封锁情人节白酰基基因在群体中获得的患病率金黄色葡萄球菌:实时荧光定量PCR研究

抽象的

Panton-valentine白葫芦（luk-pv）是一种细胞毒素，导致白细胞破坏和组织坏死。本研究的目的是确定普遍存在PV1，梅卡,n基因金黄色葡萄球菌从印度西孟加拉邦贫民窟人口的前鼻孔和皮肤浅表感染部位获得的分离物。表达水平的PV1还分析了基因。22S.金黄色葡萄球菌分离菌株，并进行表型和基因型特异性检测S.金黄色葡萄球菌分离物被执行。采用种特异性16S rRNA引物对进行PCR鉴定，最终鉴定出22株分离株为阳性S.金黄色葡萄球菌．采用万古霉素肉汤稀释法测定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的最低抑菌浓度(MIC)。分离株抗菌谱分析S.金黄色葡萄球菌不同抗微生物剂的菌株显示出27％至91％的抗生素抗性。Vancomycin的MIC的结果显示出95％的菌株为VSSA和5％的签证。68％的分离物对甲氧西林有抗性。所有分离株都受到检测pv, mec一个,n其中，9%、68%和27%的基因被发现有“港湾”现象PVL，MEC.一个,n基因,分别。所有MRSA菌株产生高到中等水平的生物膜。PVL.进行基因表达在体外通过实时PCR。低的∆Ct值(0.493)提示高表达PVL.在一个S.金黄色葡萄球菌拉紧。因此,检测PVL.社区获得性基因S.金黄色葡萄球菌表明致病的出现S.金黄色葡萄球菌在研究区域的群落设置中。现有的探索对于高水平的多药耐药是非常必要的和有用的S.金黄色葡萄球菌感染包括MRSA。

1.介绍

到目前为止，人类的主要病原体，金黄色葡萄球菌，由于阐述了几种不同的毒力因素，因此对我们的生活变成了威胁。Panton-valentine白毛蛋白（PVL）是最重要的毒力因子之一S.金黄色葡萄球菌．这种形成孔的细胞毒素与组织坏死有关，也会导致白细胞膜的破坏[1]。噬菌体的遗传物质对产生PVL细胞毒素有重要贡献。PVL携带S.金黄色葡萄球菌菌株比PVL负面更毒性和高度传播的菌株S.金黄色葡萄球菌．PVL.编码PV1细胞毒素的基因包含由Luks-PV和LukF-PV编码的两种外蛋白亚基[2，3.]。这两个共同转录的基因通过在宿主免疫细胞特别是白细胞、单核细胞和巨噬细胞的细胞膜上聚集而共同作为一个亚基形成一个孔[4]。PVL携带S.金黄色葡萄球菌负责不同的危及生命的侵入性疾病，以及皮肤和软组织感染。pvl-sa受感染的皮肤是红色的，用脓液发炎。它可以具有不同的其他外表，如蜂窝织炎，脓肿，沸腾，毛囊炎等。首先，PVL携带S.金黄色葡萄球菌感染皮肤和软组织，但感染逐渐扩散到肺，破坏肺组织，导致出血性坏死性肺炎，最致命的疾病之一S.金黄色葡萄球菌［5]。

在最近一段时间里，流行率总体上有所上升PVL.积极的S.金黄色葡萄球菌在全球范围内。但不同国家报告的患病率各不相同，即中国为12.8% [6， 30%在德国[7，日本占45.3%，最显著的是美国占97% [8]。

PVL已成为社区获得性最重要的毒力因素S.金黄色葡萄球菌．普遍存在PVL.MRSA分离株中的基因尚未从印度充分报告。本研究旨在调查PVL患病率和PVL.表达水平以及来自印度西孟加拉邦的某些其他毒力标记。研究区域在图中证明1．

2.材料和方法

2.1。样品采集

共25株非重复菌株S.金黄色葡萄球菌从Midnapore镇的不同贫民窟地区的人类受试者收集（拉特。22°23'41.57^”22.02 N 22°26”^”n;长。87°17'23.65.^”e到87°20'15.35^”E) 2015年11月至2016年3月，在印度西孟加拉邦。机构审查委员会(IRV)遵循印度医学研究理事会(ICMR)关于人类受试者生物医学研究的伦理准则，对目前的人类受试者研究方案进行了伦理审查。细菌分离物根据收集地点、年龄和性别分为三组(表1)．采集样本时，使用无菌粘胶拭子;对于潮湿的伤口，直接使用，但对于干燥的伤口，用无菌生理盐水湿润，这样可以增加有机体从感染部位恢复的机会。

