比较算法的检测肠道病毒的粪便样本儿童被诊断为急性弛缓性麻痹

文摘

本研究旨在比较依赖于细胞培养和独立推荐的肠道病毒检测算法和评估是如何影响我们的知觉的肠病毒类型出现在一个样本的多样性。十六个配对样本(16隔离从RD细胞培养及其相应的凳子上悬挂,即。32个样本)在尼日利亚AFP病例进行了分析。所有的样品都进行RNA提取,互补脱氧核糖核酸的合成,世卫组织建议RT-snPCR,及其修改。扩增子测序菌株鉴定。肠病毒多样性是相同的隔离和粪便悬架的控制和五个样品。然而,不同的其余10(62.5%)样品。9 (CV-B4 E6、E7 E13, E14灯头,E19, E29, EV-B75,和EV-B77)和5 (CV-A1、CV-A11 CV-A13, EV-C99,和兵)EV-B和EV-C类型,分别被检测到。特别是,E19 EV-B75只有从隔离而E14灯头中恢复过来,EV-B77, CV-A11, CV-A13只从粪便悬架中恢复过来。细胞培养的依赖和独立协议偏见的看法肠病毒类型出现在一个样本的多样性。因此,应针对协调努力增加灵敏度。

1。介绍

肠道病毒(EVs)属于属肠病毒Picornavirales引起家人和秩序。有13种的属,物种属的物种C类型的脊髓灰质炎病毒作为其最好的研究成员(1]。电动汽车是nonenveloped和二十面体病毒衣壳对称和直径28 - 30 nM。基因组是一个~ 7.5 kb,单链腺苷,正链RNA共价链接病毒蛋白(VPg) 5′末端。一个开放阅读框(ORF)基因组两侧是两个区域(5′UTR和3′UTR)。大型多蛋白翻译从单一ORF处理产生四种结构蛋白(VP1、VP2、VP3, VP4)和7个非结构蛋白。序列的VP1区已经与EV(血清型2),现在用于电动汽车类型的识别。

大多数肠病毒多样性信息,可用在过去三十年的全球根除小儿麻痹疾病计划(GPEI)。因此,大多数这些电动车隔离(脊髓灰质炎病毒(pv)和non-polio肠道病毒[NPEVs])被找到后,世卫组织建议的基于细胞培养肠道病毒检测算法(3,4]。目标(根除脊髓灰质炎病毒)GPEI触手可及,有合理的担忧设施相关的脊髓灰质炎病毒进入社区,逃脱后根除(5]。因此,作为终局策略的一部分,正在努力限制全球脊髓灰质炎病毒在细胞培养中研究一些设施(称为基本设施)和相关的基础设施来预防和控制设施逃脱病毒(5]。

促进这一限制的实现在不久的将来,有明显的动机发展非常敏感的细胞培养独立的脊髓灰质炎病毒(和其他NPEVs)监测策略(6- - - - - -8]。符合这一点,一个细胞培养独立的算法由Nix et al。6)已包括在肠病毒检测和识别分析世界卫生组织推荐的(9]。我们最近显示(10]这世卫组织建议的细胞培养独立的肠道病毒检测算法(9)遗漏了肠病毒合并感染。这有助于低估一个非常常见的仪器条件的循环疫苗衍生脊髓灰质炎病毒2(2型循环疫苗衍生脊髓灰质炎)爆发11在尼日利亚,持续了近十年。因此,我们所描述的修改分析扩大产能,从而促进检测和解决合并感染(10,12]。

的偏见(13,14和局限性10,12)的细胞培养相关的(4和独立9)算法,本研究旨在评估一个开关的影响在未来从前者到后者。进一步,研究如何将这些算法与合并感染(物种)分辨率分析影响我们感知的肠病毒类型出现在一个样本的多样性。这个研究发现,细胞培养相关的(4和独立9)算法有其优点和缺点,不可避免偏见的看法肠病毒类型出现在一个样本的多样性。它展示了需要最大化的好处所有可用的策略,以更好地描述肠道病毒的多样性在任何感兴趣的样品。最后,本研究文件的第一个描述尼日利亚EV-B77应变。

2。方法

2.1。样品收集

16路积极的隔离和相应的悬浮液(共32个样本,即。16双隔离从细胞培养和粪便悬架)进行了分析研究。收集的样本国家脊灰实验室在病毒学、医学院尼日利亚伊巴丹大学(后来被称为脊髓灰质炎实验室)。十的样品来自5例(即。,double stool samples collected at least 24 hours apart from the same case). The remaining six samples were single ones from six cases. One of these six samples was previously identified and confirmed by the Polio Lab as poliovirus 2 (PV-2). All the samples analyzed in this study were collected as part of the National Acute Flaccid Paralysis (AFP) surveillance programme. The samples were collected from children ≤ 15 years presenting with AFP between July and August 2015. The algorithm followed in this study is depicted in Figure1。

