山奈酚及其与氯喹联用的抗疟活性伯氏疟原虫感染小鼠

抽象

对于新的抗疟疾药物的研究已经成为一个迫切的要求由于对现有药物抵抗和缺乏有效的疫苗。在这方面，本研究的目的是评估山柰酚对抗疟活性伯氏疟原虫小鼠的感染体内模型。慢性毒性和单独和与氯喹联合山柰酚的抗疟疾活性进行了调查中p .鼠安卡使用标准程序感染ICR小鼠。该results showed that chronic administration of 2,000 mg/kg of kaempferol resulted in no overt signs of toxicity as well as no hepatotoxicity, nephrotoxicity, or hematotoxicity. Interestingly, kaempferol exerted significant (P以剂量依赖性方式<0.05）chemosuppressive，化学预防，和治疗活动。该highest antimalarial activity was found at a dose of 20 mg/kg which resulted in a significantly (P<0.05）延长感染的小鼠的存活。此外，氯喹和山奈酚组合治疗也呈现显著（P< 0.05)抗疟效果，但与氯喹治疗组无显著差异。从目前的研究结果可以得出结论，山奈酚具有可接受的抗疟活性。但是，应该对所观察到的抗疟活动的机制进行进一步调查。

1.简介

疟疾仍然是一个公共卫生问题，它是世界上最致命的寄生虫病特别是在许多热带和亚热带地区之一。疟疾是由雌性叮咬传播的一种疾病按蚊蚊子，这是由属的寄生虫感染疟原虫。全球估计有2.12亿疟疾病例，导致约44.5万人死亡，其中大多数发生在5岁以下的非洲儿童[1]。虽然有效的疫苗是疟疾最好的长期控制，对疫苗开发的研究尚处于临床前阶段，据预测，疟疾疫苗仍需要几年的时间[2]。然而，出现疟原虫现有的抗疟疾药物寄生虫抗药性，以及按蚊对杀虫剂灭蚊性可能使目前的一些管理手段无效而引发疟疾死亡率新崛起[3.]。因此，有必要寻找新的，安全的，和负担得起的抗疟疾药物对疾病的治疗。在这方面，药用植物是在寻找抗疟药的潜在资源。这是因为大多数这些植物中含有丰富的次生代谢产物，如已被报道具有抗疟活性黄酮类，萜类，生物碱，槲皮素4]。

山奈酚主要是茶叶，花椰菜，苹果，草莓，和豆类中发现的天然类黄酮。已报道和假设为具有几个活动，包括抗氧化剂，抗发炎，抗微生物剂，抗寄生虫的活性化合物，和抗癌[5]。此外，山柰酚也已经被描述到具有保肝和免疫调节性能[6,7]。以前，山奈酚是从叶子中分离出来的西南木荷对氯喹耐药是否有有效的抗疟活性恶性疟原虫(8]。然而，山柰酚抗疟活性对p .鼠特别是与氯喹的联合用药还没有报道。因此，本研究的目的是评估山奈酚单独使用和与氯喹联合使用的抗疟活性p .鼠感染的小鼠体内模型。

2。材料和方法

2.1。化学物质

氯喹二磷酸盐（CQ），并在此研究中使用的山奈酚是从Sigma（适马，化工，圣路易斯，密苏里州，美国）购买。所有试剂均为分析纯，并从供应商认证采购。

2.2。药物制剂

CQ (10 mg/kg)和山奈酚(1- 2000 mg/kg)新鲜制备于0.2 ml蒸馏水(DW)中，灌胃给药。

2.3。实验小鼠

所有实验均使用4-6周龄、体重在25 - 35 g之间的雌性ICR小鼠。实验小鼠来自泰国Mahidol大学国家实验动物中心。饲养温度为25±2℃，光照周期为每天12小时，饲喂颗粒饲料和清水自由采食。所有协议均按照国际动物保健和福利的指导方针进行。所有的动物实验都得到Walailak大学动物伦理委员会（WU006 / 2018）的批准。

