文摘
葡萄球菌物种被认为是一个主要的病原体引起的食物中毒突发事件。这项工作的目的是评估toxinogenic和抗生素菌株的敏感性资料葡萄球菌spp分离出三种类型的发酵奶制品(酸奶、小米degue和蒸粗麦粉degue)。的隔离葡萄球菌菌株进行选择性的媒体,他们的身份是使用生化和分子方法完成的。15抗生素的敏感性测试是评估使用纸片扩散法。免疫扩散法被用来评估毒素(luk-E / D, luk-S / F,埃塔,和ETB)生产。生物膜的形成是定性研究微型板块。不到一半(42.77%)的收集到的样本受到了污染葡萄球菌spp。酸奶和小米degue样品收集在下午比早上收集更多的污染。的金黄色葡萄球菌,美国,和美国xylosus菌株,分别是最礼物。金黄色葡萄球菌是唯一coagulase-positive物种在我们的样品确认。观察最高抵抗抗生素青霉素(100%)无论样本的性质。金黄色葡萄球菌菌株是高度耐甲氧西林(71.4%)。的金黄色葡萄球菌压力是最biofilm-forming(27.6%),紧随其后美国capitis菌株。潘顿和情人节杀白细胞素(luk-S / F)是由金黄色葡萄球菌株率为8.33%。只有coagulase-negative葡萄球菌(中枢神经系统)产生Luk-E / D。的高葡萄球菌污染表明糟糕的卫生质量在乳制品的生产和销售。因此,有必要提高发酵乳制品的质量。
1。介绍
牛奶及其衍生产品在孩子的饮食很重要。液体牛奶是一个食品提供钙、钾、磷、乳糖、酪蛋白此处则,儿童和维生素D (1]。因此,膳食钙主要来自乳制品,如牛奶、酸奶、奶酪(2,3)以及其他乳制品(4]。在西非国家,最消耗degue(小米和蒸粗麦粉),酸奶,gappal, tchobal [5]。在过去的几年里,食物中毒和食品安全已经成为非常局部的主题,吸引公众的关注(6]。相关食源性感染是很常见的,许多食品的消费包括饮料在餐饮销售和某些细菌或其毒素污染。奶制品来自奶牛牛奶可以港各种微生物(7],可以食源性病原体的重要来源8]。各种细菌菌株(肉毒梭状芽胞杆菌、perfringens梭状芽胞杆菌、弯曲杆菌、大肠杆菌,沙门氏菌,和金黄色葡萄球菌)会导致食物中毒9]。中提到的细菌,金黄色葡萄球菌是一个主要的细菌病原体负责和发散范围广泛的人类和动物感染,包括toxin-mediated食源性疾病(10,11]。金黄色葡萄球菌据报道,被牛乳腺炎的重要原因之一,其中最cost-intensive疾病在乳制品行业12- - - - - -14]。
控制细菌感染,不受控制的自我药疗的使用抗生素选择抵抗细菌。不幸的是,大多数已知的抗生素迄今为止面临细菌阻力(15]。因此这是报道,耐甲氧西林的地方金黄色葡萄球菌(MRSA)很容易形成一个强大的生物膜和殖民粘膜,引起慢性的原因之一,复发,或侵入性感染16]。他们坚持的能力,形成生物膜表面的牛奶加工设备可能导致的一个来源金黄色葡萄球菌污染的乳品生产(17,18]。最近,发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株在不同类型的食品,包括肉类产品、原料的产品,世界各地的牛奶和乳制品(19- - - - - -21]。
抵抗细菌感染通过传统抗生素的治疗变得更加困难。此外,金黄色葡萄球菌通常与各种毒性有关因素如潘顿的生产和情人节杀白细胞素(PVL)和耐热葡萄球菌肠毒素,当摄入,会引起胃肠道功能紊乱(22]。奶制品通常港产肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株能够诱导人类食源性中毒(23,24]。据报道,产生肠毒素引起腹部绞痛,恶心,呕吐,最终腹泻(25,26]。