2.2。RNA提取和互补脱氧核糖核酸的合成

RNA提取分离和独立悬挂使用Jena生物科学总RNA提取工具包(Jena生物科学,耶拿,德国)后,制造商的指示。互补脱氧核糖核酸的合成,耶拿生物科学脚本互补脱氧核糖核酸合成装备(Jena生物科学,耶拿,德国)是根据制造商的指示使用。从提取、5.25μL病毒RNA被添加到4.75μL互补脱氧核糖核酸合成的混合。4.75μ包含2 L的互补脱氧核糖核酸的合成μ0.5 L的脚本RT缓冲区,μ0.5 L的核苷酸μ0.5 L德勤股票的解决方案μ0.25 L核糖核酸酶的抑制剂μL(脚本逆转录酶,和0.25μ每个引物AN32-AN35 L。的混合是在42°C的环境中10分钟紧随其后为60分钟50°C Veriti热循环(美国应用生物系统公司,加州)。

2.3。聚合酶链反应

第一轮PCR反应(图1)共有30μL反应。反应混合物包含6μ13.4 L的红色负载Taq,μL核糖核酸酶的自由水,0.3μ引物224和222 L, 10μL的互补。热循环中完成Veriti热循环(美国应用生物系统公司,加州)如下:94°C 3分钟,然后45 94°C的周期为30秒,30秒42°C, 60秒和60°C, 40%的坡道从42°C到60°C。这是紧随其后的是72°C 7分钟,举行4°C,直到反应终止。

四(PE-VP1-PCR EA-VP1-PCR、EB-VP1-PCR EC-VP1-PCR [9)不同的第二轮PCR检测运行在本研究(图1)。2 nd-round PCR分析也是一个30μL反应。PCR反应混合包含6μ18.4 L的红色负载Taq,μL核糖核酸酶的自由水,0.3μ正向和反向引物L, 5μL的第一轮PCR产物。热循环中完成Veriti热循环(美国应用生物系统公司,加州)。循环条件是94°C 3分钟紧随其后的是45 94°C的周期为30秒,30秒42°C,和扩展为30秒,60°C和40%的坡道从42°C到60°C。这是紧随其后的是72°C 7分钟,随后在4°C,直到反应终止。PCR产品解决2%的琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色的,是通过紫外线透照器查看。

2.4。扩增子测序

PCR扩增子的积极反应的四个轮PCR检测被运到Macrogen Inc .,首尔,韩国,扩增子净化和测序完成。使用各自的正向和反向引物测序完成的四个化验。随后,使用肠病毒的基因工具(15)和序列数据,测定肠病毒基因型和物种。

2.5。加入核苷酸序列号码

从这项研究中获得的序列已经存入与加入数字MF686545-MF686568基因库。

2.6。系统发育分析

的CLUSTAL在大型项目5软件(16)是使用默认设置对齐肠病毒类型的序列(s)尼日利亚菌株的第一次描述了在这个研究与那些从基因库中检索。随后,使用相同的MEGA5 neighbor-joining树构建软件(16)与Kimura-2参数模型(17]和1000年启动复制。加入数字的序列从基因库中检索分析表明在phylograms序列的名字。

3所示。结果

3.1。聚合酶链反应(PCR)测定

预期的~ 330 bp片段被成功放大的化验。为PE-VP1-PCR16路隔离的屏幕,这个屏幕,93.9%(15/16)是积极的,75.0%(12/16)相应的悬挂也积极。为EA-VP1-PCR屏幕中,75.0%(12/16)的RD隔离阳性为62.5%(10/16)的相应的悬浮液。为EB-VP1-PCR屏幕上,87.5%(14/16)和68.8%(11/16)的RD隔离和相应的悬浮液是积极的,分别。同时,为EC-VP1-PCR屏幕上,50%(8/16)和37.5%(6/16)的RD隔离和相应的悬挂是积极的,分别为(表1)。