2.2。隔离和鉴定S.金黄色葡萄球菌

所有样品均转入2gm % Luria肉汤中(每个样品一个)，在37℃摇培养箱中培养。16-18小时后，将所有样品接种于甘露醇盐琼脂平板上，在37℃下孵育24-25小时[14]。所有黄色色素菌落接种于LB琼脂中，4℃保存。结果从各自的培养基板生长检测菌落特征和形态。每个培养物都进行革兰氏染色，并按照Lancette和Tatini描述的方法检测过氧化氢酶、游离凝固酶、黄色色素和热核酸酶(TNase)的产生[15]。

2.3。细菌培养分离物的DNA提取

为了从细菌培养中提取DNA，遵循快速沸腾法[14]。简而言之，从过夜种植培养的4至5个单菌落接种在200 μ.L无菌Milli-Q水，并在99℃下煮沸10分钟。在14000rpm离心10分钟后，轻轻地将上清液中收集在无菌微量纤维管中。将得到的模板DNA储存在-20℃和2 μ.l用于PCR分析。

2.4。PCR扩增的分子鉴定16S RRNA基因

表型分离和确认S.金黄色葡萄球菌采用引物对进行PCR扩增(表1)3.)种专一性16S RRNA基因。这些引物扩增了来自16S RRNA隔离的基因S.金黄色葡萄球菌菌株。PCR程序在25μ.L PCR管和每种反应混合物含有2.5 μ.l PCR缓冲液(10X);1μ.l（1U / /μ.l) Taq DNA聚合酶;2μ.l dntps（每个200 mm）;1μ.l的每个底漆（10 pmol /μ.l）;2.5 μ.l（10 ng /μ.l）模板DNA;和15.75 μ.PCR级水。PCR的热循环过程是在热循环器(Eppendorf，德国)中进行的，从94°C的初始变性2分钟开始，然后进行33个循环，每个循环包括94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C聚合45秒，最终在72°C延伸4分钟。S.金黄色葡萄球菌本实验以ATCC 25923为阳性对照。

2.5。的生化特性S.金黄色葡萄球菌菌株

经鉴定的菌株为S.金黄色葡萄球菌通过特有的16S RRNA通过不同生化试验进一步评价甘露醇发酵和在高盐浓度下生长，明胶水解，尿素水解，牛奶琼脂培养基上的蛋白酶活性，蛋黄琼脂培养基上的脂肪酶生产(HiMedia, Mumbai)，以及标准方法水解esculin [16- - - - - -19]和刚果红琼脂(CRA)试验[20.]。

2.6。生物膜试验

生物膜试验在硼硅酸盐玻璃管中按照Watnick等人描述的方法进行[21]。简单地说，分离株在3ml的Luria肉汤中过夜。然后5μ.L中的一夜之间的文化被加到500年 μ.在试管中的无菌LB，以稀释1：100。试管保持静态24小时，然后用蒸馏水剧烈冲洗试管，以除去所有非更抗性细胞。此外，600 μ.加入0.1％（w / v）晶体紫，并孵育30分钟。然后用蒸馏水剧烈冲洗试管。将1ml DMSO加入其中，然后涡旋。孵育10分钟后，在570nm下测量光密度。每个测定一式三份进行。所得光学密度的平均值被分类为Cha等人所建议的三类。［22]，使菌株与OD₅₇₀<0.2,0.2≥OD₅₇₀≤1.0和od₅₇₀> 1.0分别定义为生物膜非格式和生物膜成型剂，分别为弱水平和强水平。

2.7。分离株的抗生素敏感性分析S.金黄色葡萄球菌

抗生素敏感性S.金黄色葡萄球菌采用盘扩散法，使用孟买HiMedia公司的商业抗生素盘[23]。使用的抗生素片如下:氨苄青霉素(30μ.G)，萘啶酸(30μ.氯霉素(30克)μ.链霉素(10 g)μ.g),卡那霉素(30μ.g)、头孢西丁(30μ.g），Novobiocin（30μ.G)和红霉素(10μ.G）。根据临床和实验室标准研究所（CLSI）评估这些分离株的抗生素易感性[23]。Vancomycin的最小抑制浓度（MIC）通过肉汤稀释方法进行，根据临床和实验室标准研究所（CLSI，2015）来区分VSSA从VRSA（CLSI）[24]。

