耐碳青霉烯金属- β -内酰胺酶表型检测鲍曼不动杆菌在巴基斯坦的儿科患者中被隔离

摘要

耐药答:baumannii已成为一种重要的、有问题的人类病原体，因为它是几种感染的病原体，特别是在新生儿和免疫功能低下的患者中，因为他们对抗感染的能力最小。碳青霉烯类抗生素被用作治疗这些感染的最后手段，但目前由于MBL的生产，对碳青霉烯类抗生素的耐药性正在上升。本研究的目的是确定抗生素耐药的频率答:baumannii比较复合纸片试验和双纸片协同试验检测金属-内酰胺酶的效果。总计112答:baumannii采用柯比-鲍尔纸片扩散法进行药敏分析。112株分离株中，66株(58.9%)对亚胺培南和美罗培南(OXOID)同时耐药。对耐药菌株进行碳青霉烯酶生产试验，经改良霍奇试验发现55株(83.3%)产碳青霉烯酶。这些分离菌进一步通过联合磁盘试验和双磁盘协同试验进行MBL生产试验。66株中49株CDT和DDST检测均为阳性，只有1株为阴性(kappa值= 0.038)。所有MBL产生菌对头孢菌素类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类和哌拉西林/他唑巴坦(OXOID)均表现出明显的耐药性。抗生素耐药性非常高答:baumannii它们是从巴基斯坦专门接受肾脏科治疗的儿童中分离出来的。

1.介绍

答:baumannii是一种多形性需氧菌革兰氏阴性菌。它是一种不活动的、被包裹的、非乳糖发酵的革兰氏阴性球菌[1］．它是属中最重要的一种不动杆菌它已经成为全球耐多药的医院感染病原体之一[2］．医院感染是对患者安全的主要挑战，是美国第六大死亡原因[3.］．

答:baumannii引起广泛的感染，如通风性相关肺炎、败血症、尿路感染、伤口感染和脑膜炎，特别是在免疫功能低下和住院患者中[3.］．碳青霉烯类常被用作治疗多药耐药菌株引起的严重医院感染的最后手段抗生素[4］．虽然抗生素耐药性是由多种机制引起的，但由于碳青霉烯水解酶对碳青霉烯类抗生素的耐药性目前是一个全球性问题[5］．

碳青霉烯酶按Ambler分子分类分为A、B、D类，称为碳青霉烯酶。而B类碳青霉烯酶则需要一个或两个锌离子才能发挥其全部催化活性，因此这些酶被称为MBLs [6］．MBLs被认为比其他耐药机制更重要，因为它们几乎可以水解所有的-内酰胺抗生素[7］．目前尚无临床批准的MBL抑制剂，使这些酶对人类健康构成严重威胁[8］．MBL编码基因可以通过水平基因转移的机制很容易从一个细菌传播到另一个细菌[7］．

MBL行列式似乎是普遍的在印度次大陆和印度70 - 90%的人口可能携带MBL生产商而在巴基斯坦27.1%的人口可能携带MBL生产者和洲际MBL产生物种的传播已经承认在欧洲,澳大利亚,非洲(9，10］．目前已知至少有20个物种表达MBLs，尤其是肠杆菌科的大多数成员大肠杆菌，Klebsiella肺炎，答:baumannii，脆弱拟杆菌，气单胞菌属hydrophila，Stenotrophomonas maltophilia，粘质沙雷氏菌，和绿脓假单胞菌［11］．

本研究的目的是定量分析黄斑病菌的抗性模式答:baumannii检测碳青霉烯酶和MBL的产生频率答:baumannii从而改进治疗并启动有效的感染控制措施。

2.材料和方法

本描述性横断面研究于2014年7月至2014年12月在拉合尔儿童医院微生物科和儿童健康研究所进行。总计112答:baumannii从包括尿液、血液、痰液、脓液、体液和气管分泌物的临床标本中回收，并进行培养。殖民地的嫌疑答:baumannii通过革兰氏染色、菌落形态、氧化酶阴性反应和API 20E鉴定。进一步筛选对碳青霉烯耐药的菌株，分别用MHT、DDST和CDT生产碳青霉烯酶和MBL。