2.4。口服慢性毒性试验

山奈酚的慢性口服毒性已根据经济合作与发展组织(OECD)的程序准则进行评估[9]。使用天真ICR小鼠（每组3只小鼠）的两组。One group was administered with 2,000 mg/kg of kaempferol, while the second group received distilled water (DW) as a control, daily for 30 consecutive days. The mice were observed for signs of toxicity which included (but were not limited to) salivation, paw licking, weakness, stretching of the entire body, respiratory distress, coma, and death in the first three hours, and subsequently daily for 30 days. For evaluation of the effect of kaempferol on mouse hematological and serum parameters, mouse blood was collected by cardiac puncture into heparinized vacuum tubes on day 31 after treatment. The complete blood count (CBC) and serum parameters for blood chemistry including aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), blood urea nitrogen (BUN), and creatinine were measured using automated analyzers (IDXX ProCyte Dx and Cobas c311, respectively).

2.5。伯氏疟原虫

氯喹敏感伯氏疟原虫ANKA株（PbANKA）用于疟疾的实验ICR小鼠诱导。这种寄生虫可以从疟疾研究和参考试剂资源中心（MR4获得;https://www.beiresources.org/Home.aspx）。感染PbANKA小鼠作为供体来源。寄生虫随后通过血液从供体感染的小鼠到天真的小鼠通过腹膜内（IP）注射每周连续传代维持。用20-30％的一个原虫的感染的供体小鼠处死，血液通过心脏穿刺入肝素的试管中。该blood was subsequently diluted with 0.9% normal saline solution (NSS) and infection undertaken by injecting 0.2 ml of the diluted blood which contained 1x10⁷通过IP注射寄生的红细胞。寄生虫血症每日通过吉姆萨的显微镜检查监测染色薄血涂片，并用以下公式计算的寄生虫血症。

2.6。山奈酚的抑制作用抗疟活性的评价

如前所述，使用标准的4天抑制试验对山奈酚的化学抑制抗疟活性进行了评估[10]。各组ICR小鼠(每组3只)接种1x10⁷PbANKA通过IP注射寄生红细胞。Two hours later, mice were administered 1, 10, and 20 mg/kg kaempferol by intragastric gavage followed by further administration once a day for 4 consecutive days (day 0-3). The untreated control mice were given 10 ml/kg of DW while the positive control mice were treated with 10 mg/kg of CQ. Moreover, the combination of 10 mg/kg of CQ and 20 mg/kg of kaempferol was also investigated. At day 4, parasitemia was determined and percent inhibition was then calculated using the following formula.

2.7。山奈酚的预防性抗疟活性的评价

山奈酚的化学预防潜力的评价是按照前面描述的方法进行的[11]。Groups of ICR mice (3 mice per group) were administered 1, 10, and 20 mg/kg kaempferol by intragastric gavage once a day for 4 consecutive days (day 0-3). Untreated control mice were given 10 ml/kg of DW while the positive control mice were treated with 10 mg/kg CQ. Moreover, the combination of 10 mg/kg of CQ and 20 mg/kg of kaempferol was also administered. At day 4, the mice were inoculated with 1x10⁷PbANKA通过IP注射寄生红细胞。七十二小时后，测定寄生虫血症，并如上所述，然后计算抑制百分比。

2.8。山奈酚的疗效抗疟活性的评价

山奈酚固化剂活性的评价进行了使用先前描述的方法[12]。各组ICR小鼠(每组3只)接种1x10⁷PbANKA通过IP注射寄生红细胞。Seventy-two hours later, these mice were treated with 1, 10, and 20 mg/kg kaempferol administered by intragastric gavage once a day for 4 consecutive days (days 0-3). Untreated control mice were given 10 ml/kg of DW while the positive control mice were treated with 10 mg/kg of CQ. Moreover, the combination of 10 mg/kg of CQ and 20 mg/kg of kaempferol was also investigated. At day 4, parasitemia was determined and percent inhibition was then calculated as described above.

