疟疾发病率在沙巴的内部部门,马来西亚婆罗洲,基于嵌套PCR

文摘

介绍。疟疾是目前最流行的parasite-transmitted属的由寄生虫引起的疾病疟原虫。人类疟疾寄生虫尤其是误认诺氏疟原虫基于显微镜检查是很常见的。本文的目标精确识别人类疟疾寄生虫的发病率在沙巴的内部部门,马来西亚婆罗洲,基于小亚基核糖体RNA (ssrRNA),来确定人类疟疾寄生虫的误认率。方法。嵌套PCR用于检测人类疟疾寄生虫的存在。总共有243血现货样本病人要求为疟原虫血涂片(BFMP)分析被用于这项研究。结果。嵌套PCR结果显示没有三日疟原虫感染而普遍的疟疾寄生虫是最高的诺氏疟原虫,紧随其后的是间日疟原虫,恶性疟原虫,混合感染。只有69.5%的243个样本给嵌套PCR和微观结果一致。结论。初步调查结果显示,从分子检测疟疾诺氏疟原虫是最普遍的疟原虫物种在沙巴的内部部门。本文的结果可能会提供一个清晰的实际传输不同疟原虫物种在这个地区。

1。介绍

疟疾是一种热带属的由寄生虫引起的疾病疟原虫。大约2.5亿名疟疾造成的疟疾病例和一百万人死亡报告在世界各地,特别是在欠发达和偏远地区1]。在大多数东南亚国家,疟疾仍然是一个严重威胁公众健康(2]。此外,这种疾病是最常见的媒介传播的寄生虫病在偏远地区的马来西亚3]。

四个疟原虫寄生虫,即恶性疟原虫,间日疟原虫,p .疟疾,和p .那,是全球公认的导致疟疾。最近,诺氏疟原虫被公认为是“第五人类疟疾物种”后发现人类在马来西亚婆罗洲(4]。从那时起,自然获得诺氏疟原虫感染被发现在马来西亚婆罗洲和彭亨马来西亚西部[5]。

常规显微镜检查被认为是诊断的“金标准”疟原虫寄生虫感染由于其简单、快速和成本效益的特征(6]。然而,这种方法很容易误诊病例的混合感染和低级寄生虫血症(7]。本研究的目的是要准确地识别人类的疟疾寄生虫并确定数量的误认疟原虫寄生虫在沙巴的内政部门使用分子技术。的存在疟原虫患者样本中的物种寄生虫prediagnosed用微观方法受到使用嵌套PCR检测。放大进行了使用属和种特异的引物针对小亚基核糖体RNA基因(ssrRNA)的寄生虫。这pcr分析已成功地用于检测疟原虫物种的低级寄生虫血症和准确诊断(8]。

2。材料和方法

2.1。研究地点

沙巴的占地面积76114 .92公里²和位于马来西亚婆罗洲北部。样本收集从Keningau Tambunan Tenom,和内部分工Nabawan沙巴丘陵,包围森林边缘,克罗克范围(图1)。研究地点覆盖着中小学丛林、栖息地适合自然宿主诺氏疟原虫如长,当猕猴和向量(按蚊leucosphyrus群蚊子)[9]。

2.2。样品收集

道德伦理委员会的间隙得到卫生部马来西亚和马来西亚沙巴大学的伦理委员会(口头语)进行学习和收集血液样本。此外,病人的血液样本采集前得到了同意。血液样本收集从2010年2月至11月在医院的病人Keningau, Tenom, Tambunan, Klinik Kesihatan Nabawan。目标群体是那些被怀疑感染了疟疾和要求对疟原虫血涂片(BFMP)。样本集合是由合格的医学实验室工作人员各自的医院。3点25的总量μL的血液被发现在色谱文件(绘画纸3毫米)和干。

健康人的血液样本,没有疟疾感染的历史被用作负控制在这个研究。

受感染的血液样本和引起感染的寄生虫记录基于医学实验室人员的日常诊断报告准备各自的医院。的存在疟原虫物种Giemsa-stained thin-blood电影确定了显微镜下的合格医学实验室工作人员。

