JPR 寄生虫学研究期刊》的研究 2090 - 0031 2090 - 0023 Hindawi出版公司 104284年 10.1155 / 2011/104284 104284年 研究文章 疟疾发病率在沙巴的内部部门,马来西亚婆罗洲,基于嵌套PCR Joveen-Neoh 湾分 庄 Ka肺 黄 克莱门特迈克尔Vui凌 刘 Tiek应 Lanzer 迈克尔 生物技术研究所 马来西亚沙巴大学 道路口头语,88400哥打基纳巴卢山 沙巴 马来西亚 ums.edu.my 2011年 13 10 2011年 2011年 16 06 2011年 09年 08年 2011年 2011年 版权©2011 Wan沼泽Joveen-Neoh et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

介绍。疟疾是目前最流行的parasite-transmitted属的由寄生虫引起的疾病 疟原虫。人类疟疾寄生虫尤其是误认 诺氏疟原虫基于显微镜检查是很常见的。本文的目标精确识别人类疟疾寄生虫的发病率在沙巴的内部部门,马来西亚婆罗洲,基于小亚基核糖体RNA ( ssrRNA),来确定人类疟疾寄生虫的误认率。 方法。嵌套PCR用于检测人类疟疾寄生虫的存在。总共有243血现货样本病人要求为疟原虫血涂片(BFMP)分析被用于这项研究。 结果。嵌套PCR结果显示没有 三日疟原虫感染而普遍的疟疾寄生虫是最高的 诺氏疟原虫,紧随其后的是 间日疟原虫, 恶性疟原虫,混合感染。只有69.5%的243个样本给嵌套PCR和微观结果一致。 结论。初步调查结果显示,从分子检测疟疾 诺氏疟原虫是最普遍的 疟原虫物种在沙巴的内部部门。本文的结果可能会提供一个清晰的实际传输不同 疟原虫物种在这个地区。

 1。介绍

疟疾是一种热带属的由寄生虫引起的疾病 疟原虫。大约2.5亿名疟疾造成的疟疾病例和一百万人死亡报告在世界各地,特别是在欠发达和偏远地区 1]。在大多数东南亚国家,疟疾仍然是一个严重威胁公众健康( 2]。此外,这种疾病是最常见的媒介传播的寄生虫病在偏远地区的马来西亚 3]。

四个 疟原虫寄生虫,即 恶性疟原虫, 间日疟原虫, p .疟疾,和 p .那,是全球公认的导致疟疾。最近, 诺氏疟原虫被公认为是“第五人类疟疾物种”后发现人类在马来西亚婆罗洲( 4]。从那时起,自然获得 诺氏疟原虫感染被发现在马来西亚婆罗洲和彭亨马来西亚西部[ 5]。

常规显微镜检查被认为是诊断的“金标准” 疟原虫寄生虫感染由于其简单、快速和成本效益的特征( 6]。然而,这种方法很容易误诊病例的混合感染和低级寄生虫血症( 7]。本研究的目的是要准确地识别人类的疟疾寄生虫并确定数量的误认 疟原虫寄生虫在沙巴的内政部门使用分子技术。的存在 疟原虫患者样本中的物种寄生虫prediagnosed用微观方法受到使用嵌套PCR检测。放大进行了使用属和种特异的引物针对小亚基核糖体RNA基因( ssrRNA)的寄生虫。这pcr分析已成功地用于检测疟原虫物种的低级寄生虫血症和准确诊断( 8]。

 2。材料和方法 2.1。研究地点

沙巴的占地面积76114 .92公里2和位于马来西亚婆罗洲北部。样本收集从Keningau Tambunan Tenom,和内部分工Nabawan沙巴丘陵,包围森林边缘,克罗克范围(图 1)。研究地点覆盖着中小学丛林、栖息地适合自然宿主 诺氏疟原虫如长,当猕猴和向量( 按蚊leucosphyrus群蚊子)[ 9]。

沙巴州的地图指示的位置研究网站在这个研究。

 2.2。样品收集

道德伦理委员会的间隙得到卫生部马来西亚和马来西亚沙巴大学的伦理委员会(口头语)进行学习和收集血液样本。此外,病人的血液样本采集前得到了同意。血液样本收集从2010年2月至11月在医院的病人Keningau, Tenom, Tambunan, Klinik Kesihatan Nabawan。目标群体是那些被怀疑感染了疟疾和要求对疟原虫血涂片(BFMP)。样本集合是由合格的医学实验室工作人员各自的医院。3点25的总量 μL的血液被发现在色谱文件(绘画纸3毫米)和干。

