挥发油的体外抗肿瘤活性评价锥虫属brucei brucei和锥虫属evansi

摘要

精油(EOs)Cymbopogon citratus(CC),桉树citriodora(EC),桉树camaldulensis(ED)素类(CS)是通过水蒸馏法得到的。在体外对其活性进行了评价锥虫属brucei brucei(Tbb)和锥虫属evansi（t . evansi)．在体外实验中，发现EOs在短时间内具有剂量依赖性的抗锥虫活性。随着时间的推移，所有EOs的寄生虫数量都达到了0.4 g/ml、0.2 g/ml和0.1 g/ml的剂量。0.4 g/mL CC对Tbb和Tbb在3分钟和2分钟时更有效t . evansi,分别。气相色谱-质谱联用分析结果显示，CS中存在环丁烷(96.09%)，EC中存在6-辛醛(77.11%)，ED中存在桉油醇(75%)，CC中存在柠檬醛(38.32%)等有机化合物。讨论了与锥虫化疗有关的结果。

1.介绍

非洲锥虫病是一种由锥虫科几种锥虫引起的疾病，感染人类或动物。锥虫属evansi（t . evansi)是分布最广泛的致病非洲锥虫，影响家畜和野生动物[1引起非洲锥虫病，这是一种影响人和动物的疾病[2- - - - - -4］．众所周知t . evansi是一种名为苏拉的疾病的病原，苏拉是牲畜发病和死亡的主要原因[5，6据报道，它发生在多种宿主中，最经济的是马、水牛和牛[3.，6，7］．锥虫属brucei brucei(Tbb)也与其他几种锥虫病一起引起非洲锥虫病，尽管Tbb与非洲锥虫有形态上的相似性t . evansi，后者与近缘种的区别在于没有活动原细胞DNA小圆[8］．

目前，非洲有3500万人和2500万头牛面临感染这种疾病的风险，如果不治疗，这种疾病是致命的[9］．具有讽刺意味的是，一些已注册的锥虫杀虫剂经常是有毒的，需要长期服用，缺乏疗效，有时大多数患者买不起[10］．

在许多非洲国家，植物传统上已经使用了几个世纪，目前仍在广泛用于治疗这种疾病和其他寄生虫病，这可能是由于药品供应有限和价格低廉。精油(EOs)是由植物产生的气味成分，传统上用于呼吸道感染，并已知具有抗菌特性[11，12］．众所周知，一些EOs含有一些具有杀虫特性的化学成分[13]，有些EOs具有不同变体的特征化合物阵列，其中最丰富的化合物类型是萜类和苯基化合物[14］．

本研究调查了EOs的体外抗锥虫活性的证据香茅、柠檬桉、camaldulensis和素类对Tbb和t . evansi在试图探索自然产品，可能是更容易获得的来源锥虫物种差异和事实，目前可用的治疗远远不理想。

2.材料和方法

2．1．植物材料收集

新鲜的素类果皮取自2009年4月在尼日利亚扎里亚购买的新鲜橙子。的叶子Cymbopogon citratus(CC)于2009年3月在尼日利亚扎里亚国家化学技术研究所(NARICT)的研究园收获,桉树Camaldulensis(ED)和桉树citriodora(EC)于2009年4月在尼日利亚卡杜纳州Shika州的国家林业收获。这些植物(CC、EC和ED)是在尼日利亚扎里亚的Ahmadu Bello大学生物科学系鉴定的。

2．2.测试生物

寄生虫锥虫属brucei brucei和锥虫属evansi使用并从扎里亚-尼日利亚Ahmadu Bello大学兽医学院寄生虫学实验室维持的稳定剂中获得。

2．3.精油提取

简单地说，将每株植物的新鲜植物材料250g放入圆底烧瓶中，并加入1000ml蒸馏水，然后进行水力蒸馏法[156个小时。在无水硫酸钠上回收和干燥EOs。生产的每一个EOs都使用从尼日利亚拉各斯联合非洲公司格兰谷物和油料厂有限公司获得的纯植物油进行稀释。在0.4 g/mL、0.2 g/mL和0.1 g/mL的稀释剂中分别制备50%、25%和1%的EOs。

2．4．测定Parasiteamia

这些寄生虫在实验室里通过在老鼠身上连续传代来维持，直到需要为止。在田间寄生虫数为16-32只时进行传代，染血时进行传代在0.1-0.2 mL血液/生理盐水溶液中，将寄生虫腹腔导入健康大鼠。在显微镜下观察寄生虫的数量400例，每日监测寄生虫血症。