2.3。基因组DNA的提取

基因组DNA的提取干血滴在滤纸上进行使用InstaGene矩阵(美国Bio-Rad实验室,Inc . CA)方法描述(10]。一个负面的控制包括在每一批的提取,以确保没有污染发生在DNA提取。提取的DNA保存在−20°C到进一步使用。

2.4。嵌套PCR检测疟疾寄生虫

的识别疟原虫物种进行使用疟原虫属和种特异的PCR基础上小亚基核糖体RNA (ssrRNA)基因如前所述11]。对于每一个PCR反应,积极控制疟原虫物种和消极的控制中。

巢1疟原虫在50 genus-specific进行PCR扩增μL反应混合物包含1 X Promega GoTaq福莱希缓冲区,MgCl 3毫米₂,0.2毫米deoxynucleoside三磷酸(核苷酸),0.25μ每个引物(rPLU1和rPLU5)的M, 1.25单位TaqDNA聚合酶(Promega公司(美国),15μL基因组DNA模板,最终成交量调整到50μ用分子级水L。自行车巢1 PCR扩增条件疟原虫ssrRNA是如下;最初在94°C变性4分钟,30个周期为30秒94°C的变性,退火55°C 1分钟,在65°C和扩展1分30秒,紧随其后的是最终在65°C扩展了5分钟。

两个μL的巢1放大产品是用作巢2中的模板DNA PCR扩增。成分和巢2引物浓度相似MgCl巢1除了2毫米₂和0.5单位的TaqDNA聚合酶。巢2放大条件类似于巢1除了58°C的退火温度genus-specific引物(rPLU3和rPLU4)和62°C种特异的引物(rFAL1 / rFAL2 rVIV1 / rVIV2 rMAL1 / rMAL2 pmk8 / pmk9和rOVA1 / rOVA4) (11]。

巢2 PCR扩增产物进行了分析通过在2.7%琼脂糖凝胶电泳凝胶和可视化与溴化乙锭染色(4μg / mL)和紫外线透照。

3所示。结果

3.1。研究人群

总共243份血液样本被收集在一段时间的六个月。样本的贡献主要是由男性患者(74.5%)和最多的样本收集从11日至20日岁年龄组的患者由62(25.5%)样品。在四个研究地点,Tambunan最高病例(87例)而在Tenom只报告了45例。

3.2。普遍存在的疟原虫物种被显微镜检查

总数的243个样本,83(34.2%)样本疟原虫阳性,其余样本-基于显微镜发现的疟疾寄生虫。这些都是构成了39malariae样品(16.1%),25 (10.3%)间日疟原虫样本,17例(7%)恶性疟原虫样品,和三个(1.2%)和样品混合感染(恶性疟原虫和三日疟原虫)。没有p .那和诺氏疟原虫疟疾从显微镜检查报告。

基于微观发现,Keningau发病率最高恶性疟原虫(13例),其次是来自Nabawan 4例。的发病率三日疟原虫与28个样本Tenom最高,其次为七Keningau和四个病例的样本从Tambunan报道。此外,的发生率间日疟原虫在Keningau最高,13吗间日疟原虫样本检测显微镜下。其次是9间日疟原虫从Tenom情况下,两个间日疟原虫从Nabawan情况下,一个间日疟原虫从Tambunan感染。此外,三种混合感染恶性疟原虫和三日疟原虫病例报道从Tenom(图2)。

3.3。嵌套PCR检测疟疾寄生虫

总共有107个样本阳性疟原虫属genus-specific嵌套PCR。六十三(63)的样品被感染诺氏疟原虫虽然20被感染的血液样本间日疟原虫和恶性疟原虫每一个。此外,四个样品混合感染(两个恶性疟原虫/间日疟原虫,一个恶性疟原虫/诺氏疟原虫,和一个间日疟原虫/诺氏疟原虫)也被发现在这项研究中。没有三日疟原虫或p .那使用特有的嵌套PCR检测(图3)。

更高的患病率疟原虫物种被嵌套PCR检测显微镜检查。如表所示1总共23负样本微观发现被发现是阳性疟原虫物种嵌套PCR检测。此外,一个显微镜下P.vivax正样本发现负疟原虫物种嵌套PCR。