健康人的血液样本,没有疟疾感染的历史被用作负控制在这个研究。

受感染的血液样本和引起感染的寄生虫记录基于医学实验室人员的日常诊断报告准备各自的医院。的存在 疟原虫物种Giemsa-stained thin-blood电影确定了显微镜下的合格医学实验室工作人员。

 2.3。基因组DNA的提取

基因组DNA的提取干血滴在滤纸上进行使用InstaGene矩阵(美国Bio-Rad实验室,Inc . CA)方法描述( 10]。一个负面的控制包括在每一批的提取,以确保没有污染发生在DNA提取。提取的DNA保存在−20°C到进一步使用。

 2.4。嵌套PCR检测疟疾寄生虫

的识别 疟原虫物种进行使用 疟原虫属和种特异的PCR基础上小亚基核糖体RNA ( ssrRNA)基因如前所述 11]。对于每一个PCR反应,积极控制 疟原虫物种和消极的控制中。

巢1 疟原虫在50 genus-specific进行PCR扩增 μL反应混合物包含1 X Promega GoTaq福莱希缓冲区,MgCl 3毫米2,0.2毫米deoxynucleoside三磷酸(核苷酸),0.25 μ每个引物(rPLU1和rPLU5)的M, 1.25单位 TaqDNA聚合酶(Promega公司(美国),15 μL基因组DNA模板,最终成交量调整到50 μ用分子级水L。自行车巢1 PCR扩增条件 疟原虫ssrRNA是如下;最初在94°C变性4分钟,30个周期为30秒94°C的变性,退火55°C 1分钟,在65°C和扩展1分30秒,紧随其后的是最终在65°C扩展了5分钟。

两个 μL的巢1放大产品是用作巢2中的模板DNA PCR扩增。成分和巢2引物浓度相似MgCl巢1除了2毫米2和0.5单位的 TaqDNA聚合酶。巢2放大条件类似于巢1除了58°C的退火温度genus-specific引物(rPLU3和rPLU4)和62°C种特异的引物(rFAL1 / rFAL2 rVIV1 / rVIV2 rMAL1 / rMAL2 pmk8 / pmk9和rOVA1 / rOVA4) ( 11]。

巢2 PCR扩增产物进行了分析通过在2.7%琼脂糖凝胶电泳凝胶和可视化与溴化乙锭染色(4 μg / mL)和紫外线透照。

 3所示。结果 3.1。研究人群

总共243份血液样本被收集在一段时间的六个月。样本的贡献主要是由男性患者(74.5%)和最多的样本收集从11日至20日岁年龄组的患者由62(25.5%)样品。在四个研究地点,Tambunan最高病例(87例)而在Tenom只报告了45例。

 3.2。疟原虫流行<斜体> < /斜体>物种被显微镜检查

总数的243个样本,83(34.2%)样本疟原虫阳性,其余样本-基于显微镜发现的疟疾寄生虫。这些都是构成了39 malariae样品(16.1%),25 (10.3%) 间日疟原虫样本,17例(7%) 恶性疟原虫样品,和三个(1.2%)和样品混合感染( 恶性疟原虫和 三日疟原虫)。没有 p .那和 诺氏疟原虫疟疾从显微镜检查报告。

基于微观发现,Keningau发病率最高 恶性疟原虫(13例),其次是来自Nabawan 4例。的发病率 三日疟原虫与28个样本Tenom最高,其次为七Keningau和四个病例的样本从Tambunan报道。此外,的发生率 间日疟原虫在Keningau最高,13吗 间日疟原虫样本检测显微镜下。其次是9 间日疟原虫从Tenom情况下,两个 间日疟原虫从Nabawan情况下,一个 间日疟原虫从Tambunan感染。此外,三种混合感染 恶性疟原虫和 三日疟原虫病例报道从Tenom(图 2)。

