用的颗粒摄入是由肌动蛋白细胞骨架和覆盖膜的顺序重排引起的[24］．能够干扰细胞骨架组分动态的抑制剂和/或酶，如latrunculin A，它专门作用于破坏肌动蛋白细胞骨架[25和能解聚微管的诺可达唑[26]，是寄生虫 - 宿主细胞相互作用的良好候选者。此外，已观察到分子马达肌蛋白VA与吞噬物质相关[27］．

Latrunculin A（2-噻唑烷酮大环内酯）是从红海海绵纯化的毒素Latrunculia华丽号．这种物质隔离g -肌动蛋白并阻止f -肌动蛋白组装。它以1:1的化学计量结合单体肌动蛋白，可用于阻断纯化的肌动蛋白的聚合( ）.当使用的范围为0.1和10时，在细胞培养物中观察到该毒素的效果 μ米(28，29］．这些作用似乎迅速发生，毒素促进肿瘤细胞细胞骨架在10分钟内解聚[29］．

诺可达唑是一种抗有丝分裂剂，通过与微管结合破坏微管β微管蛋白(30.，从而促进对微管动力学的抑制。治疗5分钟后，可以在细胞中观察到这些效果[31］．诺可达唑促进有丝分裂纺锤体的破坏[31，32和高尔基复合体的分裂[33］．

在本研究中，我们研究了肌动蛋白和基于肌动蛋白的分子运动肌球蛋白Va之间的相互作用Leishmania Braziliensis.和巨噬细胞。

2.材料和方法

２.１.化学物质

5-(和-6)-羧基荧光素二乙酸酯、琥珀酰亚胺酯(绿色CFSE)、氯甲基四甲基罗丹明(橙色CMTMR)和拉春库林A均购自Invitrogen公司(Eugene, Oregon, USA)。胎牛血清(FCS)购自Cultilab Co (Campinas, São Paulo，巴西)。诺可达唑和本研究中使用的所有其他化学品均购自Sigma(美国MO圣路易斯)。

2.2。寄生物

菌株L.（V.）Braziliensis(MHOM/BR/2002/ emm - iocl - l2535)通过在26℃施耐德培养基中添加2 mM谷氨酰胺、100单位/mL青霉素、100 mg/mL链霉素和10% FCS维持原鞭毛虫形态。在相互作用检测中，先用5M Green CFSE在37°C或5分钟内10分钟 M橙色CMTMR为20分钟，然后通过离心用PBS洗涤两次，并将最终的颗粒悬浮在补充10％FCS的Dulbecco改性鹰介质（DMEM）中。

2.3。细胞培养

原始264.7巨噬细胞细胞系(请提供博士玛西娅Paes-Laboratorio de Bioquimica大学Estado做里约热内卢,里约州立,里约热内卢,巴西)是维持在37°C和10%胎牛血清DMEM培养基补充,青霉素(100单位/毫升),和链霉素(100毫克/毫升)在湿润的气氛中4%的有限公司₂．

2.4。Leishmania Braziliensis.-Macrophages互动

将巨噬细胞接种到含有玻璃盖玻片的24孔板上，在4％CO中在37℃下含有2小时的玻璃盖板2小时₂在含或不含脂多糖(LPS) (100 ng/mL)和INF-的条件下孵育17 hγ(1g/mL)₂大气，如前所述[34，35］．在实验的那一刻，用含有Latrunculin A的DMEM替换培养基（5 米诺考达唑(5m），或在37°C下没有药物在4％CO的潮湿气氛中₂10分钟。然后，加入预先用CSFE标记的春季春季，并使其在4％CO中在37℃下以5：1的比率在5：1的比例下与巨噬细胞相互作用₂的气氛。孵育后，用PBS洗涤3次，用Giemsa固定并染色，通过计数3个重复的覆盖层中600个细胞来确定感染的巨噬细胞百分比，如前所述。关联指数由受感染巨噬细胞(至少有一种关联或细胞内寄生虫的细胞)的百分比乘以每个细胞(内化或简单附着在细胞上)的寄生虫的平均数量来确定[36］．根据细胞活力试验选择拉春库林和诺考达唑的孵育时间。这一次不影响巨噬细胞的活力。

