1。介绍
利什曼病是由几个不同的物种属原生动物寄生虫的
利什曼虫 。
利什曼虫 寄生虫维持生命周期阶段组成的双翅类昆虫昆虫(白蛉)和哺乳动物宿主的阶段。受感染的白蛉叮咬人类时发生传播。这可能导致感染的巨噬细胞,这种寄生虫在敌对环境中繁荣的吞噬溶酶体
1 ]。利什曼病是一种最重要的被忽视的热带病,与全球88个国家的3.5亿人生活在发展中国家的风险多种多样的疾病(
2 ]。
许多形式的利什曼病是依赖因素不清楚,包括寄生虫的种类,对初始感染宿主的健康。寄生虫病可以从自我修复皮肤损伤普遍器官感染,可导致死亡。
利什曼虫braziliensis 美洲是黏膜与皮肤的疾病的病原体。尽管它很重要,它已经不如其他菌株因为困难的研究
在体外 培养(
3 ,
4 ]。
的
利什曼虫 寄生虫显示多种形式截然不同的形态、生物化学、细胞内组织和行为。白蛉,复制的形式
利什曼虫 spp, promastigote,鞭毛和能动的。promastigotes进展的一个子集通过分化成为:传染性metacyclic promastigotes。由白蛉叮咬后,这些metacyclic promastigotes被传输到哺乳动物宿主。寄生虫感染的过程开始时,接受传统的巨噬细胞吞噬作用被雇来的咬人。吞噬作用后,寄生虫位于经典吞噬溶酶体并进行分化到无鞭毛体形式,耐酸性pH值和溶酶体酶存在于这些细胞结构(
5 ]。无鞭毛体没有外部鞭毛和生活作为各种哺乳动物细胞的胞内寄生虫,尤其是在专业吞噬细胞如巨噬细胞(
6 ]。
吞噬作用发生扩展的等离子体膜周围细胞外的粒子,紧随其后的是掩饰的粒子成面上胞内囊泡,吞噬体。在巨噬细胞中,不同细胞表面受体刺激各种类型的吞噬反应(
7 ]。巨噬细胞Fc受体调节IgG-coated颗粒的吞噬作用。结扎Fc受体启动细胞内的信号级联,最终影响着肌动蛋白细胞骨架(
8 ]。关于
利什曼虫 ,吞噬反应耦合到其他细胞事件,防止致命的激活抗菌药物如一氧化氮(NO)和许多cytokine-inducible巨噬细胞,这是必要的发展一个有效的免疫反应。这使得寄生虫逃避先天免疫反应,在被感染的巨噬细胞的吞噬溶酶体划分,从那里可以传播和传播疾病在主机(
9 ]。
众所周知,脂多糖(LPS)和干扰素-
γ 促进古典巨噬细胞激活(即。M1的激活巨噬细胞)。M1巨噬细胞的表型包括高生产的il - 12和IL-23和低生产il - 10、抗炎细胞因子。这些细胞能够产生效应器分子,如活性物种的氧和一氧化氮(NO),和炎性细胞因子,如il - 1
β 肿瘤坏死因子-
α 和il - 6。M1巨噬细胞作为细胞免疫反应电感,促进1 T辅助淋巴细胞(Th1)分化,以及调节抗细胞内病原体和肿瘤细胞(
10 ]。
利什曼病的阻力或易受各种形式之间的平衡有关的细胞和体液免疫反应(
11 ]。几个研究
l .主要 使用模型的感染BALB / c和C57 / BL6老鼠显示良好的预后主要与免疫反应有关,Th1由白介素和肿瘤坏死因子的生产水平
α 细胞因子。对更严重的利什曼病的表现与2 T辅助淋巴细胞的激活(Th2)根据生产的抗炎细胞因子il - 4和il - 10
12 - - - - - -
16 ]。在利什曼病的情况下造成的
原虫 观察,一个主要区别。加剧了Th1反应(hiperergy)可以观察到促进组织损伤的增加附近区域显示高水平的寄生虫抗原。这个观察是一个经典的粘膜利什曼病的特征与高水平的干扰素-
γ 和肿瘤坏死因子-
α 和低水平的il - 10。此外,细胞收集来自个人提供这种类型的利什曼病显示不良反应细胞因子抑制干扰素-
γ 分泌(
17 ]。
没有有效的疫苗用于利什曼病,和治疗依赖于肠外药物毒性高,功效低,和,在某些情况下,大范围的电阻(
18 ,
19 ]。最常见的药物是肾脏内科,hepato和cardiotoxic [
20. ]。调查研究之间的关系
利什曼虫 及其宿主细胞的识别潜在的目标,可能会干扰入侵的过程。众多研究表明,干扰parasite-host交互可以是有效的。例如,一个协会之间的指数下降
利什曼虫 和巨噬细胞时观察到的4、5、6,7-tetrabromobenzotriazole (TBB),一个特定的酪蛋白激酶2 (CK2)抑制剂,采用(