的分布 疟原虫根据研究网站基于微观发现物种。图中的数字表示的病例数 疟原虫研究物种中每个站点。

 3.3。嵌套PCR检测疟疾寄生虫

总共有107个样本阳性 疟原虫属genus-specific嵌套PCR。六十三(63)的样品被感染 诺氏疟原虫虽然20被感染的血液样本 间日疟原虫和 恶性疟原虫每一个。此外,四个样品混合感染(两个 恶性疟原虫/ 间日疟原虫,一个 恶性疟原虫/ 诺氏疟原虫,和一个 间日疟原虫/ 诺氏疟原虫)也被发现在这项研究中。没有 三日疟原虫或 p .那使用特有的嵌套PCR检测(图 3)。

身份验证的 疟原虫物种在沙巴的内部部门。饼图中的数字表示阳性病例的数量。

更高的患病率 疟原虫物种被嵌套PCR检测显微镜检查。如表所示 1总共23负样本微观发现被发现是阳性 疟原虫物种嵌套PCR检测。此外,一个显微镜下 P.vivax正样本发现负 疟原虫物种嵌套PCR。

基于PCR检测疟原虫和显微镜检查。

的方法检测 积极的 负 总
显微镜 84年 159年 243年
嵌套PCR 107年 136年 243年
3.4。根据地理位置分布的疟疾病例

我们的研究表明,不同的发病率 疟原虫物种并不是均匀地分布在内政部门沙巴的地理区域。嵌套PCR显示最高 恶性疟原虫感染被报道从Keningau(13例),其次是Nabawan 6例,并从Tambunan 1例。发病率最高的 间日疟原虫在Tenom(10例),其次是Keningau 9例,和一个从Tambunan感染。嵌套PCR已经成功地检测到 间日疟原虫感染从显微镜下负样本Tenom而九个样品一致的结果与微观发现。此外,一个 间日疟原虫从显微镜下检测负样本Keningau的八 间日疟原虫样品显示微观和PCR结果的一致性。只有一个 间日疟原虫案例报告Tambunan基于显微镜检查和PCR检测。此外,嵌套PCR结果显示 诺氏疟原虫感染被发现在所有的四个研究地点。Tenom最高 诺氏疟原虫(35例)感染,其次是Tambunan 12例,Keningau 10例,6例在Nabawan(图 4)。

人类疟疾寄生虫分布在沙巴的内政部门基于嵌套PCR。图表中的数字表示数量的情况下检测到。

 3.5。疟原虫的比较<斜体> < /斜体>物种基于显微镜检查和嵌套PCR检测

有更积极的样本(107) 疟原虫物种被嵌套PCR相比显微镜检查(84)。23显微镜下负样本显示的积极性 疟原虫物种被嵌套PCR表示。种特异的嵌套PCR显示五个微观负样本检测 恶性疟原虫。此外,两个 间日疟原虫样品被显微镜检查误判为负。此外,还有16个微观负样本检测单 诺氏疟原虫通过嵌套PCR感染。此外,40 三日疟原虫显微镜检查感染的检测 诺氏疟原虫通过嵌套PCR。此外,三个样品混合感染的报道 恶性疟原虫和 三日疟原虫通过显微镜检查确认为单身 诺氏疟原虫通过嵌套PCR。然而,嵌套PCR也足够灵敏检测混合感染( 间日疟原虫/ 恶性疟原虫, 间日疟原虫/ 诺氏疟原虫,和 恶性疟原虫/ 诺氏疟原虫)在四个样本报告为单一感染 间日疟原虫或 恶性疟原虫显微镜下。然而,也有一个假的 间日疟原虫正样本显微镜检查显示负所有人类疟原虫的嵌套PCR(表 2)。

的比较 疟原虫物种由嵌套PCR检测和显微镜检查。

疟原虫物种 嵌套PCR 显微镜检查
恶性疟原虫 20. 17
间日疟原虫 20. 25
三日疟原虫 0 39
诺氏疟原虫 63年 0
恶性疟原虫/ P。malariae 0 3
恶性疟原虫/ P。间日疟原虫 2 0
恶性疟原虫/ P。诺氏疟原虫 1 0
诺氏疟原虫/ P。间日疟原虫 1 0
负 136年 159年
总积极的样品 243年 243年
4所示。讨论

四个样品收集在这个研究领域;Keningau、Nabawan Tambunan, Tenom位于沙巴的内部部门,周围被克罗克范围和森林,合适的栖息地疟疾病媒和主机。主要的热带雨林也支持非人类灵长类动物的人口,这是主人 疟原虫寄生虫。