肌球蛋白Va检测和肌动蛋白染色m green cfse或5 m橙色cmtmr（仅在肌球蛋白Va的情况下）并在上述条件下允许与巨噬细胞相互作用。相互作用后，用4％多聚甲醛固定细胞，用0.1％Triton X-100透露透析化，并在室温（用于肌动蛋白染色）或使用1％牛血清白蛋白（BSA）和20％绵羊血清（用于肌球蛋白VA检测）。将这些细胞用兔抗氨糖苷VA原抗体（1：1000- Santa Cruz Biotech）孵育1小时，并用PBS洗涤。加入二抗，抗兔IgG与Alexa-546（1：1000分子探针）缀合。使用用于肌素VA检测的细胞在玻璃载玻片上使用延长不变色安装介质(分子探针)。将用于肌动蛋白染色的细胞盖玻片用n-丙基没食子酸酯的饱和溶液在PBS中处理，然后放在玻片上进行显微镜观察。使用Zeiss共聚焦显微镜(LSM 510 Meta, Zeiss，德国)(软件Zeiss Vision Release 4.6)采集图像。

2．5．亚硝酸盐的决心

在培养基中积聚的亚硝酸盐作为基于GRIESS反应的NO生产的指示。使巨噬细胞在4％CO中将巨噬细胞粘附在37℃下24小时2小时₂的气氛。用DMEM冲洗贴壁细胞，在有或没有LPS (100 ng/mL)和IFN-的新鲜培养基中孵育17 hγ(1g/mL)，如前所述[34，35］．然后，去除培养基，用latrunculin (5米诺考达唑(5m），或在4％CO中的37°C下40分钟的DMEM₂的气氛。根据细胞活力试验选择拉春库林和诺考达唑的孵育时间。这一次不影响巨噬细胞的活力。为利什曼虫-巨噬细胞相互作用实验，在添加latrunculin A和nocodazole 10分钟后，用PBS洗涤前鞭毛体，在37°C、4% CO中以5:1的比例与巨噬细胞相互作用30分钟₂的气氛。在所有情况下，取上清液样本，用Griess法测定亚硝酸盐含量[37］．简而言之，50 L细胞培养基与50L的Griess试剂，室温孵育10 min, 540 nm处用酶标仪(TP酶标仪热板)测定吸光度。所有实验均以新鲜培养基为空白。用亚硝酸钠连续稀释得到的标准曲线计算样品中亚硝酸钠的含量。

2.6。细胞因子分析

巨噬细胞被播种到24孔培养板上，并在37°C的4% CO中黏附2小时₂气氛，在DMEM中洗涤，在LPS（100ng / ml）和IFN的存在下在该培养基中孵育17小时γ(1g/mL)₂大气，如前所述[34，35］．接下来，Latrunculin（5 m）或nocodazole（5 将M）直接加入培养培养基中，将细胞在37℃下在4％CO中孵育1小时₂在添加寄生虫之前的气氛。根据细胞活力试验选择拉春库林和诺考达唑的孵育时间。这一次不影响巨噬细胞的活力。回收巨噬细胞上清液并用于重新悬浮蛋白质，并以5：1（寄生虫：巨噬细胞）的比例将该悬浮液加入到巨噬细胞中。使这些细胞在37℃下在4％CO中相互作用30分钟₂的气氛。取上清液检测IL-10或TNF-α测量。用与相同方式处理的未感染巨噬细胞用作对照。用于测量细胞因子的所有上清液是18小时和30分钟的结果。根据制造商的说明，使用重组鼠细胞因子和抗体在ELISA（R＆D Systems，USA）中测定细胞因子水平。在450nm中在微孔板读取器（TP读取器热板）中测量吸光度。使用IL-10和TNF评估细胞因子浓度α标准曲线。