3.2。肠病毒基因分型

16路隔离,十五被放大,成功测序,并输入PE-VP1-PCR屏幕使用肠病毒的基因工具。他们的身份是:E7(3隔离),E19(2隔离),E29(1隔离),EV B75(1隔离),简历A1(1隔离),E6(2隔离),E13(4隔离),和兵(1隔离)。EA-VP1-PCR屏幕,十二个RD隔离成功放大,但三人成功类型和他们的身份是:EV-C99(1隔离)CV-A1分离(1),和兵(1隔离)。EB-VP1-PCR屏幕,十四路隔离成功放大,测序,类型和他们的身份是:E19(2隔离),E7(3隔离)E6(2隔离)、E13(4隔离),E29(1隔离)EV-B75(1分离)和CV-B4(1隔离)。EC-VP1-PCR屏幕,九路隔离放大,但两人成功的类型和他们的身份是兵(1)隔离,EV-C99分离(1)(表2)。总体来说,十种血清型鉴定的RD隔离PCR屏幕组成物种B(70%)和物种C(30%)(表3)。

相应的16悬浮液,十二(12/16)放大,但十(10/16)成功测序和类型化PE-VP1-PCR屏幕,他们的身份是:E7(1株)E13(3株)E29(1株)电动车B77(1株)简历A1(1株)E6(2株),兵(1株)。EA-VP1-PCR屏幕,八悬浮液被放大,测序,类型和他们的身份是:EV-C99(2株),CV-A11(1株)CV-A13(2株),CV-A1(1株)兵(1株)和E29(1株)。EB-VP1-PCR屏幕,十二个放大,但十成功测序类型,和他们的身份是:E13(3株),E14灯头(1株)E6(2株)E7(1株)CV-B4(1株)E29(1株)和EV-B77(1株)。EC-VP1-PCR屏幕,六悬浮液成功放大,测序,类型和他们的身份EV-C99(2株),CV-A13(2株),兵(1株)和CV-A1(1株)(表2)。总的来说,确定了十二种血清型的悬浮聚合酶链反应屏幕组成物种B(58.3%)和物种C(41.7%)(表3)。

肠病毒多样性显示相同的控制(S / N 16)和33.3%(5/15)的样品分析(表2)。精确,肠道病毒的多样性之间相同的RD细胞培养分离和粪便悬架控制16 (S / N), 4例,5,6,7,9(表2)。肠道病毒的多样性,然而,RD细胞之间不同的文化隔离和粪便悬架剩余的66.7%(10/15)的样本对分析(表2)。

总之,14个不同的肠道病毒类型被确定在本研究中。更精确地说,九(CV-B4 E6、E7、E13 E14灯头,E19, E29, EV-B75,和EV-B77)和5 (CV-A1、CV-A11 CV-A13, EV-C99,和兵)EV-B和EV-C类型,分别是在这项研究中发现(表3)。有必要强调单一兵在本研究中发现提供的控制脊灰实验室。

3.3。EV-B77发展史

这是第一个EV-B77应变描述在尼日利亚和撒哈拉以南非洲地区第二直到日期。系统发育树的拓扑结构表明EV-B77在这项研究中发现不同于被描述至今为止。更重要的是,它不同于只有撒哈拉以南非洲应变描述至今2003年恢复在中非共和国(图2)。

4所示。讨论

4.1。直接检测临床标本和文化在RD细胞系

从这项研究中,观察到更多的肠道病毒检测每PE-VP1-PCR试验样本的后悬架已经受到文化RD细胞系。例如,1 b(表2)隔离被确认为E19虽然没有证据表明肠病毒出现在相应的悬挂。在相同的光,隔离情况下(表4 b和52)被确定为E13虽然也没有在相应的悬浮液肠病毒存在的证据。考虑肠道病毒检测在隔离和凳子悬浮液的其他样本甚至≥24小时对样品的一些问题,观察不太可能是由于非特异性PCR抑制剂的存在。相反,这一发现表明,在粪便悬架,病毒滴定度可能是过低(即。,低于检出限的测定)直接检测。然而,RD细胞培养似乎增加了病毒滴定度水平,随后由PE-VP1-PCR试验检测。这从而验证的价值和使用细胞培养肠道病毒检测和识别显著增加病毒滴定度,从而提高我们的能力来检测和识别病毒类型。