21 ]。TBB也能够逆转积极platelet-activating因子(PAF)参谋长对这种类型的细胞相互作用的影响(
22 ]。使用1类似的抑制被报道,10-phenanthroline(苯酚的)和1,10-phenanthroline-5, 6-dione (phendio),这些离子螯合剂抑制metal-dependent肽酶(
23 ]。
TBB也诱导细胞形状的变化和细胞骨架,吞噬的过程是重要的。粒子摄入通过吞噬作用的结果序列重组肌动蛋白细胞骨架和覆盖膜(
24 ]。酶抑制剂和/或干扰细胞骨架的动态组件的能力,比如latrunculin,行为专门破坏肌动蛋白细胞骨架(
25 ),和诺考达唑depolymerises微管(
26 ),是很好的候选人parasite-host细胞相互作用的研究。此外,分子运动肌凝蛋白Va已经观察到与时间有关(
27 ]。
Latrunculin (2-thiazolidinone大环内酯物)是一种毒素净化从红海海绵
Latrunculia华丽号 。这种物质能储备G-actin和防止f -肌动蛋白组装。它结合单体的肌动蛋白1:1化学计量学和可以用来阻止净化肌动蛋白的聚合(
Kd
=
0.2
μ
米
)。这种毒素的影响时观察到细胞培养用于一系列0.1和10
μ 米(
28 ,
29日 ]。这些影响似乎发生的很快,肿瘤细胞的毒素促进解聚骨骼在10分钟
29日 ]。
Nocodazol是一个抗有丝分裂的代理通过破坏微管结合
β 微管蛋白(
30. ),从而促进微管动力学的抑制。这些影响可以观察到在细胞治疗5分钟后
31日 ]。Nocodazol促进有丝分裂纺锤体的破坏(
31日 ,
32 和高尔基氏复合体的碎片
33 ]。
在目前的研究中,我们调查了肌动蛋白的参与和弗吉尼亚州actin-based分子运动肌凝蛋白之间的相互作用
利什曼虫braziliensis 和巨噬细胞。
2。材料和方法
2.1。化学物质
5 -(6)二乙酸-Carboxyfluorescein succinimidyl酯(绿色CFSE)、chloromethyl tetramethylrhodamine(橙色CMTMR)和latrunculin买来英杰公司(美国俄勒冈州尤金)。胎牛血清(FCS)从Cultilab购买公司(坎皮纳斯,圣保罗,巴西)。Nocodazol和其他化学物质用于这项工作买来σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。
2.2。寄生虫
压力
l . braziliensis (v) (MHOM / BR / 2002 / EMM-IOC-L2535)维护promastigote形式培养在施耐德26°C的媒介补充谷氨酰胺和2毫米,100单位/毫升青霉素,链霉素100毫克/毫升,10% FCS。的交互分析,第一次被孵化promastigotes 5
μ
米绿色CFSE 10分钟37°C或5
μ
M橙色CMTMR 20分钟,其次是两个洗PBS离心,最后颗粒悬浮在杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)补充FCS为10%。
2.3。细胞培养
原始264.7巨噬细胞细胞系(请提供博士玛西娅Paes-Laboratorio de Bioquimica大学Estado做里约热内卢里约州立,里约热内卢,巴西)是维持在37°C和10%胎牛血清DMEM培养基补充,青霉素(100单位/毫升),和链霉素(100毫克/毫升)在湿润的气氛中4%的有限公司2 。
2.4。<斜体>利什曼虫braziliensis < /斜体>巨噬细胞相互作用
巨噬细胞被播种到24-well板块包含玻璃盖玻片2 h在37°C的4%股份2 大气,洗一次DMEM和孵化17 h在脂多糖的存在与否(LPS) (100 ng / mL)和正-
γ (1
μ
在37°C g / mL)有限公司4%2 气氛,如前所述
34 ,
35 ]。目前的实验中,替换DMEM培养基是包含latrunculin (5
μ
米诺考达唑(5
μ