他们越来越诊断在贝宁集体餐饮,这已经成为现代社会的一种现象由于其营养和社会经济的重要性,近年来大幅增加(27]。针对很多情况下引起的食物中毒金黄色葡萄球菌耐甲氧西林和毒素水平的增加生产商葡萄球菌spp从食物是要考虑菌株。有必要进行研究,以防止孩子们健康风险与发酵乳制品的消费。本研究的目的是评估的toxinogenic和抗生素敏感性资料葡萄球菌菌株分离出三种类型的发酵奶制品(酸奶、蒸粗麦粉degue,小米degue)在中学在贝宁科托努和Abomey-Calavi出售。
2。材料和方法
2.1。取样和样品收集
在这项研究中,15个学校在科托努和Abomey-Calavi选择使用“立意”示例集合(抽样技术28]。使用这种抽样法,180个样本的三个选择发酵奶制品(酸奶、小米degue,和蒸粗麦粉degue)收集供应商坐落在学校里面还是外面在半径为20米。收集到的样本包括60酸奶样品,60小米degue样品,和60蒸粗麦粉degue样本。为每种类型的发酵乳制品,两个样品被一天两次(早晚)和每周两次。收集到的样本运送到一个冰箱(约4°C)的实验室进行微生物分析。
2.2。微生物分析
2.2.1。分离和鉴定葡萄球菌spp
葡萄球菌菌株被孤立在Baird-Parker琼脂(OXOID CM0275)富含蛋黄和亚碲酸钾(29日]。短暂,10 g的每个收集样本均质成无菌瓶,一个三角胸衣90毫升无菌盐水胰蛋白胨。在37°C 24小时孵化后,孤立的殖民地被生化特征测试(过氧化氢酶试验、凝固酶试验、DNase测试和画廊API®葡萄球菌)(30.]。
2.2.2。分子的确认葡萄球菌spp
孤立的葡萄球菌菌株被证实通过PCR分子。手动的总DNA提取使用沸腾的方法(31日]。PCR是在30岁µl包含15µl 2 x大师混合(生物学实验室),1.5µl的底漆(G1: 5′-GAAGTCGTAACAAGG-3′), 1.5µl反向引物(L1: 5′-CAAGGCATCCACCGT-3′),和3µl的DNA。25周期(94°C 1分钟,50°C 30年代,1分钟和72°C)在执行thermocycler(基因,Labnet国际公司)。最初的变性是在94°C 5分钟完成,最后的伸长是在72°C 7分钟完成,和放大产品储存在4°C到电泳迁移。电泳是在150 V 30分钟执行1.5%的琼脂糖凝胶含有溴化乙锭。使用了100个基点的标准分子梯子。16 S-23 S基因的乐队葡萄球菌spp在大约437个基点(可视化32在紫外线透照法)。
2.3。表型检测的毒素
潘顿的生产和情人节leucocidin (luk-S / F),白细胞毒素Luk-E / D和epidermolysins (ETA和ETB)研究了径向分离株的免疫沉淀反应法(33]。简单地说,新鲜葡萄球菌殖民地在500年被培养µl(酵母casamino acid-pyruvate (YCP)汤在37°C为18 - 24 h和搅拌(200 rpm)。收集每个样本的上层清液的细菌培养后离心5分钟(5000 rpm)。0.6%的琼脂糖凝胶用PBS,七井间隔8毫米被挖。大约30µl(每个上层清液存入相应的外部。适当的纯化兔抗体(OD = 3)存入中央玫瑰好,控制抗原(d = 0.2)的顶部和底部井。实验在室温下孵化大约16个小时。孵化期后,沉淀弧直接或与Coomassie蓝染色后观察33]。
2.4。生物膜的培养研究
从18 h文化在脑心浸液,48-well微型板块(聚苯乙烯)接种10µ150 l的稀释细菌悬液µl BCC的补充道。微型板块是孵化24 h在37°C。孵化后,井用无菌生理水清洗三次(约0.2毫升)消除自由细菌(浮游生物)。形成的生物膜固着生物的附着的聚苯乙烯支持在每个井与结晶紫染色(0.1%)10分钟。多余的染料与无菌蒸馏水彻底删除,和盘子离开在室温下干燥。结果相比,孵化后的积极的和消极的控制(34]。
2.5。抗生素分离菌株的敏感性葡萄球菌spp