2．1．抗菌药物敏感性

采用柯比-鲍尔纸片扩散法(Kirby-Bauer Disk Diffusion method)进行抗生素敏感性试验，确定被试菌的敏感性模式(见表1)1)．检测了不同的OXOID抗生素，包括阿米卡星(AK)、庆大霉素(CN)、头孢呋辛(CXM)、头孢呋辛(CFM)、头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)、头孢曲松(CRO)、舒巴坦/头孢哌酮(SCF)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)、莫西沙星(MOX)、美罗培南(MEM)、亚胺培南(IPM)、硫酸粘菌素(CT)、和哌拉西林/ tazobactam (TZP)。

2．2.改良霍奇测验(MHT)

对所有耐碳青霉烯类菌株进行MHT检测碳青霉烯酶。ATCC的暂停大肠杆菌25922与0.5 McFarland标准品在5ml无菌盐水中使用直接菌落悬液进行比较。将4.5 mL无菌生理盐水移液到无菌管中。然后取0.5 mL ATCC大肠杆菌将25922悬液加入4.5 mL生理盐水中，1:10稀释。稀释写明ATCC大肠杆菌25922接种于含有70的Mueller Hinton (MH)平板μg/mL硫酸锌，然后用无菌棉签在整个盘子上划线。一个10μ将g美罗培南易感盘置于MH平板中心。然后测试生物体，阳性对照(Klebsiella肺炎ATCC BAA-1706)及阴性控制(Klebsiella肺炎ATCC BAA-1705)，从美罗培南盘边缘至平板边缘划直线，在35°C±2°C环境空气中孵育16-20小时。碳青霉烯酶的产生是通过ATCC的增强来检测的大肠杆菌25922沿着试验生物体生长，显示一个三叶草状的凹痕，这表明试验是阳性的。

2．3.组合磁盘测试(CDT)

CDT检测耐碳青霉烯类革兰氏阴性菌MBLs表型。将46.53 g EDTA·2H二钠溶解，制得0.5 M浓度的EDTA溶液₂在250ml蒸馏水中加入O，用氢氧化钠调至pH 8.0 [12］．这种混合物用高压灭菌法灭菌。两个十μG inipenem磁盘被置于mh agar和4 μ将L的EDTA溶液加到其中一个溶液中，得到所需的浓度。在35°C孵育16 ~ 18小时后比较亚胺培南和亚胺培南- edta片的抑制区。在CDT中，亚胺培南- edta膜片与单独亚胺培南膜片相比，增加的抑制区≥7 mm，被认为是MBL阳性[13］．

2．4．双盘协同测试(DDST)

根据Lee等人的研究进行了亚胺培南- edta DDST [14］．通过溶解29.4 g EDTA·2H制备0.1 M的EDTA溶液₂在250ml蒸馏水中加入O，用氢氧化钠调至pH 8.0 [12］．这种混合物用高压灭菌法灭菌。制备匹配0.5麦克法兰浊度的试验菌直接菌落悬液，接种于国家临床实验室标准委员会推荐的MH琼脂平板上(CLSI, 2013) [15］．一张空白滤纸磁盘，内含10张滤纸μL EDTA放置于距亚胺培南中心20mm处。比较了亚胺培南和空白圆盘在EDTA作用下的抑菌效果。在亚胺培南和EDTA盘之间区域的抑制区增强，与药物远侧的抑制区相比，被解释为阳性结果[14］．

3.结果

66例(58.9%)出现碳青霉烯耐药。答:baumannii采用柯比-鲍尔纸片扩散法对112株临床分离菌株进行检测。对这些耐碳青霉烯菌株进行MHT产碳青霉烯酶检测，其中55株(83.3%)产碳青霉烯酶(图)1)．

对碳青霉烯耐药菌株进行MBL生产检测，其中CDT检测阳性63株，DDST检测阳性51株(图)2)．

66株耐药菌株中，49株(74.2%)来自男性患者。以新生儿和婴儿为主，分别有17例(25.8%)和16例(24.2%)发生MBLs。从其他年龄组中分离出的MBL株较少(图)3.)．

产生MBL的菌株主要来源为尿液(14株)(21.2%)，其次为血液(12株)(18.2%)、气管分泌物(9株)(13.6%)、脑脊液(6株)(9.1%)、脓液(5株)(7.6%)、腹膜透析导管(5株)(7.6%)、伤口拭子(4株)(6.1%)、中心静脉尖(4株)(6.1%)、胸膜液(2株)(3.0%)、气管内管(2株)(3.0%)。痰(1)(1.5%)。

