OmpA-Like蛋白质的Porphyromonas Gingivalis.介导对抗菌肽LL-37的耐药性

摘要

龈下细菌持续暴露于由血清产生的龈沟液中，其中含有各种杀菌剂。periodontopathic细菌Porphyromonas Gingivalis.已被证明具有多种能力，以抵抗杀菌剂，由于它能够繁殖在牙龈下环境。我们之前证明了主要的表面糖蛋白P. Gingivalis.-PGM6和PGM7，也称为外膜蛋白A样蛋白（OMPALPS） - 对人血清的杀菌活性进行抗性，但它们的确切作用仍然未知。在这项研究中，我们研究了野生型和PGM6 / PGM7缺陷的敏感性P. Gingivalis.主要抗菌肽在口腔，人β-防卫素(hBDs) 1-3和人抗菌肽LL-37。hBDs对两种细菌均表现出较弱的杀菌活性。LL-37对野生型菌株也表现出较弱的活性;但对Pgm6/ pgm7缺失菌株表现出显著的活性。在Pgm6/ pgm7缺失菌株中，LL-37显著聚集在细菌细胞表面，可能导致外膜的破坏。此外，在LL-37的存在下，hBDs对Pgm6/ pgm7缺陷菌株的杀菌活性得到协同促进。我们的结果表明，OmpALPs特别保护P. Gingivalis.l -37的杀菌活性;因此,P. Gingivalis.可能在LL-37生产的龈下环境中熟食地生存。

1.介绍

Porphyromonas Gingivalis.是一种革兰氏阴性厌氧菌，是人类最重要的牙周病病原体之一[1］．在成人中，这种细菌在潜在的植物群中繁殖，其比例随着牙周炎的严重程度增加而增加[2，3.］．P. Gingivalis.扰乱寄宿机制的各种能力[4，5]，改变牙龈下菌群的细菌组成[6，这反过来又会促进牙周炎的发展。此外，P. Gingivalis.在潜在植物植物中繁殖的植物繁殖造血以诱导异源感染，影响心血管疾病，阿尔茨海默病和早产[4，7，8］．

龈下细菌不断暴露于衍生自血清的牙龈沟槽液，其含有各种杀菌剂[9，10］．传播P. Gingivalis.在这样的环境中，依赖于它抵抗杀菌剂的强大能力。例如,P. Gingivalis.通过生产大规模蛋白酶来降解补体组分和抗体[11，12］．此外，P. Gingivalis.将补体抑制剂C4BP招募到细菌细胞表面，以灭活补体[13]并为表面保护产生荚膜多糖[14］．此外，我们最近证实了主要的表面糖蛋白P. Gingivalis.-PGM6和PGM7，也称为外膜蛋白A-（OMPA-），如蛋白质（OMPALPS），使用突变体对人血清的杀菌活性的抗性至关重要P. Gingivalis.在编码OmpALPs的两个基因中有缺陷的菌株[15］．然而，ompalp介导的血清耐药的确切机制尚未阐明。

OmpALPs Pgm6和Pgm7被合成为O相关糖蛋白(16]被认为是形成异围体或同种型蛋白的跨膜蛋白[17］．我们证明了三个ompalp缺陷菌株(一个pgm6缺陷菌株，一个pgm7缺陷菌株和一个pgm6 /7双缺陷菌株)不能在血清或含血清的培养基中生长，尽管它们在细菌培养基中正常生长[15］．与野生型菌株类似，IMPALP缺陷型菌株表现出正常的蛋白酶产生活性，表明IMPALP缺陷菌株的血清抗性受损不涉及蛋白酶合成。此外，IMPALP缺陷菌株不能在热灭活的血清中存活，但它们获得蛋白酶K-处理的血清中生长的能力[15］．这表明OmpALPs可以介导对杀菌蛋白或肽的抵抗，排除热不稳定蛋白，如补体。