2.8。检测梅卡，NUC，和PVL.基因

检测台面式晶体管,nuc,PVL.基因S.金黄色葡萄球菌通过PCR扩增测定使用基因特异性底漆对完成（表3.)．PCR程序在25μ.L PCR管和所含反应混合物中的每种反应混合物：2.5 μ.l PCR缓冲液(10X);1μ.l（1U / /μ.l) Taq DNA聚合酶;2μ.l dntps（每个200 mm）;1μ.l的每个底漆（10 pmol /μ.l）;2.5 μ.l（10 ng /μ.l）模板DNA;和15.75 μ.PCR级水。通过热循环仪（Eppendorf，Germany）中PCR热循环方法进行扩增，在94℃下开始初始变性2分钟，然后在33个循环中，每种循环包含94℃，1分钟，并在55°退火C对于45秒，50℃，50秒，50°C为45秒梅卡，NUC，和PVL.72°C延长45秒，最后72°C延长4分钟。ATCC 33591、ATCC 25923和ATCC 49775为阳性对照S.金黄色葡萄球菌在这些实验中分别使用。PCR扩增产物在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶(1μ.g/ml)，在Gel Doc™XR系统(Bio-Rad，美国)下，并拍照进行图像分析。DNA片段分别为147 bp、270 bp和433 bp梅卡，n,PVL.基因,分别。

2.9。实时聚合酶链反应PVL.基因

总RNA使用Pure Link™RNA Mini Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)提取，用紫外-可见分光光度计(Nano Drop 2000, Thermo Fisher)定量。用Verso cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific, USA)将总RNA转化为cDNA。标准反应包含1倍Power SYBR Green PCR主混合(Applied Biosystems)、引物对(表13.）和cDNA作为模板股。将40个循环的温度程序设定为在94℃下变性1分钟，并在55℃下退火30秒。在步骤一加96孔实时PCR系统（应用生物系统）上进行反应。样品以三份分析矩形A被用作正常化的内源性控制[25.]。

2.10。统计分析

使用Microsoft Excel进行数据分析和作图。利用Microsoft Excel计算各定量变量的均数和均数的标准误差。

3.结果

总共有25个非重复的隔离S.金黄色葡萄球菌来自印度西孟加拉邦Midnapore镇的不同贫民窟，并纳入本研究。样本采集自受试者的鼻拭子和浅表感染部位。25株分离株中，选择性MSA培养基分离出22株(88%)S.金黄色葡萄球菌通过不同生化试验的几种表型表达(表2)．所有S.金黄色葡萄球菌通过PCR使用物种特异性底漆对确认本研究中的分离物（表3.)．在本研究中，我们发现100%、91%和23%的分离株的过氧化氢酶、凝固酶和热稳定核酸酶阳性。分离的菌株中，68%、55%和68%分别产生蛋白酶、脂肪酶和非白色的色素菌落。电阻率S.金黄色葡萄球菌不同抗生素的影响范围从27到91%不等。电阻的S.金黄色葡萄球菌分离为氨苄青霉素（91％），萘啶酸（91％），氯霉素（36％），链霉素（27％），卡那霉素（55％），大氧嘧啶（68％），诺生物霉素（64％）和红霉素（82％）） 被找到。S.金黄色葡萄球菌对三种或三种以上抗菌素类别中至少一种药剂显示耐药性的菌株被标记为多药耐药菌株。因此,所有S.金黄色葡萄球菌本研究中分离的菌株被发现具有多重耐药性。在本研究中，MRSA的患病率为68%。还发现5%的被分离的S.金黄色葡萄球菌万古霉素是否是中间体和95%的分离物S.金黄色葡萄球菌是万古霉素敏感．所有菌株均未发现VRSA。在一般观察中，产生黏液的菌株在CRA培养皿中出现黑色菌落，而非产生黏液的菌株出现红色菌落。在社区获得性分离株中，22人中有15人(68%)S.金黄色葡萄球菌在37℃下孵育48小时后，菌株似乎是生产的。此外，在本研究中，发现7（32％）被发现为强生物膜成形，15（68％）分离物为中等生物膜成型。分离株没有生物膜阴性（图2)．27%(27%)的菌株被发现潜伏n基因(图3.)．梅卡和PVL.22个分离株中检测到17个(68%)和2个(9%)基因。所有的PVL.窝藏隔离拥有mec一个基因(图3.)．qRT-PCR中低的∆Ct值(0.493)表明高表达PVL.在一个S.金黄色葡萄球菌菌株（图4)．