米),或没有药物在37°C在湿润的气氛中4%的有限公司2 10分钟。promastigotes,先前标有CSFE添加和被允许与巨噬细胞相互作用在5:1的比例为30分钟37°C公司4%2 的气氛。孵化后,盖玻片和PBS洗3次,固定和染色,染色和被感染的巨噬细胞的百分比是600年由计数细胞一式三份盖玻片,所述。协会指数的比例,乘以感染巨噬细胞(细胞至少有一个相关联或胞内寄生虫)的意思是每个细胞的寄生虫数量(性或只是附着在细胞)
36 ]。latrunculin和诺考达唑孵化的时间用于这项工作是根据细胞生存能力测试。这段时间并不影响巨噬细胞的生存能力。
弗吉尼亚州肌凝蛋白的检测和肌动蛋白染色,寄生虫服用5
μ
M绿色CFSE或5
μ
橙色CMTMR(仅在肌凝蛋白Va)的情况下,允许与上述条件下的巨噬细胞。相互作用后,细胞用4%多聚甲醛固定,permeabilised Triton x - 100, 0.1%和沾1:250 Phalloidin Alexa 546 30分钟在室温下(肌动蛋白染色)或阻塞用1%牛血清白蛋白(BSA)和20%绵羊血清(弗吉尼亚州肌凝蛋白检测)。这些细胞被孵化1 h和兔子antimyosin Va主要抗体(1:1000 -圣克鲁斯生物技术)和PBS洗。二次抗体,anti-rabbit免疫球蛋白共轭alexa - 546(1: 1000 -分子探针),是补充道。弗吉尼亚州的细胞用于肌凝蛋白检测是放在玻璃幻灯片使用
延长不变色 越来越多的媒体(分子探针)。盖玻片包含用于肌动蛋白染色的细胞治疗的饱和溶液n-propyl-gallate在PBS,紧随其后的是安装在显微镜玻片。收集的图片是共焦蔡司显微镜(LSM 510元、蔡司、德国)(软件蔡司视力4.6版本)。
2.5。亚硝酸盐的决心
在培养基的亚硝酸盐积累的测量作为一个指标没有生产基于格里斯反应。巨噬细胞被允许坚持24-well文化板块在37°C 2 h有限公司4%2 的气氛。贴壁细胞被洗DMEM和孵化17 h在新鲜培养基的存在与否有限合伙人(100 ng / mL)和干扰素-
γ (1
μ
g / mL),如前所述
34 ,
35 ]。接下来,培养基被免职,巨噬细胞与latrunculin(5孵化
μ
米诺考达唑(5
μ
米),或者DMEM 40分钟37°C公司4%2 的气氛。latrunculin和诺考达唑孵化的时间用于这项工作是根据细胞生存能力测试。这段时间并不影响巨噬细胞的生存能力。为
利什曼虫 巨噬细胞相互作用实验,10分钟后添加latrunculin A和诺考达唑,洗了promastigotes PBS和允许与巨噬细胞相互作用5:1的比例为30分钟37°C公司4%2 的气氛。在所有情况下,样本的上层清液被格里斯的亚硝酸盐含量测量方法(
37 ]。简单地说,50
μ
L细胞培养基和50
μ
L格里斯试剂和孵化在室温下10分钟,然后吸光度测量在540 nm标(TP读者热板)。新鲜的培养基作为空白实验。亚硝酸盐的量的样本与标准曲线计算得到亚硝酸钠的连续稀释。
2.6。细胞因子分析
巨噬细胞被播种到24-well文化板块和允许坚持在37°C 2 h有限公司4%2 大气,洗在DMEM和孵化17 h在这种媒介的有限合伙人(100 ng / mL)和干扰素-
γ (1
μ
在37°C g / mL)有限公司4%2 气氛,如前所述
34 ,
35 ]。接下来,latrunculin (5
μ
米)或诺考达唑(5
μ
M)是直接添加到孵化介质,和细胞孵化1 h在37°C的4%的股份有限公司2 大气之前的寄生虫。latrunculin和诺考达唑孵化的时间用于这项工作是根据细胞生存能力测试。这段时间并不影响巨噬细胞的生存能力。巨噬细胞的上清液回收用于resuspend promastigotes,这种悬架被添加到巨噬细胞的比例5:1(寄生虫:巨噬细胞)。这些细胞被允许交互为30分钟37°C公司4%2 的气氛。il - 10或TNF -的上层清液被恢复
α 测量。未受感染的巨噬细胞,治疗以同样的方式被用作控制。上层清液用于测量细胞因子都是18 h和30分钟孵化的结果。细胞因子的水平是决定上层清液的ELISA(研发系统、美国)使用重组小鼠细胞因子和抗体根据制造商的指示。吸光度测量在450 nm标(TP读者热板)。细胞因子浓度il - 10和TNF -评价
α 标准曲线。
2.7。细胞生存能力测试