抗菌肽是口腔先天免疫系统的主要组成部分，包括龈沟液[9，18，19］．特别是对人的阳离子抗菌肽β-防御素(hBD) 1、hBD2、hBD3和人类抗菌肽LL-37肽是预防牙龈下牙周源性细菌感染的重要保护剂，包括P. Gingivalis.［9，20.，21］．此外，与传统的抗菌药物相比，阳离子抗菌肽不会引起耐药性[22］．在本研究中，我们旨在调查OMPalps的作用P. Gingivalis.在抵抗这些抗菌肽的杀菌活性。

2。材料和方法

2.1。试剂

抗菌肽hBD1、hBD2、hBD3和人LL-37均来自日本大阪肽研究所(Peptide Institute)。

2.2。细菌菌株和生长条件

P. Gingivalis.ATCC 33277为野生型菌株。通过删除得到3株ompalp缺失突变株(Pgm6-deficient、Pgm7-deficient和Pgm6/Pgm7双缺陷)pg0695和/或pg0694如前所述的野生型菌株[15］．如前所述，这些菌株在补充的胰蛋白酶大豆肉汤（STSB）中进行了厌氧生长[15］．

2.3。细菌ATP产生的检测

将细菌菌株培养到STSB中的对数相，1×10⁷细菌细胞悬浮在25μL新鲜的STSB，然后添加75μL含有各种浓度的抗微生物肽的空白磷酸盐缓冲盐水（PBS）或PBS。在厌氧孵育6小时后，通过ATP生产评估细菌存活。细菌培养（100μl)和BacTiter Glo微生物细胞活力检测试剂盒(美国麦迪逊Promega)试剂(100μl)混合在96F未处理的白色Microwell SI板(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)的孔中。使用Infinite M200 PRO平板阅读器(Tecan, Seestrasse, Switzerland)以相对光单位(rlo)测量生物发光。细菌存活率(%)计算为100×(实验RLU)/(对照RLU)，其中对照RLU的值来自添加到空白PBS中的细菌培养物。数据用平均值±标准差(SD;n= 3)。给出了三个以上独立实验的代表性结果。

2.4。细菌活/死荧光染色

菌株在5μM LL-37 24小时。细菌细胞的外膜完整性和可生存性由细菌活/死染色试剂盒（Promokine，Heidelberg，德国）评估，包括用于活的和死细菌细胞和红色荧光染色乙酸酯-III的绿色荧光染色DMAO（ETHD-III）用于死细菌细胞。通过将细菌细胞与DMAO和乙烯-III的混合物孵育15分钟来进行染色。使用BZ-8000荧光显微镜（Keyence，Osaka，Japan）立即成像染色细胞。

2.5。细菌表面的免疫荧光LL-37

菌株在LL-37的存在下厌氧培养(5μ米)1 h。细菌细胞被离心收集,洗两次与PBS随后发现涂载玻片和4%多聚甲醛固定10分钟。固定细胞被封锁在PBS 3% BSA 1 h。细胞然后沾LL-37小鼠单克隆抗体(sc - 166770;圣克鲁斯生物技术;和Alexa 488标记的抗小鼠IgG抗体(Thermo Fisher Scientific)。染色细胞在延长黄金抗褪色试剂(Thermo Fisher Scientific)的存在下嵌入。使用BZ-8000荧光显微镜拍摄图像。

2.6。统计分析

在结果图中2和4，数据分析使用双因素方差分析(ANOVA)，然后Dunnett 's多重检验比较组之间的利益。在图的结果中1，p使用学生计算价值t-测试。双尾p值< 0.05被认为是显著的。

结果

3．1．ompalp缺陷的高灵敏度P. Gingivalis.菌株LL-37

我们调查了野生型和OMPALP缺乏菌株到抗微生物阳离子肽HBD1，HBD2，HBD3和LL-37的敏感性。增长P. Gingivalis.sTSB培养基中的菌株先前被证实是相同的[15］．用不同浓度的抗菌肽处理这些菌株的对数相细菌培养。通过测定培养物中ATP的产生或对细菌细胞进行DMAO/EthD-III荧光染色来评估细菌存活。