3.4。根据地理位置分布的疟疾病例

我们的研究表明,不同的发病率疟原虫物种并不是均匀地分布在内政部门沙巴的地理区域。嵌套PCR显示最高恶性疟原虫感染被报道从Keningau(13例),其次是Nabawan 6例,并从Tambunan 1例。发病率最高的间日疟原虫在Tenom(10例),其次是Keningau 9例,和一个从Tambunan感染。嵌套PCR已经成功地检测到间日疟原虫感染从显微镜下负样本Tenom而九个样品一致的结果与微观发现。此外,一个间日疟原虫从显微镜下检测负样本Keningau的八间日疟原虫样品显示微观和PCR结果的一致性。只有一个间日疟原虫案例报告Tambunan基于显微镜检查和PCR检测。此外,嵌套PCR结果显示诺氏疟原虫感染被发现在所有的四个研究地点。Tenom最高诺氏疟原虫(35例)感染,其次是Tambunan 12例,Keningau 10例,6例在Nabawan(图4)。

3.5。的比较疟原虫种基于显微镜检查和嵌套PCR检测

有更积极的样本(107)疟原虫物种被嵌套PCR相比显微镜检查(84)。23显微镜下负样本显示的积极性疟原虫物种被嵌套PCR表示。种特异的嵌套PCR显示五个微观负样本检测恶性疟原虫。此外,两个间日疟原虫样品被显微镜检查误判为负。此外,还有16个微观负样本检测单诺氏疟原虫通过嵌套PCR感染。此外,40三日疟原虫显微镜检查感染的检测诺氏疟原虫通过嵌套PCR。此外,三个样品混合感染的报道恶性疟原虫和三日疟原虫通过显微镜检查确认为单身诺氏疟原虫通过嵌套PCR。然而,嵌套PCR也足够灵敏检测混合感染(间日疟原虫/恶性疟原虫,间日疟原虫/诺氏疟原虫,和恶性疟原虫/诺氏疟原虫)在四个样本报告为单一感染间日疟原虫或恶性疟原虫显微镜下。然而,也有一个假的间日疟原虫正样本显微镜检查显示负所有人类疟原虫的嵌套PCR(表2)。

4所示。讨论

四个样品收集在这个研究领域;Keningau、Nabawan Tambunan, Tenom位于沙巴的内部部门,周围被克罗克范围和森林,合适的栖息地疟疾病媒和主机。主要的热带雨林也支持非人类灵长类动物的人口,这是主人疟原虫寄生虫。

嵌套PCR用于检测疟疾寄生虫和五个人类的识别疟原虫在这项研究的物种。嵌套PCR在检测是有用的ssrRNA人类基因序列疟原虫物种之间的序列的独特性疟原虫物种(12]。嵌套PCR扩增的效率,获得的产品的数量不能改变寄生虫DNA在原样品的范围11,13]。

根据健康的马来西亚,部间日疟原虫是最常见的人类疟原虫在马来西亚(马来西亚国家更新,2010)。然而,我们的研究表明,最普遍疟原虫物种内部分裂诺氏疟原虫,紧随其后的是恶性疟原虫和间日疟原虫。没有三日疟原虫感染检测尽管的存在三日疟原虫积极通过显微镜检查样品(16%)。

所有感染诊断为三日疟原虫通过显微镜检查被发现诺氏疟原虫或nonmalaria疟原虫物种嵌套PCR。疟原虫诺氏疟原虫感染人类并不是新的,但它有可能被误诊三日疟原虫或恶性疟原虫使用传统的微观方法。这发生在很长一段时间内由于相似的形态特征诺氏疟原虫寄生虫与恶性疟原虫在早期的营养体和阶段三日疟原虫在红细胞的周期的后期14,15]。此外,最近还发现大量的报道诺氏疟原虫感染在沙捞越,马来西亚婆罗洲(16)和缅甸等东南亚其他地区(17),泰国(18)、菲律宾(19)和新加坡(20.]。因此,的发生率诺氏疟原虫人类并不像以前所认为的那样罕见。几个原因假设关于主机的突然转变了诺氏疟原虫从长尾猕猴感染人类。人类干扰的大片自然传播网站诺氏疟原虫和栖息地的破坏的原因之一(21]。以前,人类宿主,已经占据的位置,由于缺乏机会阻止的诺氏疟原虫到人口(22,23]。所选研究地点的地理位置位于森林边缘可能解释的高发病率诺氏疟原虫在这个地区。