巨噬细胞治疗latrunculin A和诺考达唑1小时30分钟(最大孵化时间用于这项工作)的细胞生存能力评估其MTT (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑)试验(如前所述)(
38 ]。
2.8。巨噬细胞的转染eGFP-DB(肌凝蛋白Va Brain-Isoform尾巴)<斜体>利什曼虫braziliensis < /斜体>巨噬细胞相互作用分析
巨噬细胞被播种到poly-L-lysine-coated盖玻片在DMEM 24-well板块没有抗生素。Lipofectamine 2000被稀释到25
μ
L在室温下Opti-MEM 5分钟,然后与质粒DNA混合稀释的Opti-MEM 20分钟。经过这段时间的孵化,DMEM从巨噬细胞文化,转染混合物是分层的细胞。细胞被孵化的1 h在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2 ,然后1毫升10%胎牛血清DMEM补充说。额外的细胞被孵化18 h在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2 允许表达质粒。随后,一个交互试验进行了如前所述。蔡司的细胞被观察到的共焦显微镜(LSM 510元、蔡司、德国)和成像使用蔡司视力4.6版本软件。
2.9。统计分析
所有的结果提出了均值和标准平均误差(SEM)。正常化进行分析的数据单向方差分析(方差分析),与图基组差异评估后续测试。我们使用软件GraphPad Prism 4.0,和价值观
P
≤
0.05
被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。Latrunculin和诺考达唑交互的<斜体>利什曼虫braziliensis < /斜体> 264.7原始巨噬细胞激活有限合伙人和干扰素-γ<斜体> < /斜体>
研究与其他
利什曼虫 菌株表明,细胞骨架参与寄生虫和宿主巨噬细胞之间的交互。然而,不同的菌株也表现出细胞入侵的动态变化。理解的肌动蛋白和微管细胞骨架的作用在与巨噬细胞
原虫 ,cytoskeleton-disrupting药物latrunculin [
25 和诺考达唑
26 )被用来depolymerise丝状肌动蛋白和微管,分别。巨噬细胞的细胞生存能力是不改变药物治疗(数据没有显示)。药物添加10分钟之前的寄生虫,防止文物因解聚的动力学。在f -肌动蛋白的缺失,该协会指数寄生虫的巨噬细胞参与控制相比,下降了66.45%。缺乏微管(图协会指数下降了57.04%
1 )。
图1
latrunculin和诺考达唑对之间的相互作用的影响
利什曼虫braziliensis 生264.7巨噬细胞。巨噬细胞附着,有或没有17 h之前由有限合伙人和干扰素-激活
γ 接受latrunculin (5
μ
米)或诺考达唑(5
μ
米)10分钟,然后用promastigotes孵化了30分钟。协会指数是由被感染的巨噬细胞的百分比乘以平均每个细胞的寄生虫数量。酒吧代表平均值±标准的错误意味着(SEM)至少有三个独立的实验一式三份。
P
*
≤
0.05
相对于控制灭活的巨噬细胞,
P
Δ
≤
0.05
相对于控制灭活的巨噬细胞,
◆
P
≤
0.05
相对于控制激活巨噬细胞。
![]()
因为高潜力的寄生虫与激活巨噬细胞
在活的有机体内 24小时后,进行了类似的实验刺激巨噬细胞与有限合伙人(100 ng / mL)和干扰素-
γ (1.0
μ
g / mL)。激活巨噬细胞(M1)没有接受cytoskeleton-disrupting代理协会指数有显著提高相比,未激活的巨噬细胞。损失的f -肌动蛋白和微管协会指数显著下降。在latrunculin的存在,该协会指数之间
原虫 和M1巨噬细胞抑制了68.71%,而在缺乏微管由于诺考达唑治疗,抑制率为80.17%(图
1 )。
3.2。Latrunculin和诺考达唑对生产的影响,原始264.7巨噬细胞
没有生产的主要leishmanicidal过程由巨噬细胞,以及
利什曼虫 属了逃避机制干扰生产(
39 ]。确定生产的细胞骨架的影响没有通过巨噬细胞,破坏后亚硝酸盐测定f -肌动蛋白和微管相互作用前后寄生虫(图
2 )。控制M1巨噬细胞的存在
原虫 提升一个小增加(大约20%)没有(图的水平