2.9。平均存活时间的测定

实验小鼠的死亡率每日监测并记录天数由感染时间可达死亡在治疗组和对照组每只小鼠整个随访期间的数量。平均存活时间（MST），然后计算用下列公式每个组。

2.10。统计分析

数据的统计分析进行了使用GraphPad Prism（的GraphPad Prism软件公司，美国）。结果表示为平均值（SEM）的平均值±标准误差。使用单向ANOVA，随后进行Tukey事后检验来比较所测量的参数的平均值之间的差异。该P95%置信值< 0.05视为有统计学意义。

3.结果

3.1。山奈酚对小鼠的慢性口服毒性

山奈酚是由老鼠在为期30天给药耐受性良好。Chronic administration of 2,000 mg/kg of kaempferol did not result in any overt signs of toxicity. Hepatotoxicity (indicated by AST and ALT), nephrotoxicity (indicated by BUN and creatinine), and hematotoxicity were also ruled out due to a lack of a significant difference with values from control mice (Table1）。

3.2。山奈酚的抑制抗疟活性对伯氏疟原虫安卡

山奈酚施加一个显著（P<对PbANKA 0.05）剂量依赖性chemosuppression（图1）。该percentage inhibition at 1, 10, and 20 mg/kg of kaempferol was 16.79%, 31.87%, and 52.89%, respectively. The standard drug, CQ, showed a significant (P<0.001）90.11％的抑制，这是比在山奈酚处理的动物中抑制较高chemosuppressive效果。此外，显著（PCQ和山奈酚联合治疗也观察到化学抑制，但抑制与CQ治疗组无统计学差异。

3.3。山奈酚的预防性抗疟活性对伯氏疟原虫安卡

为确定山奈酚作为抗疟预防药物的有效性，小鼠连续4天给予1,10和20 mg/kg山奈酚，对照组给予10ml /kg DW或10mg /kg CQ。同时采用10 mg/kg CQ和20 mg/kg山奈酚进行联合处理。将寄生的PbANKA红细胞经IP注射接种4天。第8天，利用姬姆萨染色薄血涂片显微镜检查确定寄生虫血症。结果(图2)表明山奈酚具有显著的(P< 0.05) chemoprophylactic activity of 24.47% and 40.80% at the doses of 10 and 20 mg/kg, respectively, while the CQ treated showed significant (P<0.001）71.45％抑制化学预防效果。此外，80.01％的抑制在组合治疗CQ和山萘酚的被发现。但是，有有和无山奈的CQ治疗的小鼠之间没有统计学差异显著。

3.4。山奈酚对柏氏疟原虫的治疗性抗疟活性

为了评估小鼠山萘酚的固化剂效力接种PbANKA寄生红细胞连续4天。On day 4 and for the following 3 days, mice were administered 1, 10, and 20 mg/kg of kaempferol. Control mice received either 10 ml/kg of DW or 10 mg/kg of CQ. A combination treatment was also performed with 10 mg/kg of CQ and 20 mg/kg of kaempferol. Parasitemia was determined on day 8 by examination of Giemsa stained thin blood smears. Results (Figure3.)，表明山奈酚治疗可导致显著(P< 0.05)降低寄生虫血症，抑制率分别为22.59%和36.63%，剂量分别为10 mg/kg和20 mg/kg。CQ治疗组显示显著(P< 0.001)降低寄生虫血症，抑制率为70.64%，与联合治疗小鼠(72.92%)的抑制水平相似。

3.5。山奈酚对小鼠的平均存活时间的影响

该efficacy of kaempferol in mice at all doses, except that of 1 mg/kg, was correlated significantly (P<0.05）具有增加的平均存活时间（MST）比未经处理的对照动物（表2）。的CQ的MST治疗和组合治疗组也显著（P相比于未处理的对照动物<0.001）增加。在组合治疗，然而，MST为不从CQ处理组显著不同。