然而重要的是要注意,虽然有些电动车类型在粪便暂停和恢复RD细胞培养、某些类型似乎是专门在每个检测算法(表中恢复过来3)。肠病毒多样性被证明是相同的RD细胞培养分离和粪便悬架之间的控制和5/15(4例,5 b, 6、7、9)对样例的分析。然而,剩下的10/15(66.7%)样品对不同分析。特别引人入胜的是观察到在某些情况下肠病毒隔离PE-VP1-PCR试验检测到的RD细胞培养上清液中不同于中检测出相应的悬挂。例如,在案例9(表2),隔离被确认为EVB75虽然EVB77(首次发现在尼日利亚)中确定相应的悬挂。另外,在案例1(表2)被确认为E19隔离,E13中检测出相应的凳子上悬挂,尽管众所周知[18,19并记录在这项研究中(表2)RD细胞系是E13敏感和宽容。因此,如果最丰富的基因组有选择性地检测到在上面提到的情况下,这些差异表明,在这两种情况下最丰富的基因组在悬浮细胞培养上清液中不同。这因此证实文化RD细胞系有选择地放大一个肠病毒基因组的其他在合并感染的情况下13,14,20.),即使在这种情况下,两种肠道病毒类型属于同一物种(表2)。这个观察应该是一个有效的生物现象,可能会进一步阐明其生物学基础RD细胞系中的肠道病毒文化如何影响我们的认知血清型多样性的一个示例。此外,这也可能表明,肠病毒的动态文化RD细胞系可能并不代表发生在肠道,因此不应该如此表示。

4.2。解决混合物分析的影响

建立了肠道病毒合并感染的病例53.3% (EV-B / C = 40%: EV-B = 20%)的样品分析在这项研究。然而值得注意的是,在这些样本(表合并2),肠病毒类型确定PE-VP1-PCR试验主要是EV-Bs EV-C合并感染虽然多半特有的化验检测到的。唯一的例外是如果9,粪便悬架和RD细胞培养分离,肠病毒类型检测使用PE-VP1-PCR化验CVA1而EVB-VP1-PCR化验检测CVB4(表2)。的感知偏好PE-VP1-PCR化验EV-Bs不是因为使用的引物分析EV-Bs的偏见。事实上,类似的研究使用相同的直接测定粪便停赛没有文化RD细胞系表现出丰富的内涵价值看作[21),而那些相同的试验是直接使用粪便悬浊液中没有显示CPE RD细胞系表现出丰富的EV-Cs [12]。的优势因此,EV-Bs PE-VP1-PCR记录的分析,在这项研究中,可能是由于这样的事实,只有样品,产生了隔离在RD细胞系进行了选择和分析在这项研究中。考虑到EV-B偏差(13,14,20.RD的细胞系,这也许不足为奇。然而这个观察表明,在涉及不同的肠道病毒合并感染的情况下物种,检测所有在场的肠病毒的几率在示例将更有可能增强的种特异性引物PCR协议。然而,对于同一物种的成员,结合细胞培养的直接检测标本(表可能的策略选择2)。

4.3。配对样本的价值

收集两个粪便样本的需要和价值(成对样品)24小时除了任何AFP病例都盘踞在GPEI肠病毒检测协议(4,9]。这项研究的结果进一步强调这一原则对肠道病毒监测的重要性。例如,它是观察到E13和E19在案例1中发现只有E19被确认,以防1 b。同时,E7和EVC99检测到2,E14灯头除了E7和EVC99检测2 b。更重要的是,发现E13 5,虽然没有发现肠病毒以防5 b(表2)。因此,这项研究的结果进一步证明,没有配对样本,许多肠道病毒感染会被错过。因此,我们建议这个原理实现对肠道病毒监测一般,不仅对急性弛缓性麻痹监测。

4.4。肠道病毒检测算法和设施的风险相关的脊髓灰质炎病毒逃脱后控制

我们已经表明,细胞培养相关的(4和独立9)协议推荐的人肠道病毒检测不可避免偏见的感知肠病毒的多样性类型出现在一个示例(表2和3)。我们还展示了Pan-Enterovirus rt - pcr检测试验的缺点是基于错误的假设:合并感染肠病毒感染正在考虑时并不重要。尽管预期需要防止设施相关的风险逃避的脊髓灰质炎病毒在怎么强调都不为过,这项研究的结果表明,enterovirologists应该试图最大化的好处可用的策略,以更好地描述肠道病毒的多样性在任何感兴趣的样品。

另一方面,工作应该放在扩大物种(22]或[血清型23)具体nextgen测序策略已经被开发以适应其他肠道病毒类型和物种。他们还必须扩大到超出使用隔离恢复从细胞培养到直接检测从临床标本。这样的发展可能会促进成功的从细胞培养相关的切换到独立策略不必失去广度和敏感性。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突的存在。此外,任何信息,可以用来把隔离分析在这项研究中,任何个人都包含在这个手稿。

作者的贡献

t . o . c . Faleye m . o . Adewumi和j·a·阿德尼吉进行研究设计。所有作者进行样本采集和实验室和数据分析。所有作者写道,修订、阅读和批准了最终稿的手稿。

确认

作者感谢国家脊灰实验室在伊巴丹,尼日利亚,提供匿名隔离在这个研究分析。这项研究是由作者的贡献。

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