2(一个) M1)相比,感染巨噬细胞(图
2 (b) )。没有生产的寄生虫latrunculin治疗后下降了36.86%。诺考达唑治疗了相反的效果,因为没有生产水平(图增加了36.17%
2(一个) )。
latrunculin和诺考达唑对生产的影响没有通过原始264.7巨噬细胞相互作用
l .取代巴西橡胶树 。没有推断水平的亚硝酸盐水平测量各种治疗后在媒体上。贴壁巨噬细胞被激活(黑条)17 h有限合伙人(100 ng / mL) +干扰素-
γ (1
μ
克/毫升)或仍未处理(开放酒吧)。测量没有在(a)与寄生虫相互作用后,巨噬细胞治疗latrunculin (5
μ
米)或诺考达唑(5
μ
米)10分钟,然后暴露于promastigotes 30分钟。在缺乏寄生虫(b),激活和未激活的巨噬细胞附着latrunculin处理(5
μ
米)或诺考达唑(5
μ
米)10分钟。酒吧代表平均值±标准的错误意味着(SEM)至少有三个独立的实验一式三份。
P
*
≤
0.05
相比控制激活巨噬细胞(a)和比较控制灭活巨噬细胞(b);
P
∇
≤
0.05
相对于控制未激活的巨噬细胞;
◆
P
≤
0.05
而控制激活巨噬细胞。
(一)
![]()
(b)
![]()
细胞骨架破坏的影响依赖于巨噬细胞的激活状态除了寄生虫的存在。没有生产在未激活的巨噬细胞显著增加了latrunculin治疗(390%),达到相同的水平,M1巨噬细胞产生的。相反,latrunculin治疗在激活细胞生产降低了70%。诺考达唑在非活性细胞没有影响,而在M1巨噬细胞,这种物质抑制生产75%(图
2 (b) )。
3.3。Latrunculin和诺考达唑对生产的影响il - 10和TNF -α<斜体> < /斜体>原始264.7巨噬细胞细胞因子
细胞因子调制是另一个巨噬细胞反应激活或掩饰的病原体。在这部作品中,释放il - 10和TNF -的影响
α 细胞骨架和交互的寄生虫是评估。我们观察到M1巨噬细胞释放的抑制il - 10,和交互
原虫 推动进一步降低il - 10版本(数字
3(一个) 和
3 (b) )。治疗期间latrunculin寄生虫相互作用与M1巨噬细胞il - 10的释放减少了79.17%。诺考达唑治疗有更大的影响和废除释放il - 10。也观察到类似的结果非活性的巨噬细胞在缺乏寄生虫相互作用(图
3 (b) )。Latrunculin和诺考达唑能够减少由非活性的巨噬细胞释放il - 10 84.5%和83%,分别。未发现显著变化的M1巨噬细胞无毒性。
latrunculin和诺考达唑对细胞因子的影响生产生264.7巨噬细胞。水平的il - 10 (a和b)和肿瘤坏死因子-
α (c和d)测量各种治疗后在媒体上。贴壁巨噬细胞治疗与有限合伙人(100 ng / mL) +干扰素-
γ (1
μ
g / mL) 17 h latrunculin治疗前(5
μ
米)或诺考达唑(5
μ
米)1 h,然后暴露于promastigotes 30分钟(a和c)。巨噬细胞附着不暴露于寄生虫孵化17 h在没有或有限合伙人的存在(100 ng / mL) +干扰素-
γ (1
μ
g / mL),然后接受latrunculin (5
μ
米)或诺考达唑(5
μ
米)1 h (b和d)。酒吧代表平均值±标准的错误意味着(SEM)至少有三个独立的实验一式三份。
P
*
≤
0.05
相比控制相比,感染巨噬细胞(a)和非活性和未受感染的巨噬细胞;
P
∇
≤
0.05
相比,控制非活性和未受感染的巨噬细胞;
◆
P
≤
0.05
而控制激活未受感染的巨噬细胞。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
诺考达唑和latrunculin治疗对肿瘤坏死因子的释放,没有效果
α M1感染巨噬细胞(图
3 (c) (图)或由感染和非活性细胞
3 (d) )。然而,治疗latrunculin促进了抑制TNF -
α 释放82.3%的M1巨噬细胞无毒性(图
3 (d) )。
3.4。Latrunculin和诺考达唑原料264.7巨噬细胞中肌动蛋白组织Parasite-Host交互
观察到的变化关联索引,没有生产,细胞因子生产促使我们评估巨噬细胞形态学变化。肌动蛋白细胞骨架染色在互动后巨噬细胞