2.7。细胞生存能力测试

巨噬细胞用拉曲库林A和诺可达唑处理1小时30分钟(本工作使用的最大孵育时间)，通过MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化铵]分析评估其细胞活力，如前所述[38］．

2.8。用EGFP-DB（Myosin VA Brain-Isoform Tail）转染巨噬细胞Leishmania Braziliensis.巨噬细胞相互作用分析

巨噬细胞接种于24孔DMEM无抗生素的聚l -赖氨酸涂层覆盖层上。Lipofectamine 2000稀释成25L在室温下孵育5min，然后与在Opti-MEM中稀释20min的质粒DNA混合。在这段时间的孵育后，从巨噬细胞培养液中去除DMEM，并将转染混合物分层置于细胞之上。细胞在37°C、5% CO的湿化气氛中孵育1小时₂，再加入含10%胎牛血清的DMEM 1 mL。细胞在37°C、5% CO的湿化气氛下再孵育18小时₂允许来自质粒的表达。随后，如前所述进行相互作用测定。在Zeiss共聚焦显微镜（LSM 510 Meta，Zeiss，德国）和使用Zeiss视觉版本4.6软件进行成像，观察到细胞。

2.9。统计分析

所有结果以平均值和平均值的标准误差(SEM)表示。归一化数据采用单因素方差分析(ANOVA)进行分析，组间差异采用Tukey后测进行评估。我们使用GraphPad Prism 4.0软件，得到被认为是显着的。

结果

3.1。Latrunculin和Nocodazole对互动的影响Leishmania Braziliensis.LPS和IFN-激活RAW 264.7巨噬细胞γ

研究与其他利什曼虫菌株表明细胞骨架参与寄生虫和宿主巨噬细胞之间的相互作用。然而，不同的菌株也表现出细胞侵袭动力学的变化。了解抗蛋白和微管骨架的作用在与之相互作用期间巨噬细胞的作用原虫，细胞骨架干扰药物latrunculin A [25]和诺可达唑[26]分别解聚丝状肌动蛋白和微管。巨噬细胞的细胞活力未因药物治疗而改变(数据未显示)。在添加寄生虫前10分钟加入药物，以防止解聚动力学引起的人工制品。在没有F-actin的情况下，与未处理的对照组相比，寄生虫与巨噬细胞的关联指数降低了66.45%。微管的缺失使关联指数降低了57.04%(图1）.

由于寄生虫的潜力很高，与活化的巨噬细胞相互作用体内，在用LPS（100ng / ml）和IFN刺激巨噬细胞的24小时后进行类似的实验。γ(1.0g / ml）。与胞间骨架破坏剂未治疗的活化巨噬细胞（M1）显示出与非活化的巨噬细胞相比的关联指数显着增加。F-actin和微管的丧失显着降低了关联指数。在Latrunculin A的存在下，关联指数之间原虫M1巨噬细胞受到了68.71%的抑制，而在诺可达唑治疗的微管缺失情况下，抑制率为80.17%(图)1）.

３．２．拉楚库林和诺考达唑对RAW 264.7巨噬细胞NO生成的影响

没有生产是巨噬细胞进行的主要嗜血杀霉素过程，以及利什曼虫Genus开发了干扰没有生产的逃避机制[39］．为了确定细胞骨架对通过巨噬细胞的不产生的影响，在与寄生虫相互作用之前和之后，在F-actin和微管中断后测量亚硝酸盐（图2）.在对照组M1巨噬细胞中，出现原虫在否（图中，促进了少量增加（约20％）（图2（a）)，与未感染M1巨噬细胞相比(图2（b））.经拉春库林A处理后，对寄生虫的NO产量下降了36.86%。诺考达唑处理则相反，NO产量增加了36.17%(图)2（a））.