最大数量的答:baumannii从不同病房分离的病例如下:肾科15例(22.2%)，其次是心脏科12例(18.2%)，外科9例(13.6%)，重症监护室7例(10.6%)，肿瘤科7例(10.6%)，医疗单元7例(10.6)，新生儿病房5例(7.6%)，神经内科4例(6.1%)。

总结果显示，在产生MBL的患者中，观察到11例(16.7%)死亡答:baumannii。治疗成功出院53例(80.3%)，不遵医嘱出院2例(3.0%)。

4.讨论

Hussein et al.(2013)在一项研究中观察到碳青霉烯耐药的频率，其中(58.26%)分离株对美罗培南和亚胺培南同时耐药。MHT对耐美罗培南菌株进行产碳青霉烯酶筛选，83.3%为产碳青霉烯酶菌株，与本研究一致[16］．Kumar等人(2011)报道MHT检测的分离株中71%为碳青霉烯酶生产者[17］．这也与Lee等人(2003)在韩国报道的结果一致，其中73%的分离株经MHT检测呈碳青霉烯酶阳性[14］．

进一步筛选耐美罗培南菌株用于生产MBL。CDT阳性95.4%，DDST阳性77.2%。Pandya等人(2011)的类似研究显示，96.30%的分离株CDT呈MBL阳性，81.4%的分离株DDST呈MBL阳性[18］．目前的研究结果也与Irfan等人(2008)在卡拉奇Aga Khan大学进行的研究结果相关，其中96.6%的碳青霉烯耐药菌株是CDT产生MBL的[19］．与Noori等(2014)的研究结果相似，CDT检测出86.8%的分离株为MBL生产株[7］．

目前的研究表明，大多数MBL产生答:baumannii是从新生儿中分离出来的。Begum等人(2013)在伊斯兰堡大学Quaid-i-Azam进行了一项研究，42.85%的新生儿发生了多药耐多药引起的感染答:baumannii．男性占74.2%，女性占25.8% [20.］．Alm-El-Din等人(2014)的一项研究报告称，男性(51.5%)多于女性(48.8%)[21］．Islahi等人(2014)也观察到男性(76.0%)的医院感染比例高于女性(23.9%)[22］．Peymani等人(2011)进行的一项研究也得出了类似的结果，其中72%为男性患者，28%为女性患者[23］．

最常见的感染部位是尿路感染(21.2%)，其次是血液感染(18.2%)和呼吸道感染(13.6%)。结果与其他报道呼吸道感染是常见感染部位的研究不同。Noori等人(2014)发现MBL产生的百分比最高答:baumannii呼吸道标本(52.8%)，其次是尿液(26.9%)和血液(7.4%)[7］．de Carvalho等人(2013)的另一项研究表明，最常见的隔离部位是气管分泌物(56.3%)，其次是导管尖端(16.9%)、血液(7%)和尿液(7%)[24］．不同病人的感染部位不同，这可能与介入治疗的类型有关。

Sunenshine等人(2007)对MDR感染患者进行了回顾性分析答:baumannii其中感染患者的死亡率为26%这与目前研究的死亡率16.7%非常接近[25］．Kumar等人(2012年)进行了一项类似的研究，研究了多药耐多药导致的死亡率答:baumannii为16.6% (26］．

感染产生MBL的患者的频率答:baumannii肾内科(22.2%)较高，其次是心内科(18.2%)、外科(13.6%)和重症监护室(10.6%)，与其他研究结果不同。Mahajan等人(2011)在Jalandhar的一家三级护理医院进行了一项前瞻性研究，发现重症监护室的比例最高(42.8%)，其次是外科、内科和肾病[27］．根据Muthusamy和Boope(2012)的研究，35%属于ICU，其次是神经外科(19%)、神经内科(12%)、外科(8%)和肾内科(5%)[3.］．