原虫 (图
4 )。没有药物治疗控制巨噬细胞,观察高度组织化的f -肌动蛋白,杰出的染色细胞和大量的外围filopodial结构的实例。(图的代表形象
4(一) ),性寄生虫可以观察到橙色,红色和绿色染色叠加的结果,显示colocalisation肌动蛋白细胞骨架和寄生虫,证实肌动蛋白的参与在这个过程显示。在缺乏导致的肌动蛋白丝latrunculin治疗(图
4 (b) ),观察巨噬细胞更圆形的和缺乏filopodial结构。没有细胞性寄生虫;相反,寄生虫可以观察到,在绿色,附着在巨噬细胞或细胞外环境的自由。诺考达唑治疗有着深刻影响干扰微管在细胞组织巨噬细胞。彩色f -肌动蛋白的组织是随机的,没有突出的结构细胞的外围,没有丝状伪足的存在。类似于巨噬细胞latrunculin对待,没有细胞性寄生虫,可以观察到在绿色巨噬细胞。某些寄生虫似乎semi-internalised(图
4 (c) )。
细胞骨架的完整性影响之间的相互作用
原虫 和巨噬细胞。附着生264.7巨噬细胞培养与新鲜DMEM (a) 10分钟,(b) 5
μ
M latrunculin破坏肌动蛋白丝,或(c) 5
μ
米诺考达唑干扰微管在曝光之前30分钟寄生虫,先前使用CFSE标记。面板是代表colour-combined荧光图像显示寄生虫在绿色和f -肌动蛋白(phalloidin染色)红色。比例尺条指示所有面板63 x放大成像。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
3.5。巨噬细胞的转染eGFP-DB(肌凝蛋白Va尾巴)
因为依赖高一个完整的细胞骨架的动态特性和寄生虫/巨噬细胞的相互作用,分子马达宿主细胞被认为是潜在的重要因素。肌凝蛋白Va是第一个候选人考虑由于其广泛的表达和多样化的功能,包括参与吞噬体运动。使用一个抗体MVa,我们观察到的这种蛋白质的存在在巨噬细胞和肌凝蛋白的colocalisation寄生虫。性寄生虫可以观察到橙色,红色和绿色染色叠加的结果(图
5(一个) )。弗吉尼亚州评估肌凝蛋白的作用,构造组成的肌凝蛋白Va尾巴(大脑同种型)融合eGFP转染成巨噬细胞在寄生虫补充道。有一个突然减少关联指数和转染巨噬细胞之间
原虫 promastigotes(图
5 (b) )。mock-transfected巨噬细胞没有干扰寄生虫相互作用,和几个promastigotes可以观察到或内化这些细胞(图
5 (c) )。该协会指数的野生型巨噬细胞
53.25
±
4.49
与模拟巨噬细胞
42.42
±
3.91
,而在转染巨噬细胞,这个指数
2.96
±
0.94
(数据没有显示)。
掩饰的
原虫 弗吉尼亚州弗吉尼亚州需要肌凝蛋白肌凝蛋白的作用是检查通过观察内源性肌凝蛋白Va与寄生虫的分布和表达的影响占主导地位的消极尾巴域eGFP融合。附着生264.7巨噬细胞孵化与荧光标记的寄生虫在固定前30分钟,准备和共焦显微镜成像。弗吉尼亚州(一个)显示内源性肌凝蛋白抗体染色的(绿色)和寄生虫(红色)。(b)显示肌凝蛋白Va尾巴(绿色)和寄生虫(红色)。(c)显示了阶段mock-transfected巨噬细胞显微荧光图像的叠加寄生虫(红色)。比例尺条指示所有面板63 x放大成像。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
4所示。讨论
建立一个
原虫 感染人类,和利什曼病的开始,开始吸收巨噬细胞寄生虫的招募白蛉叮咬的网站(
40 ]。作为一个专业的吞噬细胞,巨噬细胞在免疫反应中起着重要的作用对外国材料,包括病原体。通常情况下,巨噬细胞吞噬作用的启动一个破坏性的过程破坏了性微生物,主要是通过没有生产
41 ]。然而,
利什曼虫 已经进化机制来抵消巨噬细胞的正常流程,允许它在细胞内生存和有效地避免免疫系统,从而传播感染(
39 ]。理解宿主细胞内的通路所调制的寄生虫有重大影响,对抗感染的后果。
考虑吞噬作用的重要性,本研究关注底层细胞骨架的需求,特别是f -肌动蛋白和微管。肌动蛋白微丝、中间纤维和真核细胞的微管是细胞骨架主要组件。细胞骨架是一个高度动态和响应结构由几个蛋白质参与各种各样的活动,比如信号转导(