嵌套PCR用于检测疟疾寄生虫和五个人类的识别 疟原虫在这项研究的物种。嵌套PCR在检测是有用的 ssrRNA人类基因序列 疟原虫物种之间的序列的独特性 疟原虫物种( 12]。嵌套PCR扩增的效率,获得的产品的数量不能改变寄生虫DNA在原样品的范围 11, 13]。

根据健康的马来西亚,部 间日疟原虫是最常见的人类疟原虫在马来西亚(马来西亚国家更新,2010)。然而,我们的研究表明,最普遍 疟原虫物种内部分裂 诺氏疟原虫,紧随其后的是 恶性疟原虫和 间日疟原虫。没有 三日疟原虫感染检测尽管的存在 三日疟原虫积极通过显微镜检查样品(16%)。

所有感染诊断为 三日疟原虫通过显微镜检查被发现 诺氏疟原虫或nonmalaria 疟原虫物种嵌套PCR。 疟原虫诺氏疟原虫感染人类并不是新的,但它有可能被误诊 三日疟原虫或 恶性疟原虫使用传统的微观方法。这发生在很长一段时间内由于相似的形态特征 诺氏疟原虫寄生虫与 恶性疟原虫在早期的营养体和阶段 三日疟原虫在红细胞的周期的后期 14, 15]。此外,最近还发现大量的报道 诺氏疟原虫感染在沙捞越,马来西亚婆罗洲( 16)和缅甸等东南亚其他地区( 17),泰国( 18)、菲律宾( 19)和新加坡( 20.]。因此,的发生率 诺氏疟原虫人类并不像以前所认为的那样罕见。几个原因假设关于主机的突然转变了 诺氏疟原虫从长尾猕猴感染人类。人类干扰的大片自然传播网站 诺氏疟原虫和栖息地的破坏的原因之一( 21]。以前,人类宿主,已经占据的位置,由于缺乏机会阻止的 诺氏疟原虫到人口( 22, 23]。所选研究地点的地理位置位于森林边缘可能解释的高发病率 诺氏疟原虫在这个地区。

在整个研究期间, 诺氏疟原虫感染主要是收集的样本中发现的四个研究地区。普遍存在的 诺氏疟原虫感染的内部部门沙巴Tenom最高的地区,而其患病率Nabawan最低。此外,在四个研究地点, 恶性疟原虫是最普遍的 疟原虫在Keningau物种。先前的研究已经表明 诺氏疟原虫感染已被发现在马来西亚婆罗洲(沙捞越和沙巴)和一种人畜共患病蒙面的寄生虫 14, 15]。我们的研究进一步证明了这一点 诺氏疟原虫在沙巴的内政部门广泛分布。

在人类疟疾寄生虫的检测比较,嵌套PCR被发现比显微镜检测。通过使用嵌套PCR,更多 疟原虫物种被发现比显微镜检查。PCR结果显示,24显微镜下负样本检测单一感染 恶性疟原虫(5例), 间日疟原虫(2例),17的样本 诺氏疟原虫。循环血液寄生虫和寄生虫血症水平低的电影可能会导致检测失败 疟原虫物种。此外,还有更高的 诺氏疟原虫感染误诊为阴性 疟原虫物种通过显微镜检查。以前的研究已经表明,multiple-infected红细胞从血液中只观察到一般电影寄生虫与寄生虫血症超过100000 / μL血( 14, 15]。相似、小型寄生虫的形态以及难以染色观察和检测的寄生虫也可能导致误诊( 7]。

有四个混合感染( 恶性疟原虫/ 诺氏疟原虫, 恶性疟原虫/ P。间日疟原虫和 间日疟原虫/ P。诺氏疟原虫单独的PCR)检测感染 间日疟原虫,和 恶性疟原虫样品通过显微镜。这可能是由于更高的寄生虫数量的一个物种的存在相对于其他导致失败检测显微镜检查的混合感染。 间日疟原虫相比,数字可能会更高 恶性疟原虫这导致失败检测吗 恶性疟原虫通过显微镜检查 间日疟原虫/ 恶性疟原虫积极的样本。