HBD1几乎影响了野生型和PGM6 / PGM7缺陷菌株的生存率为0.156 - 5μm在6小时的时间范围内（图1(一)）.HBD2仅在5时对野生型菌株表现出轻微的杀菌作用μM(图1(一)）.hBD2对Pgm6/ pgm7缺陷菌株的杀菌效果略强于对野生型菌株的杀菌效果，杀菌量为0.156-5μM. HBD3几乎影响了野生型应变的存活率为0.156-5μM，但降低了2.5 - 5的PGM6 / PGM7缺陷菌株的存活率μM(图1(一)）.LL-37在1.25 - 5时对野生型菌株的存活率影响较小μM(图1(一)）.另一方面，LL-37对Pgm6/ pgm7缺失菌株在0.625-5时表现出显著的杀菌效果μM，显着高于野生型菌株（图1(一)）.在长达48小时的时间过程研究中，hBD1治疗时间为5μM几乎不影响野生型和Pgm6/ pgm7缺陷株的存活(图1 (b)）.值得注意的是，Pgm6/ pgm7缺陷菌株在5岁时经LL-37处理后几乎死亡μM，而野生型菌株仅受轻微影响(图1 (b)）.DMAO/EthD-III染色显示野生型细菌细胞几乎完好无损。而ll -37处理的Pgm6/ pgm7缺失菌株外膜的完整性完全丧失，死亡细胞聚集(图)1 (c)）.

我们进一步研究了单突变株(缺pgm6和缺pgm7)对hBD1和LL-37的敏感性。hBD1几乎不影响被测菌株的存活(图2（a））.LL-37显著降低了所有突变株的活力，但与Pgm6/Pgm7双缺陷菌株相比，单突变株的LL-37杀菌活性略有降低(图)2（b））.

因此，OMPalps可以作为外膜的保护因子，其中LL-37的抗微生物活性受到损害。

3．2．OmpALPs保护P. Gingivalis.通过阻止LL-37在细胞表面的积累来抑制细胞

接下来，我们研究了OmpALPs的保护机制P. Gingivalis.来自LL-37的杀菌攻击的细胞。用5种野生型和PGM6 / PGM7缺乏菌株μM的L1-37含量为1小时，然后通过免疫荧光染色可视化LL-37的存在。在野生型菌株中，在细菌细胞表面上几乎没有检测到LL-37，并且观察到较少数量的LL-37点（图3.,左图像)。相反，在Pgm6/ pgm7缺陷的细菌细胞中，LL-37强烈聚集在表面(图3.,对图片)。因此，ompalp可能保护了P. Gingivalis.通过抑制LL-37在细胞表面的积累来抑制细胞。

3.3。hBDs对ompalp缺陷的杀菌活性P. Gingivalis.应变由LL-37协同促进

我们进一步测试了与LL-37中的一种HBD的组合是否可以增强杀菌活性。在野生型菌株中，尽管唯一处理HBD1，HBD2，HBD3或LL-37，在5时μM，几乎没有显示出与图一致的杀菌效果1， LL-37与hBD，特别是与hBD2联合时，效果略有增强(图4）.在PGM6 / PGM7缺陷的菌株中，与图一致1(一)而hBD1、hBD2和hBD3则没有很强的杀菌作用(图)4）.值得注意的是，在LL-37的存在下，hBD的作用，特别是hBD2的作用是协同增强的(图4）.因此，Pgm6/ pgm7缺失菌株对LL-37的杀菌活性变得敏感，这可能使hBDs发挥其通常被OmpALPs抑制的杀菌活性。

4.讨论

我们以前的结果表明，由于OMPalp缺陷菌株在热灭活的血清中不能存活，但oMPalps在对某些杀菌剂中发挥着至关重要的作用，但在热灭活的血清中不能存活，但具有在蛋白酶K治疗血清中存活和生长的能力[15］．在本研究中，我们发现缺乏ompalp的菌株对LL-37的杀菌活性变得敏感。此外，虽然hBDs对野生型和ompalp缺陷菌株的杀菌效果都不理想，但在LL-37存在时杀菌效果显著。我们的研究结果表明，OmpALPs是重要的保护因素P. Gingivalis.细胞特别是来自LL-37的杀菌活性。在没有OMPALPS的情况下，LL-37积累了P. Gingivalis.细胞表面可能导致细胞表面破坏，使得其他杀菌剂能够施加其活性，这通常被Ompalps抑制。因此，使用OMPalps，P. Gingivalis.可在含有LL-37和其他杀菌剂(包括hbd)的龈沟液和龈下环境中熟练生存。