的敏感性葡萄球菌菌株对抗生素是由扩散法(35]。接受测试的抗生素(Bio-Rad)如下:青霉素G (P 10µ30 g)、阿米卡星(正义与发展党µ50 g)、磷霉素(安全系数µ30 g)、头孢西丁(福克斯µ10 g)、庆大霉素(GENµ15 g)、红霉素(Eµg)、洁霉素(我15µ5 g)、环丙沙星(CFµg)、氧氟沙星(OFX 5µg),阿莫西林(AMO 20µg)、头孢噻肟(CTX 30µ30 g)、四环素(春节µ23.75 g),功效(SXTµg), amoxicillin-clavulanic酸(AMC 20µg)和梭链孢酸(FD 10µg)。
2.6。数据分析
Microsoft Office Excel 2010电子表格是用于数据处理。进行了统计分析和图表使用R 3.6.1。测试被认为是具有统计学意义 。
3所示。结果
3.1。微生物收集发酵乳制品的质量
3.1.1。枚举的葡萄球菌spp细菌的发酵乳制品进行了分析
微生物发酵乳制品中枚举结果收集,表达CFU / ml,展示在表1。他们代表不同的微生物负载微生物寻求酸奶,小米degue,和蒸粗麦粉degue分析。此表的分析表明,微生物负载变化根据样品类型。最受污染的样本的小米degue和酸奶(至少是那些污染CFU /毫升)。关于总大肠菌、小米degue样本污染最严重(CFU /毫升)和最受污染的酸奶样品。
3.1.2。葡萄球菌发酵乳制品中发现的物种进行了分析
葡萄球菌spp菌株被孤立在42.77%从180年收集的样本。16 s-23s基因葡萄球菌spp存在于我们所有的孤立的菌株。共有13种葡萄球菌被确定。金黄色葡萄球菌是唯一coagulase-positive物种在我们的样品确认。三个最代表物种金黄色葡萄球菌(36.36%),美国xylosus(19.48%)和美国capitis(18.18%)。美国耳,美国cohnii spp cohnii,美国cohnii spp urealyticus,和美国warneri是最不孤立各自率为1.3%(图1)。
3.1.3。的分布葡萄球菌spp根据发酵菌株分离乳制品
图2显示了13日确定的分布葡萄球菌根据菌株的发酵乳制品。物种的分布根据不同类型的发酵奶产品不具有统计学意义 。然而,看来金黄色葡萄球菌是最孤立的无论牛奶产品。十个不同的物种被发现在蒸粗麦粉degue、七个物种在酸奶和六种小米degue。金黄色葡萄球菌,s . xylosus和美国capitis在场的三种产品。
3.1.4。的分布葡萄球菌spp菌株分离根据收集的时间
图3表明蒸粗麦粉degue样本在早晨污染(16.29%)比在下午(14.29%)。酸奶样品下午更污染(23.38%)比早上(18.18%)。
3.2。根据这个孤立分布的生物膜的形成葡萄球菌物种
生物膜生产统计上并没有根据葡萄球菌物种 。孤立的生物膜的生产能力葡萄球菌显示,金黄色葡萄球菌是最生物膜(27.6%)形成紧随其后的是吗美国capitis(24.1%)和美国xylosus(20.7%)(图4)。没有一个美国cohnii spp cohnii,s . cohnii ssp urealyticus和美国schleiferi生物膜的产生。
的葡萄球菌菌株从酸奶(48.28%)更生物膜分离而独立于蒸粗麦粉degue(17.24%)少了(图5)。生物膜生产不同的孤立的物种样本类型显著的功能 。
3.3。通过孤立分布的毒素生产葡萄球菌spp菌株
孤立的葡萄球菌spp主要是生产epidermolysin B (ETB) coagulase-negative率为37.5%葡萄球菌菌株,coagulase-positive为25%葡萄球菌。Luk-S / F是由金黄色葡萄球菌株率为8.33%。只有coagulase-negative葡萄球菌产生了Luk-E / D(图6)。
在早上收集到的样品,只有埃塔和ETB毒素产生的葡萄球菌菌株。下午ETB-producer菌株存在样本。Luk-E F / D和Luk-S /只产生了毒素葡萄球菌下午菌株分离(图7)。