嵌套PCR的检测是必要的 诺氏疟原虫( 14, 15]。没有 诺氏疟原虫阳性病例检测到显微镜检查在本研究中由于难以区分的形态 诺氏疟原虫从 三日疟原虫。因此,建议与hyperparasitemia疟疾和寄生虫类似症状 三日疟原虫镜下诊断为 诺氏疟原虫在马来西亚 2]。总之,误诊的 疟原虫243(30.5%)的物种被发现在74年样本在这个研究。高速率的误认显示的检测 疟原虫物种与显微镜检查不敏感和特定的与嵌套PCR相比。这是至关重要的准确诊断 疟原虫物种对适当的治疗和疾病管理很重要。

这项研究强调了高的发病率 诺氏疟原虫在沙巴的内政部门被嵌套PCR误诊为 三日疟原虫使用传统的显微技术。pcr技术被发现更敏感和准确诊断疟疾的具体比显微镜检查。的大规模流行病学研究关注forest-fringe地区可以在未来确定的实际传播疟疾寄生虫 诺氏疟原虫在沙巴。这一发现很重要,因为疟疾的有效控制和治疗,特别是高的发病率 诺氏疟原虫一个潜在的致命的 疟原虫寄生虫。

 资金

这个项目得到了种子资金从生物技术研究所,马来西亚沙巴大学。

 确认

作者感谢医院Keningau董事和其他医学实验室工作人员的医院,医院Tambunan医院Tenom和Nabawan健康诊所的援助在整个研究中,Rafidah阿里和Erle斯坦利·亨利样本采集。他们也感谢马来西亚和沙巴卫生部卫生部门批准这项研究进行的研究地点和疟疾研究中心提供 疟原虫物种积极控制。