除寄生虫存在外，细胞骨架破坏的影响还取决于巨噬细胞的激活状态。未激活的巨噬细胞经latrunculin处理后NO产量显著增加(390%)，与M1巨噬细胞的NO产量相同。相反，在激活的细胞中，latrunculin A处理减少了70%的NO生成。诺考达唑在未激活的细胞中没有作用，而在M1巨噬细胞中，该物质抑制no产生75%(图)2（b））.

3.3。Latrunculin和Nocodazole对IL-10和TNF-生产的影响αRAW 264.7巨噬细胞的细胞因子

细胞因子调节是对激活或病原体内化的另一种巨噬细胞反应。在这项工作中，释放IL-10和TNF-的效果α在细胞骨架和与寄生虫的相互作用进行评估。我们观察到抑制M1巨噬细胞的IL-10释放，并与之相互作用原虫促进IL-10释放进一步降低(图)3(一个)和3 (b)）.在寄生虫与M1巨噬细胞的相互作用中，用拉春库林治疗可减少IL-10的释放，降低79.17%。诺考达唑治疗效果更佳，可消除IL-10的释放。在没有寄生虫相互作用的非激活巨噬细胞中也观察到类似的结果(图)3 (b)）.拉通库林和诺考达唑能分别降低非激活巨噬细胞IL-10的释放率84.5%和83%。未感染的M1巨噬细胞未见明显变化。

诺可达唑和拉春库林A治疗对TNF-的释放无影响α被感染的M1巨噬细胞(图3 (c)）或通过未感染和未激活的细胞（图3 (d)）.然而，用Latrunculin治疗促进了TNF的抑制作用α在未感染的M1巨噬细胞中释放82.3%(图)3 (d)）.

3．4．Latrunculin和Nocodazole对RAW 264.7巨噬细胞肌动蛋白组织的影响

通过观察关联指标、NO生成和细胞因子生成的变化，我们对巨噬细胞的形态变化进行了评估。巨噬细胞与肌动蛋白相互作用后，细胞骨架染色原虫(图4）.在未接受药物治疗的对照组巨噬细胞中，观察到高组织的f -肌动蛋白，细胞周围染色明显，可见大量丝足结构。在代表图像(图4(一)），内化寄生虫可以在橙子中观察到红色和绿色染色的叠加的结果，显示肌动蛋白细胞骨架和寄生虫之间的离子化，证实actin在此过程中的参与如前所述。在没有Latrunculin的肌动蛋白长丝的情况下治疗（图4（b）），观察到巨噬细胞的形状更加圆形，缺乏剥离结构。没有内化寄生虫的细胞;相反，寄生虫可以在绿色上观察到巨噬细胞或在细胞外环境中自由。用Nocodazole扰乱微管的处理对巨噬细胞的细胞组织具有深远的影响。染色的F-actin组织是随机的，没有细胞周边的突出结构，没有氟覆的情况。类似于用Latrunculin处理的巨噬细胞，没有细胞与内化寄生虫，可以以巨噬细胞的绿色观察。一些寄生虫似乎是半内部化的（图4（c））.

3．5．肌球蛋白a尾eGFP-DB转染巨噬细胞

由于对完整细胞骨架的高度依赖以及寄生虫/巨噬细胞相互作用的动态特性，分子马达被认为是潜在的重要宿主细胞因子。肌球蛋白Va是第一个被考虑的候选者，因为它广泛的表达和不同的功能，包括参与吞噬体运动。使用抗MVa的抗体，我们观察到巨噬细胞中存在这种蛋白，以及肌球蛋白与寄生虫的共定位。内化的寄生虫可以看到橙色，这是红色和绿色染色叠加的结果(图)5(一个)）.为了评估肌凝蛋白Va的作用，在加入寄生虫之前，将融合于eGFP的肌凝蛋白Va尾部(脑亚型)组成的结构体转染巨噬细胞。转染后的巨噬细胞之间的关联指数突然下降原虫promastigotes（图5 (b)）.模拟转染的巨噬细胞没有干扰寄生虫的相互作用，并且可以观察到一些原鞭毛体附着在这些细胞上或被它们内化(图)5 (c)）.野生型巨噬细胞的关联指数为而模拟巨噬细胞的，而在转染巨噬细胞中，该指标为(数据没有显示)。