目前的研究表明，所有MBL生产企业对所有抗菌剂(β -内酰胺类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类)的耐药性都很高，从71.2%到100%，对哌拉西林/他唑巴坦的耐药性也达到83.3%。所有MBL生产答:baumannii表现出15.2％的耐硫酸盐硫酸盐和18.2％至氨基酰胺/头孢唑酮。本研究表明，Colistin硫酸盐和苏术酰胺/头孢唑酮是治疗MDR最有效的药物答:baumannii．Islahi等人(2014)确定了一种抗性模式不动杆菌在住院病人中发现的物种他们的研究显示，84.7%的菌株对阿米卡星耐药，对庆大霉素耐药，对头孢曲松和头孢噻肟耐药，对环丙沙星耐药，对环丙沙星耐药，对硫酸粘菌素耐药，对舒巴坦/头孢哌酮耐药，耐药32.7% [22］．Jaggi等人(2012)的一项研究也发现了类似的结果，90.3%的人对阿米卡星耐药，对庆大霉素耐药85.8%，对头孢他啶耐药92.1%，对哌拉西林耐药89.7%，对环丙沙星耐药91.6%，对左氧氟沙星耐药87.6%，对粘菌素耐药1.2% [28］．Noori等人(2014)报道95.4%的菌株对头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦耐药，1.8%对硫酸粘菌素耐药[7］．

5.结论

目前的研究表明碳青霉烯耐药人群存在高水平的多重抗生素耐药鲍曼不动杆菌2014年在巴基斯坦评估的小儿肾病患者分离株。对细菌中金属- β -内酰胺酶的多种表型检测方法的比较表明，联合圆盘试验提供了最高的阳性率。

附加分

该研究表明MBL生产中存在高水平的抗生素耐药性鲍曼不动杆菌特别是与巴基斯坦儿童肾病患者有关的。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