42 ),细胞增殖,细胞迁移(
29日 ),吞噬作用和ROI,没有和细胞因子的生产
43 ,
44 ]。我们最初的实验侧重于细胞骨架的作用和分子运动肌凝蛋白Va寄生虫和巨噬细胞之间的相互作用。研究表明最初的肌动蛋白聚合的重要性的入侵宿主细胞通过吞噬作用
45 - - - - - -
47 )和细胞骨架和运动蛋白之间的相互作用的重要性,如肌凝蛋白V (
48 ]。
Latrunculin一个被选为depolymerise肌动蛋白丝,因为它快速、可逆的有效能力调节肌动蛋白的组织贴壁细胞(
25 ,
49 ,
50 ]。在非活性的巨噬细胞,协会指数f -肌动蛋白的减少(图后显著降低
1 )。该指数在M1激活巨噬细胞也减少。尽管latrunculin扰乱了肌动蛋白细胞骨架,在这项工作中使用的浓度,一些肌动蛋白丝仍然存在(
51 ),这就可以解释剩余掩饰的
利什曼虫 。绝对指数更大的比非活性的巨噬细胞激活巨噬细胞,但参与的还原率几乎是相等的。观察到的高指数激活巨噬细胞吞噬作用的增加可以解释,由有限合伙人和干扰素-提升
γ 治疗(
52 ]。尽管激活巨噬细胞杀死寄生虫的能力,实验的时间(30分钟)观察任何长期影响是不够的。
微管组织是通过治疗中断诺考达唑(
53 ,
54 ]。诺考达唑促进高抑制寄生虫相互作用与M1和非活性的巨噬细胞,由协会指数来衡量。M1巨噬细胞的效果更加明显。这是在协议与干扰素的治疗——先前的观察结果
γ 激活原始与诺考达唑促进巨噬细胞吞噬指数的抑制(40%)
55 ]。诺考达唑以前观察到抑制40%的感染肠道上皮细胞(INT407)
肠杆菌属坂 (
56 ]。这种低范围的抑制残余parasite-macrophage协会可以解释观察到诺考达唑的存在。此外,诺考达唑结果表明,掩饰的第一步
利什曼虫 的巨噬细胞与微管和肌动蛋白丝比有关。
长期以来观察到巨噬细胞的治疗与microfilament-inhibiting药物如细胞松弛素D促进大幅下降
利什曼虫 寄生虫绑定。寄生虫附着在巨噬细胞的数量和被感染的巨噬细胞的比例减少巨噬细胞治疗10时
μ
克/毫升的这种物质(
57 ]。基于研究用细胞松弛素,寄生虫附件的离解随后进入宿主细胞自1970年代以来已报道在一些寄生原生动物,包括
利什曼虫 (
58 ),
锥虫属 (
59 ),而
弓形虫 (
60 ]。
除了吞噬作用的干扰,这些化合物的可能性影响其他microbiocidal巨噬细胞事件进行了测试。在这个工作中,latrunculin被证明能增加非活性的生产和未受感染的巨噬细胞在相同的程度上作为有限合伙人和干扰素-
γ 激活(
44 ,
61年 ,
62年 ]。肌动蛋白的单体的形式(G-actin)促进刺激以挪士(内皮NO合酶)(
63年 ]。在内皮细胞中,没有发现生产细胞弹性的变化直接相关的肌动蛋白细胞骨架重组(
64年 ]。细胞弹性的增加发生在肌动蛋白聚合生成伴随着下降没有生产,而解聚和,因此,增加G-actin促进生产的增加(
65年 ]。
虽然没有生产巨噬细胞主要是伴随着伊诺(诱导NO合酶)的活动,这是引起微生物的产品如有限合伙人和各种炎性细胞因子(
66年 ),264.7生老鼠巨噬细胞已被证明持续表达以挪士,和LPS-stimulation增加的活动以挪士通过细胞内钙的变化2 + 水平(
67年 ]。因为与肌动蛋白单体latrunculin associates,防止G-actin聚合(
68年 )的积累G-actin可能的关键机制,导致观察到的非活性的变化,未受感染的巨噬细胞。然而,在激活,被感染的巨噬细胞,latrunculin提升生产的抑制。同样,激活巨噬细胞治疗latrunculin或细胞松弛素(另一个物质扰乱了肌动蛋白细胞骨架)表现出减少生产(
69年 ]。相比之下,诺考达唑促进生产的增加没有被感染的巨噬细胞M1但抑制生产未感染巨噬细胞(无论激活状态)。肺动脉细胞(PAECs)处理诺考达唑没有表现出减少生产,但确切的机制仍然未知
53 ]。
正如已经讨论的,古典巨噬细胞激活导致细胞(M1)能产生高水平的肿瘤坏死因子(TNF)、活性氧中间体(roi),和伊诺表达式。这是由干扰素-激活
γ
触发,炎性反应导致M1巨噬细胞的发展。在感染的细胞内原生动物寄生虫等
利什曼虫 ,
锥虫属 ,
弓形虫, 和