4。讨论

在本研究中，在获得的隔离社区中观察到非常高的耐药率，特别是对青霉素和卡那霉素、头孢西丁、新生霉素和红霉素S.金黄色葡萄球菌菌株。2005年，Kazakova等人[26.[报告了一名社区相关的MRSA（CA-MRSA）克隆从美国脓肿的美国足球运动员分离出来。除了除去的大多数抗微生物剂之外，菌株易感β-lactams和大环内酯类。巴塔等人[27.报告发现梅卡来自临床和社区环境的56.8％的基因。在这项研究中，二十二个临床分离物中，十五（68％）分离物是粘液生产商。jain和agarwal [28.]的报告率较高，其中64%的葡萄球菌血管内分离物是生物膜的生产者。Zalipour等人[29.]报告了在伊朗临床标本中发现43株(54.4%)形成生物膜的细菌。在目前的研究中，7株(32%)菌株为强生物膜形成者，15株(68%)菌株为中度生物膜形成者。Mathur等人[30.]报告，57.8%的葡萄球菌临床分离株建立了生物膜阳性特征，14.47%和39.4%显示高和中度生物膜产生，在印度。MRSA在全球范围内的出现是一个严重的公共卫生问题，也是临床医生面临的挑战。各种因素导致了其耐药和致病性S.金黄色葡萄球菌．第一个PVL阳性MRSA在20世纪90年代后期注意到，近年来，这些菌株散落着全世界[31.]。PVL在促进毒力方面的作用S.金黄色葡萄球菌它们的致病性正在研究中。潘通-瓦伦丁杀白细胞素升高致病性S.金黄色葡萄球菌通过坏死，加速凋亡和多形核和单核细胞的损伤，从而促进死亡率和发病率[32.]。PVL通常被用作社区获得性MRSA的标记物，容易引起包括软组织在内的深层皮肤感染[33.，34.]。然而，在MRSA分离株中PVL的全球方案各不相同。世界其他地区报告的PVL患病率较低(法国5%，英国4.9%，沙特8.1%，孟加拉国14.3%)[32.，35.- - - - - -37.]反映了PVL在不同地理区域和社区的流行程度有显著差异。考尔等人[38.在MRSA和MSSA中，PVL的总体患病率为62.85% (MRSA: 85.1%， MSSA: 48.8%)，与目前的研究结果相比，MRSA中PVL的患病率更高。Johnsson等人[39.]检测到PVL.从65名患有S.金黄色葡萄球菌菌血症，两次（2.19％）分离株免皮肤感染，4例（7.27％）分离株55例呼吸道感染患者。rostamzad等。［40]报告的32株MRSA中，有13株(40.62%)呈阳性luk-pv医院的基因分离。与成年人和老年群体患者相比，观察到儿童的PVL（<14岁）的PVL患病率较高。在印度的另一项研究中进行了类似的观察结果[41.]。流行病学资料显示，社区获得性MRSA的高毒力与PVL.但是PVL与发病机制相关的直接证据仍然有限[42.]。QRT-PCR中的低ΔCT值（0.493）表示高表达PVL.基因S.金黄色葡萄球菌菌株在本研究中。然而，在以往的研究中luk-pv已经报道 [43.]。在金黄色葡萄球菌,毒素和其他因子的表达可以通过Panton-Valentine白细胞杀灭素(PVL)的表达来测定体内状况 [44.]。此外，表达PVL.的亚mic值增强β内酰胺抗生素(45.]。研究对象受健康教育程度较低，且常用β-内酰胺抗生素治疗任何类型的感染;这可能是高表达的原因PVL.基因在体外条件。因此,检测PVL.社区隔离基因S.金黄色葡萄球菌是致病性出现的迹象S.金黄色葡萄球菌在研究区域的群落设置中。

5.结论

目前的研究反映了多毒性耐高采烈的升高S.金黄色葡萄球菌社区感染。普遍存在PVL.本研究中MRSA分离株的基因含量较低。的存在PVL.对临床医生来说，像MRSA这样的耐多药细菌可能是致命的和具有挑战性的条件。研究对象受健康教育程度较低，且常用β- 酰胺抗生素;这可能是高表达的基本原因PVL.．因此,检测PVL.在社区隔离S.金黄色葡萄球菌表明致病的出现S.金黄色葡萄球菌在研究区域的群落设置中。

数据可用性

支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。

利益冲突

作者声明本论文的发表不存在任何利益冲突。

致谢

作者感谢参加该研究的个人。

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