在整个研究期间,诺氏疟原虫感染主要是收集的样本中发现的四个研究地区。普遍存在的诺氏疟原虫感染的内部部门沙巴Tenom最高的地区,而其患病率Nabawan最低。此外,在四个研究地点,恶性疟原虫是最普遍的疟原虫在Keningau物种。先前的研究已经表明诺氏疟原虫感染已被发现在马来西亚婆罗洲(沙捞越和沙巴)和一种人畜共患病蒙面的寄生虫14,15]。我们的研究进一步证明了这一点诺氏疟原虫在沙巴的内政部门广泛分布。

在人类疟疾寄生虫的检测比较,嵌套PCR被发现比显微镜检测。通过使用嵌套PCR,更多疟原虫物种被发现比显微镜检查。PCR结果显示,24显微镜下负样本检测单一感染恶性疟原虫(5例),间日疟原虫(2例),17的样本诺氏疟原虫。循环血液寄生虫和寄生虫血症水平低的电影可能会导致检测失败疟原虫物种。此外,还有更高的诺氏疟原虫感染误诊为阴性疟原虫物种通过显微镜检查。以前的研究已经表明,multiple-infected红细胞从血液中只观察到一般电影寄生虫与寄生虫血症超过100000 /μL血(14,15]。相似、小型寄生虫的形态以及难以染色观察和检测的寄生虫也可能导致误诊(7]。

有四个混合感染(恶性疟原虫/诺氏疟原虫,恶性疟原虫/ P。间日疟原虫和间日疟原虫/ P。诺氏疟原虫单独的PCR)检测感染间日疟原虫,和恶性疟原虫样品通过显微镜。这可能是由于更高的寄生虫数量的一个物种的存在相对于其他导致失败检测显微镜检查的混合感染。间日疟原虫相比,数字可能会更高恶性疟原虫这导致失败检测吗恶性疟原虫通过显微镜检查间日疟原虫/恶性疟原虫积极的样本。

嵌套PCR的检测是必要的诺氏疟原虫(14,15]。没有诺氏疟原虫阳性病例检测到显微镜检查在本研究中由于难以区分的形态诺氏疟原虫从三日疟原虫。因此,建议与hyperparasitemia疟疾和寄生虫类似症状三日疟原虫镜下诊断为诺氏疟原虫在马来西亚2]。总之,误诊的疟原虫243(30.5%)的物种被发现在74年样本在这个研究。高速率的误认显示的检测疟原虫物种与显微镜检查不敏感和特定的与嵌套PCR相比。这是至关重要的准确诊断疟原虫物种对适当的治疗和疾病管理很重要。

这项研究强调了高的发病率诺氏疟原虫在沙巴的内政部门被嵌套PCR误诊为三日疟原虫使用传统的显微技术。pcr技术被发现更敏感和准确诊断疟疾的具体比显微镜检查。的大规模流行病学研究关注forest-fringe地区可以在未来确定的实际传播疟疾寄生虫诺氏疟原虫在沙巴。这一发现很重要,因为疟疾的有效控制和治疗,特别是高的发病率诺氏疟原虫一个潜在的致命的疟原虫寄生虫。

资金

这个项目得到了种子资金从生物技术研究所,马来西亚沙巴大学。

确认

作者感谢医院Keningau董事和其他医学实验室工作人员的医院,医院Tambunan医院Tenom和Nabawan健康诊所的援助在整个研究中,Rafidah阿里和Erle斯坦利·亨利样本采集。他们也感谢马来西亚和沙巴卫生部卫生部门批准这项研究进行的研究地点和疟疾研究中心提供疟原虫物种积极控制。

引用

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