2．5．在体外测试

药物潜伏期感染试验[16]用湿稠血片法[17在96孔微滴度板上共分三次检测活动锥虫将感染血液的L与20分别从50%、25%和1%(之前制备的)提取每种EOs的L，最终浓度分别为114 mg/mL、57 mg/mL和28.6 mg/mL。在孵育1-20分钟期间监测寄生虫血症．约0.5l - 1每隔1分钟在显微镜下观察试验混合物的L值400.用含寄生虫的感染血液建立阳性对照(PC)、阴性对照(NC)和稀释对照(DC)，静置4小时。PC含25 mg/mL(1.05 g二乙酰二胺和1.31 g安替比林)，NC只含有悬浮在肝素和pH 7.2的磷酸盐缓冲液生理盐水中的感染血液，DC只含有纯植物油(100%)。

2．6．气相色谱-质谱法

这是由Maciel等人所描述的[13使用从CS, CC, EC和ED中获得的EOs在GC-MS QP2010岛津，日本。柱温为，注射温度为，压力为53.2 kPa。，Linear velocity was 36.2 cm/sec and Total flow was 53.8 mL/min. The Compounds were identified by GC retention time (RT) and by comparism with those present in the National Institute for Standard Technology computer data bank (NIST; 05 s. LIB).

3.结果与讨论

图中的结果1和2显示EC、CS、ED和CC的体外活性t . evansi和Tbb。结果如图所示1(一)，1 (b)，1 (c)和1 (d)结果表明，每一种EOs的剂量为0.4 g/mL，均能在3分钟内杀死疟原虫(CC除外，CC在2分钟内杀死疟原虫)t . evansi．当EOs浓度为0.2 g/mL和0.1 g/mL时，CS的寄生虫死亡时间分别为7 min和17 min, ED分别为4 min和15 min, EC分别为3 min和19 min, CC分别为2 min和10 min。数据2(一个)，2 (b)，2 (c),2 (d)州的体外Antitrypanosomal活动的四种EOs和Tbb 0.4克/毫升浓度诱导死亡的Tbb 5分钟,4分钟,3分钟,CS, ED / EC和CC。EOs的浓度在0.2 g / mL和0.1 g / mL, CS的寄生虫的死亡时间为6分钟,15分钟,ED分别为8分钟和17分钟，EC分别为8分钟和22分钟，CC分别为4分钟和11分钟。这表明两者的寄生虫死亡呈剂量和时间依赖性模式t . evansi和Tbb。结果表明，与ED、EC和CS相比，CC对细胞数量的减少作用更大t . evansi和Tbb。在0.1 g/mL浓度下，所有的EOs对两种寄生虫均有活性，但候选EO的细胞数量有所下降。

表格1显示了存在于EOs中的各种化合物，每个EO的化学成分都是不同的。CC中有柠檬醛(38.32%)，CS中有β -月桂烯(1.81%)和环丁烷(98.08%)，ED中有桉树酚(75.04%)，EC中有6-辛醛(77.11%)。大多数化合物，如β -月桂烯、桉树醇和柠檬醛，已知具有生物活性[13，18，19]也是对付植物和人类病原体的原料[20.］．一些报告也显示，CC通过抑制自由基对生物膜的攻击而在过氧化中发挥作用[21，22特别是红血球，而且不太可能构成任何健康风险[15］．EOs的活性也可能是由于环烃的疏水性质(表1)，使EOs与锥虫相互作用，导致寄生虫膜结构的构象改变，导致膜稳定性丧失[21］．

在体外试验中Tbb和Tbb的寄生虫数量迅速下降t . evansi表明EOs实际上正在通过一种未知的机制杀死寄生虫，尽管EOs可以有多种作用模式和多个破坏点[23例如抑制寄生虫糖酵解途径中的一些关键酶。我们也知道，一些EOs成分抑制乙酰胆碱酯酶活性，并作用于其他易损部位，如细胞色素p450 [13］．植物EOs的这种多组分特性对锥虫的多个靶点具有优势，这在多重耐药病原体日益出现的时候尤其相关。

我们没有观察到鞭毛虫运动的恢复或Tbb和Tbb细胞数量的增加t . evansi经PC、CC、ED、EC、CS孵育4小时观察。NC和DC对寄生虫和细胞数无影响(图)1和2)，这证明了所有EOs物种所使用的推动力。从图中观察到1和2表明锥虫的物种差异可能是杀锥虫效果的原因，这与所有EOs中寄生虫数量随时间减少的方式不同是一致的。

在本研究中，4种EOs的评价均能降低Tbb和Tbb的细胞数量t . evansi呈剂量依赖性。与EC、CS和ED相比，CC的EOs具有更大的降低寄生虫数量的作用，但真正的作用机制尚需进一步研究。由于EO具有这些特性，将其用于进一步的锥虫病理生理学研究将是有利的。

致谢

作者感谢扎里亚-尼日利亚Ahmadu Bello大学兽医寄生虫学系的Joseph Ajanusi教授和Mallam Bala教授的仁慈，他们释放了这种测试生物体。作者也赞赏NARICT的研究设施。

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