4.讨论

建立原虫人类感染，以及利什曼病的开始，从癌症招募到沙蝇叮咬的鸟类的摄取开始[40］．巨噬细胞作为一种专业的吞噬细胞，在机体对外来物质包括病原体的免疫应答中发挥着重要作用。正常情况下，巨噬细胞的吞噬启动了一个破坏过程，主要通过NO的产生来破坏内化的微生物[41］．然而，利什曼虫已经进化的机制来中和巨噬细胞的正常过程，使其在细胞内生存并有效地避免免疫系统，从而繁殖感染[39］．了解由寄生虫调节的宿主细胞内的通路对于应对感染的后果具有重要意义。

考虑到吞噬作用的重要性，本研究聚焦于潜在的细胞骨架需求，特别是f -肌动蛋白和微管。肌动蛋白微丝、中间丝和微管是真核细胞中主要的细胞骨架成分。细胞骨架是一种高度动态和响应性的结构，它受到多种蛋白质的调控，这些蛋白质参与了广泛的事件，如信号转导[42细胞增殖，蜂窝迁移[29]吞噬症和投资癖，无和细胞因子生产[43，44］．我们最初的实验集中在细胞骨架和分子运动肌球蛋白Va在寄生虫和巨噬细胞相互作用中的作用。研究表明，肌动蛋白的初始聚合对吞噬作用侵入宿主细胞具有重要意义[45- - - - - -47以及细胞骨架与肌球蛋白V等运动蛋白相互作用的重要性[48］．

Latrunculin A被选择来解聚合肌动蛋白丝，因为它具有良好的快速和可逆地调节贴壁细胞中肌动蛋白组织的能力[25，49，50］．在未激活的巨噬细胞中，F-actin降低后，关联指数显著降低(图)1）.在激活的M1巨噬细胞中，该指数也降低。虽然latrunculin A破坏了肌动蛋白的细胞骨架，但在本研究中使用的浓度下，一些肌动蛋白丝仍然存在[51，这可以解释剩余的内部化利什曼虫．激活的巨噬细胞的绝对指数大于未激活的巨噬细胞，但与未处理的对照组相比，减少的百分比几乎相同。观察到的高指数的活化巨噬细胞可以解释的增加吞噬细胞，这是由LPS和IFN-促进γ治疗(52］．尽管活化的巨噬细胞有杀死寄生虫的能力，但实验时间(30分钟)不足以观察任何长期效果。

诺可达唑治疗后，微管组织被破坏[53，54］．通过关联指数测量，Nocodazole促进了与M1和非活化巨噬细胞的寄生虫相互作用的高抑制。在M1巨噬细胞中效果更明显。这与先前的观察结果一致，即治疗IFN-γ-用诺可达唑激活的RAW巨噬细胞促进了吞噬指数的抑制(40%)[55］．诺可达唑对肠道上皮细胞(INT407)的感染有40%的抑制作用Enterobacter Sakazakii.［56］．这种低范围的抑制可以解释在诺考达唑存在时观察到的残余寄生虫-巨噬细胞关联。此外，诺考达唑的结果表明，在内化的第一步利什曼虫巨噬细胞更多地与肌动蛋白丝有关，而不是微管。

已经开始观察到，用细胞蛋白酶D的微丝抑制药物治疗巨噬细胞，促进了急剧下降利什曼虫寄生虫绑定。10g / ml这种物质[57］．基于采用细胞酵母菌素的研究，自20世纪70年代以自20世纪70年代以来，在几种寄生原生动物（包括）以来，已经报告了从随后进入宿主细胞的寄生虫附着的离解。利什曼虫［58]，锥虫属［59),而弓形虫［60］．