 谁 2009年世界疟疾报告》 2009年 世界卫生组织 Vythilingam 我。 陈 s T。 Shanmugratnam C。 Tanrang H。 Chooi k . H。 发展的影响和疟疾控制活动在其向量Kinabatangan地区的沙巴,东马来西亚 Acta Tropica 2005年 96年 1 24 30. 2 - s2.0 - 23944503362 10.1016 / j.actatropica.2005.06.022 辛格 B。 cox - singh J。 寄生虫在马来西亚引起问题:土壤传播寄生虫和疟疾寄生虫 寄生虫学的趋势 2001年 17 12 597年 600年 2 - s2.0 - 0035698006 10.1016 / s1471 - 4922 (01) 02148 - 1 白色的 n . J。 疟原虫诺氏疟原虫:第五人类疟疾寄生虫 临床感染疾病 2008年 46 2 172年 173年 2 - s2.0 - 39449099400 10.1086/524889 cox - singh J。 戴维斯 t·m·E。 李 k . S。 Shamsul s s G。 Matusop 一个。 Ratnam 年代。 拉赫曼 h·A。 康威 d . J。 辛格 B。 疟原虫诺氏疟原虫疟疾在人类广泛分布和潜在的生命危险 临床感染疾病 2008年 46 2 165年 171年 2 - s2.0 - 39449088243 10.1086/524888 辛格 B。 分子诊断方法和寄生虫感染的流行病学研究 国际寄生虫学杂志 1997年 27 10 1135年 1145年 2 - s2.0 - 0030772926 10.1016 / s0020 - 7519 (97) 00111 - 2 Genc 一个。 厄罗古鲁 F。 Koltas i S。 检测 间日疟原虫通过嵌套pcr和实时pcr 韩国寄生虫学杂志》 2010年 48 2 99年 103年 2 - s2.0 - 77954444440 10.3347 / kjp.2010.48.2.99 阿斯兰 G。 Seyrek 一个。 Kocagoz T。 Ulukanligil M。 Erguven 年代。 Gunalp 一个。 疟疾的诊断和识别 疟原虫物种通过聚合酶链反应在土耳其 寄生虫学国际 2007年 56 3 217年 220年 2 - s2.0 - 34250769583 10.1016 / j.parint.2007.03.001 Garnham p C . C。 疟疾寄生虫和其他Haemosporidia 1966年 牛津大学,英国 布莱克韦尔科学出版物 cox - singh J。 Mahayet 年代。 阿卜杜拉 m . S。 辛格 B。 疟疾检测灵敏度提高了嵌套式聚合酶链反应和DNA提取使用简单的抽样 国际寄生虫学杂志 1997年 27 12 1575年 1577年 2 - s2.0 - 0031470967 10.1016 / s0020 - 7519 (97) 00147 - 1 Snounou G。 Viriyakosol 年代。 朱 x P。 Jarra W。 ibsen Pinheiro l 做罗萨里奥 诉E。 Thaithong 年代。 布朗 k . N。 高灵敏度的检测人类疟疾寄生虫通过使用嵌套的聚合酶链反应 分子和生化寄生虫学 1993年 61年 2 315年 320年 2 - s2.0 - 0027420335 10.1016 / 0166 - 6851 (93)90077 - b Snounou G。 辛格 B。 嵌套PCR分析 疟原虫寄生虫 方法在分子医学 2002年 72年 189年 203年 2 - s2.0 - 0036044961 黑色的 J。 霍梅尔 M。 Snounou G。 花生米 M。 混合infetions与 恶性疟原虫和 三日疟原虫在疟疾和发烧 《柳叶刀》 1994年 343年 8905年 1095年 2 - s2.0 - 0028782537 李 k . S。 cox - singh J。 辛格 B。 形态特征和微分项 疟原虫诺氏疟原虫寄生虫在自然获得人类感染 《疟疾杂志》上 2009年 8 1,第73条 2 - s2.0 - 65149103017 10.1186 / 1475-2875-8-73 李 k . S。 cox - singh J。 布鲁克 G。 Matusop 一个。 辛格 B。 疟原虫诺氏疟原虫从血液档案电影:进一步证明,人类感染是广泛分布的,而不是在马来西亚婆罗洲新涌现 国际寄生虫学杂志 2009年 39 10 1125年 1128年 2 - s2.0 - 67649781748 10.1016 / j.ijpara.2009.03.003 辛格 B。 唱 l·K。 Matusop 一个。 Radhakrishnan 一个。 Shamsul s s G。 cox - singh J。 托马斯。 一个。 康威 d . J。 一大焦点自然获得 疟原虫诺氏疟原虫感染人类 《柳叶刀》 2004年 363年 9414年 1017年 1024年 2 - s2.0 - 1642588230 10.1016 / s0140 - 6736 (04) 15836 - 4 朱 h . M。 李 J。 郑 H。 人类自然感染的 疟原虫诺氏疟原虫 中国寄生虫学杂志,寄生虫病 2006年 24 1 70年 71年 2 - s2.0 - 39449118958 Jongwutiwes 年代。 Putaporntip C。 Iwasaki T。 萨塔 T。 Kanbara H。 自然地获得 疟原虫诺氏疟原虫疟疾在人类,泰国 新发传染病 2004年 10 12 2211年 2213年 2 - s2.0 - 9744228634 Luchavez J。 Espino F。 Curameng P。 Espina R。 贝尔 D。 Chiodini P。 Nolder D。 萨瑟兰 C。 李 k . S。 辛格 B。 人类感染 疟原虫诺氏疟原虫、菲律宾 新发传染病 2008年 14 5 811年 813年 2 - s2.0 - 45249114419 Ng o . T。 英格 e . O。 程 c . L。 朴 j·L。 李 c . N。 裴 s W。 田 m . T。 金 p . L。 绮 s . L。 自然获得的人类 疟原虫诺氏疟原虫感染,新加坡 新发传染病 2008年 14 5 814年 816年 2 - s2.0 - 45249096691 麦考利 V。 山 C。 Achilli 一个。 联合 C。 克拉克 D。 他不 W。 布莱克本 J。 Semino O。 Scozzari R。 Cruciani F。 塔哈 一个。 Shaari n K。 拉贾 j . M。 伊斯梅尔 P。 Zainuddin Z。 古德温 W。 Bulbeck D。 Bandelt h·J。 奥本海默 年代。 Torroni 一个。 理查兹 M。 单、快速沿海解决亚洲显示完整的线粒体基因组的分析 科学 2005年 308年 5724年 1034年 1036年 2 - s2.0 - 20844445609 10.1126 / science.1109792 康威 d . J。 分子流行病学的疟疾 临床微生物学检查 2007年 20. 1 188年 204年 2 - s2.0 - 33846491759 10.1128 / CMR.00021-06 Douradinha B。 莫塔 M . M。 Luty a·j·F。 Sauerwein r·W。 跨物种的免疫力在疟疾疫苗开发:两个,三个,甚至四个的价格? 感染和免疫 2008年 76年 3 873年 878年 2 - s2.0 - 40749153135 10.1128 / IAI.00431-07