本研究中使用的所有抗菌肽都具有阳离子性质，并且已知通过类似的机制对多种细菌具有强效杀菌活性[23，24］．LL-37可以对缺乏OMPalp缺陷菌株表现出显着的杀菌活性，但所有HBD都施加了弱杀菌效应P. Gingivalis.无论ompmp在场与否。LL-37是两亲性的α-螺旋肽，其中亲水氨基酸形成螺旋带正电荷的一边，疏水氨基酸形成螺旋带负电荷的相反一边[25］．带正电荷的侧与细菌细胞膜中带负电荷的磷脂亲水头相互作用，而疏水侧与细菌细胞膜的疏水脂核相互作用[23，24］．此外，LL-37带正电的一面与带负电的脂多糖部分相互作用以中和它们的活性[26］．因此，LL-37插入细菌的脂质双分子层并穿孔，使其分解为碎片[21］．我们的研究结果表明，LL-37的这种杀菌活性可以由opalps在表面上纯粹抑制P. Gingivalis.细胞。OmpALPs影响LL-37的确切机制有待于未来的研究来阐明。此外，解释hBDs为什么能对ompalp缺陷发挥有效的杀菌作用也很重要P. Gingivalis.只有在LL-37在场的情况下。

我们比较了具有野生型菌株的三种缺陷的三种缺陷（PGM6缺陷，PGM7缺陷和PGM6 / PGM7双缺陷）菌株的LL-37抗性表型。据报道，OMPALP蛋白PGM6和PGM7形成PGM6 / PGM7异偶体或PGM7同型聚合物，但PGM6均方格易于降解[17]，表明这两个三聚体对OMPalps的功能负责。在本研究中，我们观察到，与PGM6 / PGM7缺陷菌株的菌株相比，在单一突变菌株中略微降低LL-37的杀菌活性。该结果表明，除了PGM6 / PGM7异络器和PGM7同型聚合物之外，PGM6同源均同性计还可能对LL-37的抗性负载。这可能与前一个结果不一致，表明PGM6同源素不起作用[17］．

OmpALPs Pgm6和Pgm7的c端区域与Pgm6和Pgm7的c端区域高度相似大肠杆菌OMPA [27］．OMPA的N-末端结构域具有八绞合结构，并被认为用作Porin [28]，而Ompalps在N-末端只有一个推定的跨膜区域，其假设以不起脉素[17］．OmpA在肠杆菌科细菌中高度保守[28]，而OmpALPs在Porphyromonadaceae家族的细菌中比较保守[15］．目前已知OmpA参与各种致病过程，包括细胞粘附、细胞侵袭、细胞内生存、血清抵抗和杀菌剂抑制活性[28］．正如我们已经证明的，OmpALPs负责血清耐药性和杀菌剂活性的抑制，OmpALPs和OmpA可能有相似的生物学功能。有必要确定其他细菌物种是否对LL-37的杀菌活性表现出OmpALP-或ompa -介导的耐药性。

结论

综上所述，主要的表面糖蛋白P. Gingivalis.OmpALPs被发现介导对LL-37杀菌活性的耐药性。此外，hbd即使对ompalp缺乏也很难发挥令人满意的杀菌效果P. Gingivalis.，当LL-37存在时，它们具有显著的杀菌作用。未来的研究可能进一步揭示OmpALPs对抗菌药物保护活性的特异性。此外，还应确定是否靶向OmpALPs的功能或产生导致抑制P. Gingivalis.感染或有助于治疗慢性牙周炎。

数据可用性

支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

我们感谢安倍首相的技术援助。我们也感谢Y. Murakami提供的菌株。该手稿由Editage (www.editage.jp)进行英文编辑。本研究由日本科学促进协会(JSPS)对T.H. (17K17114)、M.I. (18K09544)和T.I. (18K09561)的科学研究资助(KAKENHI)。

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