除了吞噬作用干扰之外，测试了这些化合物影响其他微生物癌巨噬细胞事件的可能性。在这项工作中，Latrunculin已被证明可以增加不激活和未感染的巨噬细胞的生产与LPS和IFN-相同的程度γ激活[44，61，62］．肌动蛋白（G-肌动蛋白）的单体形式促进eNOS的刺激（内皮未合成酶）[63］．在内皮细胞中，NO的产生已被发现与肌动蛋白细胞骨架重组导致的细胞弹性变化直接相关[64］．当肌动蛋白聚合时，细胞弹性的增加伴随着NO生成的减少，而解聚合和g -肌动蛋白的增加则促进NO生成的增加[65］．

虽然巨噬细胞NO的产生主要与iNOS(诱导NO合酶)活性有关，而iNOS是由微生物产物如LPS和各种炎性细胞因子诱导的[66RAW 264.7小鼠巨噬细胞已被证明构成性表达eNOS, lps刺激可通过改变细胞内Ca增加eNOS活性^２＋水平(67］．因为latrunculin与肌动蛋白单体结合，阻止g -肌动蛋白聚合[68]， G-actin的积累可能是引起未激活、未感染巨噬细胞所观察到的变化的关键机制。然而，在被激活、感染的巨噬细胞中，拉春库林促进了NO产生的抑制。同样地，经拉琴库林或细胞松弛素(另一种破坏肌动蛋白细胞骨架的物质)处理的活化巨噬细胞显示NO生成减少[69］．相比之下，Nocodazole通过感染的M1巨噬细胞促进了NO的产生增加，但抑制未受感染的巨噬细胞的生产（无论活化状态如何）。用Nocodazole治疗的肺动脉细胞（PAEC）没有产生的减少，但确切的机制仍然未知[53］．

如前所述，经典巨噬细胞活化导致M1细胞能够产生高水平的肿瘤坏死因子(TNF)、活性氧中间体(ROIs)和iNOS表达。这种激活由IFN-促进，触发的促炎反应导致M1巨噬细胞的发育。在被强制性的细胞内原生动物寄生虫如利什曼虫，锥虫属，弓形虫,和疟原虫，这些细胞是控制寄生虫血症所必需的，特别是在寄生虫病的急性期[70- - - - - -72.］．然而，取决于宿主基因型，寄生虫毒力和感染阶段的参数，宿主也可以产生抗炎细胞因子（TH2）。这些细胞因子（IL-4和IL-13）拮抗M1巨噬细胞，抑制来自L-精氨酸的INOS的不产生，并诱导由酶氨基酶-1催化的L-精氨酸的替代代谢途径。这是巨噬细胞激活的替代途径，这涉及2型反应和部分重叠的表型，包括IL-10分泌。因此，这些可选择的巨噬细胞已经普遍称为M2或AAM [10，73.，74.］．

观察到Latrunculin和Nocodazole在感染的M1巨噬细胞中抑制IL-10分泌，以及未染色的和未激活的巨噬细胞。在未感染的M1巨噬细胞中没有测量显着的变化。TNF-α两种治疗方法均不影响M1巨噬细胞的分泌，只有拉春库林能抑制TNF-α未感染的M1巨噬细胞分泌。因为肌动蛋白和微管都参与了细胞极性的建立和细胞因子和溶细胞颗粒的定向分泌[74.，数据表明，干扰细胞骨架是抑制细胞因子分泌的主要原因。

另一种可能是抑制细胞因子的产生。秋水仙碱，一种也能促进微管解聚的药物，被观察到能强烈减少脂多糖诱导的TNF-的积累αmRNA。该事件表明，预翻译效果可以代表春曲调减少的主要机制 -α生产(75.］．类似地，拉琴库林和诺可达唑可能影响这些细胞因子的mRNA，特别是考虑到细胞骨架在mRNA定位中的作用[76.，77.］．