疟原虫 控制寄生虫血症,这些细胞是必要的,尤其是在急性期的寄生虫病
70年 - - - - - -
72年 ]。然而,根据参数如宿主基因型,寄生虫毒性,感染和舞台,主持人也可以产生抗炎细胞因子(Th2)。这些细胞因子(il - 4和IL-13)抵销M1巨噬细胞,抑制没有生产由精氨酸伊诺,引起另一个代谢途径精氨酸酶arginase-1加快。这是巨噬细胞激活的替代途径,其中包括2型反应,部分重叠的表型,包括分泌il - 10。因此,这些或者激活巨噬细胞一般称为M2或麦(
10 ,
73年 ,
74年 ]。
Latrunculin和诺考达唑被观察到抑制il - 10在M1感染巨噬细胞分泌,在未感染和非活性的巨噬细胞。没有明显的变化以M1巨噬细胞无毒性。肿瘤坏死因子-
α M1感染巨噬细胞分泌的不影响治疗,只有latrunculin能够抑制肿瘤坏死因子-
α 分泌的M1巨噬细胞无毒性。因为肌动蛋白和微管参与细胞极性的建立和指导的分泌细胞因子和细胞溶解的颗粒
74年 ),数据显示,干扰细胞骨架主要负责细胞因子分泌的抑制作用。
另一种可能是抑制细胞因子的生产。秋水仙碱,一种药物,也能促进微管解聚,观察引起强烈的积累减少LPS-induced TNF -
α 信使rna。这个事件表明pretranslational效应可能代表秋水仙碱的主要机制降低TNF -
α 生产(
75年 ]。同样,latrunculin和诺考达唑可能影响这些细胞因子的信使rna,特别是考虑到在mRNA本地化(细胞骨架的作用
76年 ,
77年 ]。
此外,破坏微管可与细胞因子信号转导有关。通常toll样受体参与识别后的促炎细胞因子的生产几个pathogen-derived组件。这些受体激活守恒MyD88途径,引发了转录因子NF
κ
B和AP-1,生产要素的炎性细胞因子(
78年 ]。在树突细胞TLR2和TLR4在细胞表面不存在。他们与tubovesicular结构接近高尔基氏复合体和colocalise微管。这表明TLR-decorated囊泡沿着这些结构。支持这个,微管解聚的网络被证明破坏TLR2和TLR4的细胞内分布,抑制白介素和肿瘤坏死因子的生产
α 为了应对
脑膜炎奈瑟氏菌 。然而,吞噬作用不受影响
79年 ]。
肌凝蛋白V马达蛋白负责货物运输和互动不仅与肌动蛋白丝,还和几个细胞骨架的其他组件,包括微管、驱动蛋白和中间丝
48 ]。研究利用RNA干扰、基因缺失和显性负肌凝蛋白的表达尾结构被用来评估这种蛋白质的作用汽车运输的细胞器。这些研究显示速度下降或完全堵塞的货物运输依赖于弗吉尼亚州肌凝蛋白(
80年 - - - - - -
82年 ]。肌凝蛋白Va似乎参与吞噬体运输,而其他肌凝蛋白类似乎参与吞噬体形成(
24 ,
83年 ,
84年 ]。荒木(
83年 弗吉尼亚州]表明,肌球蛋白结合吞噬体和f -肌动蛋白,限制时间的运动。
弗吉尼亚州,肌凝蛋白的存在在巨噬细胞被证实,并观察colocalisation肌凝蛋白Va和之间
原虫 (图
5(一个) )。弗吉尼亚州描述肌凝蛋白的参与
原虫 弗吉尼亚州,巨噬细胞转染和肌凝蛋白尾巴构造生成一个显性负效果由肌动蛋白丝分离肌凝蛋白Va货物运输,从而干扰。如图
5 (b) 弗吉尼亚州,肌凝蛋白的存在减少巨噬细胞之间的联系和尾巴
原虫 。这一结果表明,肌凝蛋白Va在协会中发挥作用
原虫 巨噬细胞。
巨噬细胞功能的两个重要方面,可以通过破坏细胞骨架和肌凝蛋白影响Va函数吞噬体和受体回收活动。最近,肌动蛋白和微管被证明有一个重要的角色在回收的吞噬体(
85年 ]。在其他类型的细胞,肌凝蛋白Va已被证明有助于膜回收和胞外分泌[
86年 ,
87年 ]。考虑回收的重要性的甘露糖/岩藻糖受体(生产商)摄入的质膜及其作用
l . donovani (
88年 ),减少
原虫 协会在弗吉尼亚州显性负肌凝蛋白的观察巨噬细胞可能是由于缺乏或减少巨噬细胞上的重要受体如生产商膜。进一步的调查是必要的描述肌凝蛋白Va的协会的作用
原虫 巨噬细胞。
总的来说,数据清楚地表明f -肌动蛋白的重要性,微管和肌凝蛋白Va在巨噬细胞之间的相互作用
原虫。 此外,生产的变化的观察不,il - 10, TNF -
α 表明调制的细胞骨架可能的机制
原虫 为了克服巨噬细胞的自然反应,建立感染。