3.4。易感性的孤立葡萄球菌spp菌株对抗生素
所有的葡萄球菌菌株耐青霉素,93.51%的人对洁霉素产生抗药性。耐头孢西丁,约70.13%和60%的抗生素有耐药性β内酰胺的家庭。电阻率最低的是观察与环丙沙星(22.08%)(图8)。
对于coagulase-negative葡萄球菌(中枢神经系统)、阻力6抗生素(红霉素,环丙沙星,氧氟沙星,trimethoprim-sulfamide,和四环素)减少50%。观察最低的阻力金黄色葡萄球菌环丙沙星(28.6%),紧随其后的是红霉素(39.3%)。的电阻金黄色葡萄球菌甲氧西林(头孢西丁)为71.4%(图9)。
4所示。讨论
的评价微生物发酵的牛奶(酸奶、小米的质量degue和蒸粗麦粉degue)产品显示总大肠杆菌群的存在葡萄球菌细菌。这个观察是一致的工作Kukhtyn et al。36),发现过程中最大的危险让牛奶和奶制品是病原体的污染。乳制品是高水分和为许多病原体包括提供合适的生长条件金黄色葡萄球菌经常是引起食源性疾病的37]。因此重要的是要实现每个乳制品微生物规定减少食物中毒的发酵乳制品。的存在金黄色葡萄球菌演示了一个故障在卫生和良好生产规范的实现。寻找这些细菌在工业级别构成整体的卫生质量的考验。的微生物质量乳制品食物中毒的预防是很重要的。因此,在这项研究中,我们观察到一个非常高的总大肠菌和的存在葡萄球菌。它出现在我们的调查,36.36%的菌株葡萄球菌孤立coagulase-positive (金黄色葡萄球菌),63.64%是coagulase-negative(图1)。的存在金黄色葡萄球菌在乳制品可能会改变这些产品的微生物质量和导致食物中毒38]。在世界范围内,金黄色葡萄球菌已经从几个孤立的即食产品。这些微生物的存在表明潜在的交叉污染,可能是由于不当的员工卫生和/或表面卫生差。的确,金黄色葡萄球菌菌株被分离从食物处理器,食物,和病人标本(39]。这种微生物能够生存在干燥的不锈钢,它可以很容易地从海绵不锈钢表面,随后转移到食品(40]。牛奶中转换,金黄色葡萄球菌可以在几乎每一步污染生产。因此,金黄色葡萄球菌可以直接流进牛奶和产生肠毒素,是最常见的一个食品安全问题从原料奶产品41- - - - - -43]。
在我们的研究中,一些作者观察到在美国(44,埃及45],和摩洛哥[46多样性coagulase-negative的存在葡萄球菌菌株。通常在原料奶中发现的美国epidermidis,美国simulans,美国hominis,美国caprae,s . warneri和美国xylosus(44,47,48]。在我们的研究中,最主要的coagulase-negative应变美国xylosus。但Organji et al。48)在他们的研究中观察到在埃及的牛奶美国saprophyticus是最主要coagulase-negative应变。这个比例的差异可以解释为我们的样品不够发酵,因为的事实美国saprophyticus在发酵过程中所起的作用(49]。在这方面,可能不与所有相关的健康风险葡萄球菌在发酵乳制品中发现样本。考虑到收集期间,酸奶样品污染最严重的葡萄球菌早上下午(23.38%)比(18.18%)。这个结果低于结果发现圆形浮雕等。50)发现,90.4%的污染金黄色葡萄球菌早上在原料奶。这种差异可以解释酸奶的发酵和巴氏灭菌过程经历。
关于生物膜形成的能力,金黄色葡萄球菌显示率最高(27.6%)。此外,酸奶样品是那些含有更多biofilm-forming株(48.28%)葡萄球菌。的确,金黄色葡萄球菌可以产生一个多层生物膜纳入glycocalyx整体与异构的表达蛋白质,形成至少两种类型的生物膜:ica-dependent和ica-independent51]。生物膜的形成由食源性葡萄球菌菌株(尤其是酸奶)是人类的预后非常严重,尤其是对于孩子是最大的消费者。这种生物膜的形成是多观察临床菌株(52]。生物膜的形成在乳品设备不足以及酸化在发酵过程中打开金黄色葡萄球菌利基市场的乘法和高效的污染乳品加工线(17]。