此外，微管的破坏可能与细胞因子信号转导有关。toll样受体(TLRs)在识别几种病原体来源的成分后参与促炎细胞因子的产生。这些受体激活保守的MyD88通路，触发转录因子NFB和AP-1，它们是产生炎症细胞因子的必要因素[78.］．在树突状细胞中，TLR2和TLR4不存在于细胞表面。它们与靠近高尔基复合体的管状泡状结构相关，并与微管共定位。这表明tlr修饰的囊泡沿着这些结构移动。支持这一观点的是，微管网络的解聚已被证明会扰乱TLR2和TLR4的细胞内分布，从而抑制IL-12和TNF-的产生α回应脑膜炎奈瑟氏菌．但是，吞噬作用不受影响[79.］．

肌球蛋白V运动蛋白负责货物运输，不仅与肌动蛋白丝相互作用，还与细胞骨架的其他一些成分，包括微管、驱动蛋白和中间丝相互作用[48］．使用RNA干扰，基因缺失的研究和显性阴性肌蛋白尾部构建体的表达已被用于评估该蛋白在电机细胞器的运输中的作用。这些研究表明，依赖于肌球蛋白VA的货物运输的速度或全部堵塞减少[80- - - - - -82.］．肌球蛋白Va似乎参与了吞噬体的运输，而其他肌球蛋白类似乎参与了吞噬体的形成[24，83.，84.］．Araaki [83.[肌球蛋白VA是否与吞噬蛋白酶和F-actin结合，这限制了吞噬体的运动。

巨噬细胞中肌凝蛋白Va的存在被证实，肌凝蛋白Va与原虫(图5(一个)）.来描述肌凝蛋白Va与原虫在美国，巨噬细胞被肌凝蛋白Va尾部构建物转染，通过从肌动蛋白丝分离肌凝蛋白Va货物产生显性负效应，从而干扰运输。如图所示5 (b)，肌球蛋白Va尾的存在降低了巨噬细胞与原虫．这结果表明，肌球蛋白VA在协会中发挥作用原虫巨噬细胞。

通过破坏细胞骨架和肌球蛋白VA函数的巨噬细胞函数的两个重要方面是吞噬物体活性和受体再循环。最近，肌动蛋白和微管被证明在从吞噬物中具有重要作用[85.］．在其他细胞类型中，已显示肌苷VA有助于膜再循环和外毒性症[86.，87.］．考虑到甘露糖/焦点受体(MFR)向质膜循环的重要性及其在摄取甘露糖中的作用L. Donovani.［88.),减少原虫在占优势阴性肌球蛋白VA巨噬细胞中观察到的关联可能是由于巨噬细胞膜上的MFR等重要受体的缺失或减少而引起。进一步的调查是表征肌素VA在协会中的作用原虫巨噬细胞。

总体而言，数据清楚地显示了F-actin、微管和肌球蛋白Va在巨噬细胞与巨噬细胞相互作用中的重要性原虫。此外，观察NO、IL-10和TNF-的生成变化α提示细胞骨架的调节可能是一种机制原虫克服巨噬细胞的自然反应并建立感染。

致谢

作者要感谢Léa Cysne博士和Alda Maria da Cruz博士提供了本研究中使用的有毒菌株MHOM/BR/2002/ emm - iocl - l2535。这项工作得到了巴西机构CNPq、FINEP、FAPERJ和CAPES的资助。Dr. P. Dutra获得了意大利里雅斯特第三世界科学院(TWAS)的资助。01-110 RG/BIO/LA)， PADCT (CNPq/ FAPERJ-no .)170.391/02)和CNPq (Edital Universal-no . 170.391/02)。477562/2003-5,不。480681/2004-0也没有。478835/2008-6)。Dr. P. Dutra和Dr. V. Salerno获得了巴西FAPERJ (Programa de Apoio aos Grupos Emergentes-E-26/111.544/2008)的资助。

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