4。讨论

山奈酚的抗疟疾活性，无论单独或与CQ针对PbANKA感染小鼠抑制，预防和治疗试验相结合，进行了调查。Assessment of the chronic toxicity of kaempferol showed no visible signs of toxicity, hepatotoxicity, nephrotoxicity, hematotoxicity, or death of the mice after oral administration of 2,000 mg/kg of kaempferol daily for 30 days. Hence, the kaempferol can be considered safe according to the OECD guideline which recommends a maximum dose of 2,000 mg/kg for assessing toxicity [13]。该结果还表明，山奈酚显著抑制PbANKA生长以剂量依赖的方式。该highest activity was observed at a dose of 20 mg/kg with percent inhibition of 52.89%, 40.80%, and 36.63% for chemosuppressive, chemoprophylactic, and curative experiments, respectively. The standard 4-day test is a standard test commonly used for antimalarial screening体内其中≥30％的抑制在处理后的寄生虫血症使化合物被认为是活性[14]。本发现与以前的研究调查的协议为疟疾治疗中使用山奈酚[15]。也有报道称山奈酚对氯喹耐药表现出抗疟活性恶性疟原虫24小时后，IC50为106μM [8]。因此，山奈酚的抗疟活性可能主要依赖于它的抗氧化和抗癌活性。从活性氧物种的形成（ROS）产生的氧化应激在疟疾感染中起关键作用。过程中的红细胞疟原虫，副产物的毒性的传播其原因血红蛋白降解产生[16]。此外，感染过程中活化的单核细胞和中性粒细胞也会产生ROS和氧化应激[17,18]。它也表明，疟原虫通过脂质过氧化反应引起细胞膜损伤感染者和未感染的红细胞[19,20]。作为类黄酮，山柰酚能够抑制氧化应激，ROS形成，和脂质过氧化[21- - - - - -23，其抗氧化和抗疟活性之间存在相关性[4]。此外，抑制糖原合酶激酶-3β（GSK3β）疟疾寄生虫已被报道的山奈酚的抗疟作用的分子基础[24]。GSK3已经说明了主机响应疟疾感染中发挥关键作用[25]。因此，山柰酚在本研究的抗疟作用可能是通过GSK3的抑制作用所介导β。

山奈酚已经通过胱天蛋白酶级联和MAPK途径[诱导凋亡描述为具有抗癌性质的26- - - - - -28]，其类似于青蒿素，有效抗疟药当前正在使用，这也已被报道具有抗癌和相关有效的抗疟活性[29]。因此，可以假设的是，抗氧化剂和山奈酚的抗癌性质可以负责在本研究中观察到的抗疟活性。

MST是评价试验化合物抗疟活性的另一个参数。因此，导致存活时间大于未治疗组的试验化合物被认为是活性的[三十,31]。This study showed that infected mice treated with 10 and 20 mg/kg of kaempferol lived significantly longer than animals in the untreated group. However, the sample sizes were small; it does allow researchers to focus on really big effect sizes. These findings provide a basis for further investigations of kaempferol as a potential candidate compound for antimalarial drug development.

5。结论

最高剂量2,000 mg/kg口服山奈酚无不良反应，说明该化合物对小鼠的安全性。山奈酚单独和联合CQ均具有合理的抗疟活性，并显著延长PbANKA感染小鼠的生存时间。20 mg/kg剂量的山奈酚被观察到具有最强的抗疟活性，特别是在化学抑制方面。然而，这些发现只是初步的，因此建议进一步研究山奈酚发挥其抗疟活性从而导致PbANKA感染小鼠MST延长的机制。

数据可用性

用于支持本研究的结果的图形数据已被沉积在figshare（DOI：10.6084 / m9.figshare.6981866或https://figshare.com/s/4289e1f86751ca8ffd49）。

的利益冲突

作者声明有兴趣对此手稿的出版没有冲突。

致谢

瓦莱拉克大学联合健康科学学院为这项研究提供了物质援助，并承担了一些费用，这一点得到了高度认可。该报告的作者还非常感谢副教授Chuchard Punsawad博士提供了疟原虫。这项工作得到了瓦拉拉克大学研究与创新研究所的支持(批准号:批准号:627)。WU_IRG61_08, 2017) (https://figshare.com/s/4289e1f86751ca8ffd49DOI：10.6084 / m9.figshare.6981866）。

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