的致病性葡萄球菌生产及其耐药菌株可归因于毒素概要文件(53]。毒素的研究表明,潘顿和情人节leucocidin生产(仅8.33%)金黄色葡萄球菌。毒素产生的大多数是epidermolysin B株(62.5%)葡萄球菌。这个结果高于27.59%由Ahouandjinou et al。54中)葡萄球菌菌株分离出牛的尸体在贝宁。PVL生产在我们的研究中获得低于15%获得在贝宁Baba-Moussa et al。55直接借记的起源。Baba-Moussa et al。56显示,21.50%的金黄色葡萄球菌菌株分离出楚PVL产生感染。这种毒素,在临床实践中,与皮肤疾病,如沸腾和脓肿57]。因此,PVL的食品的生产菌株也必须挑战美国尤其是其毒性。这可能是由于存在携带这些类型的卖家,帮助传播疾病的人类的食物。金黄色葡萄球菌能够生存在干燥的不锈钢,它可以很容易地从任何表面转移到食品(40]。因此,在牛奶转换过程中,金黄色葡萄球菌可以在几乎每一步污染生产。金黄色葡萄球菌可以直接流进牛奶和产生外毒素是最常见的一种食品安全问题从原料奶产品41- - - - - -43,58]。此外,毒素可以生产的产品如果在发酵乳制品产品的存储条件允许的增长金黄色葡萄球菌。
孤立的对抗生素敏感性的研究葡萄球菌菌株显示阻力的存在,与变量比例根据抗生素的家庭。事实上,葡萄球菌spp显示高电阻率对青霉素(100%)、洁霉素(93.51%)和头孢噻肟(90.91%)。这些结果是一致的与报道葡萄球菌菌株分离从街头食品在贝宁(10)和埃塞俄比亚(59]。这么高的阻力水平对抗生素可以观察到由于自我药疗和过度和不受控制的使用抗生素。最低的阻力金黄色葡萄球菌观察到的是与环丙沙星(28.6%)。这个结果是获得接近31.3%的研究对牛奶进行王et al。60]。大约71%的金黄色葡萄球菌耐甲氧西林(头孢西丁)。这些结果高于15.18%发现新浪et al。10]。的coagulase-negative耐甲氧西林葡萄球菌菌株显示率为69.4%。我们的结果关于这个抗生素略低于报道coagulase-negative临床菌株在土耳其葡萄球菌(61年]。这种差异可能是由于这样的事实:临床菌株比食物更接触抗菌分子压力。的葡萄球菌种虫害甲氧西林耐药性在这项研究表明,它涉及的大部分的阻力β目前-lactams [62年]。然而,对食物的比例是可怕的,因为据报道,耐甲氧西林葡萄球菌压力开始对许多抗生素产生抗药性(喹诺酮类、大环内酯类、氨基糖甙类、四环素、功效、克林霉素、氯霉素)广泛用于控制葡萄球菌感染(63年,64年),如食物中毒。卖方不保护他们的手和头部,不遵守卫生规则在乳制品的生产很快发现自己受到潜在的致病性葡萄球菌抗生素的抗药性菌株,产生毒素,形成生物膜。这种情况是一个真正的食品安全问题。
5。结论
葡萄球菌食物中毒主要关注的是全球公共卫生项目。结果清楚地表明,发酵乳制品含有13种分析葡萄球菌,也就是说,金黄色葡萄球菌。人类,动物和环境污染来源可能是有罪的乳制品。耐药和产毒菌株也孤立的从收集到的发酵奶产品。有一个高风险食物中毒与消费相关的乳制品。我们可以说良好的卫生和生产实践的每一步选择乳制品发酵生产链条的重要性和必要消除潜在的病原的传播葡萄球菌在社区。因此,更多的关注卫生预防措施要求减少污染葡萄球菌。
数据可用性
数据可从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突的出版的手稿。
确认
这项工作是支持的国际科学基金会(IFS),批准号i - 3 - e - 5393 - 2。