致谢

提交人感谢巴基斯坦拉合尔儿童医院和儿童健康研究所的管理和伦理委员会为他们提供各种设施和伦理批准。

参考

1. E. B. Bérézin和K. J. Towner，”不动杆菌作为医院病原体的sp .:微生物学、临床和流行病学特征临床微生物学检查，第9卷，第5期。2，第148-165页，1996。视图:谷歌学者
2. P. Singla, R. Sikka, A. Deep，和U. Chaudhary，“碳青霉烯耐药菌株MBLs的表型检测和流行不动杆菌印度北部一家三级护理医院的物种国际制药与生物科学杂志， vol. 2, pp. 2278-5221, 2013。视图:谷歌学者
3. D. Muthusamy和A. Boope，“检测碳青霉烯耐药菌株中各种β -内酰胺酶的表型方法不动杆菌baumanii在南印度的一家三级护理医院中国临床与诊断研究杂志CHINESE，第6卷，第2期6, pp. 970-973, 2012。视图:谷歌学者
4. K. L. Shobha, P. R. Lenka, M. K. Sharma, L. Ramachandra, and I. Bairy， " Metallo-β内酰胺酶生产中假单胞菌物种和不动杆菌卡纳塔克邦沿海的物种，”中国临床与诊断研究杂志CHINESE，第3卷，第2期。5, pp. 1747-1753, 2009。视图:谷歌学者
5. H. Kabbaj, M. Seffar, B. Belefquih etal .，“金属的流行-β-lactamases生产鲍曼不动杆菌在摩洛哥医院"ISRN传染病文章编号:154921,3页，2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
6. S. R.施莱辛格、M. J.拉豪斯、T. O.福斯特和s - k。——金属金。β- 酰胺酶和基于适体的抑制作用“药品，第4卷，第4期。2，页419-428,2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. M. Noori, A. Karimi, F. Fallah等人，“金属-内酰胺酶生产的高患病率鲍曼不动杆菌被伊朗德黑兰两家医院隔离"儿科传染病档案，第2卷，第2期3、文章编号e15439, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. D. King和N. Strynadka，“新德里金属的晶体结构-β-内酰胺酶揭示了抗生素耐药性的分子基础，”蛋白质科学，第20卷，第2期。9, pp. 1484-1491, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. J. D. Perry, S. H. Naqvi, I. A. Mirza等，“粪便携带的患病率肠杆菌科在巴基斯坦军队医院使用NDM-1碳青霉烯酶，并评估两种显色介质，”抗菌化疗杂志第66期10、文章编号dkr299, pp. 2288-2294, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. M. M. D'Andrea, C. Venturelli, T. Giani等人，“耐多药持续携带和感染大肠杆菌ST405生产NDM-1碳青霉烯酶:意大利首例病例报告临床微生物学杂志，第49卷，第49期。7, pp. 2755-2758, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. Liu Z.， Li W.， Wang J. et al.，“Identification and characterization of the first .大肠杆菌中国携带NDM-1基因的菌株《公共科学图书馆•综合》，第8卷，第2期6、Article ID e66666, pp. 1-6, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. S. B. Prajapati, M. M. Vegad, S. J. Mehta, K. M. Kikani, M. N. Kamothi，和J. M. Pandya，“两种不同表型方法检测金属-的评估β内酰胺酶生产假单胞菌隔离。”细胞与组织研究杂志，第11卷，第5期。1, pp. 2601-2604, 2011。视图:谷歌学者
13. D. Yong, K. Lee, J. H. Yum, H. B. Shin, G. M. Rossolini, Y. Chong，“亚胺培南- edta磁盘法在金属鉴别中的应用”β-内酰胺酶产生的临床分离假单胞菌种虫害和不动杆菌spp。”临床微生物学杂志，第40卷，第5期。10，第3798-3801页，2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. K. Lee, Y. S. Lim, D. Yong, J. H. Yum, and Y. Chong，“Hodge测试和亚胺培南- edta双盘协同测试对鉴别金属的评价β-lactamase-producing隔离的假单胞菌种虫害和不动杆菌spp。”临床微生物学杂志号，第41卷。10，第4623-4629页，2003。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. 临床和实验室标准协会(CLSI)，“抗菌药物敏感性测试的性能标准;第23条信息补充，“Tech rep M100-S23, CLSI, Wayne, Pa, USA, 2013。视图:谷歌学者
16. H. N. Hussein, J. F. H. Al-Mathkhury, and A. M. Sabbah，“亚胺培南抗性鲍曼不动杆菌在巴格达与病人和医院隔离"伊拉克科学杂志第54卷第5期4, pp. 803-812, 2013。视图:谷歌学者
17. a . V. Kumar, V. S. Pillai, K. Dinesh, and S. Karim，“南印度一家三级护理医院对美罗培南耐药钙乙酰鲍曼不动杆菌的碳青霉烯酶表型检测”，中国临床与诊断研究杂志CHINESE，第5卷，第5期。2, pp. 223-226, 2011。视图:谷歌学者
18. P. N. Pandya, B. S. Prajapati, J. S. Mehta, M. K. Kikani, and J. P. Joshi，“革兰氏阴性杆菌中MBL (MBL)产生的各种检测方法的评价”，国际生物医学研究杂志，第2卷，第2期3，第775-777页，2011。视图:谷歌学者
19. S. Irfan, A. Zafar, D. Guhar, T. Ahsan，和R. Hasan，“金属-β-内酰胺酶产生的临床分离不动杆菌物种和铜绿假单胞菌来自三级护理医院重症监护病房的病人印度医学微生物学杂志第26卷第2期3，页243 - 245,2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. S. Begum, F. Hasan, S. Hussain和A. A. Shah，“多重耐药性的流行鲍曼不动杆菌在巴基斯坦伊斯兰堡三级护理医院的临床样本中，巴基斯坦医学科学杂志，第29卷，第2期5，第1253-1258页，2013。视图:谷歌学者
21. A. R. Alm-El-Din, H. El-Bassat, M. El-Bedewy，和H. El-Mohamady，“金属的流行-β耐碳青霉烯的-内酰胺酶生产者鲍曼不动杆菌从糖尿病足溃疡中分离出来的菌株非洲微生物学研究杂志，第8卷，第2期15, pp. 1580 - 1585,2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. S. Islahi, F. Ahmad, V. Khare等人，“疟疾的流行和耐药性模式不动杆菌在三级护理中心的住院病人中发现的物种医学和牙科科学进化杂志，第3卷，第2期。17, pp. 4629-4635, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. a . Peymani M.-R。Nahaei, S. Farajnia等人，“金属- β -内酰胺酶生产的高患病率鲍曼不动杆菌在伊朗大不里士的一家教学医院"日本传染病杂志号，第64卷。1, pp. 69-71, 2011。视图:谷歌学者
24. R. M. L. de Carvalho, S. G. Marques, L. H. B. Gonçalves, A. G. Abreu, S. G. Monteiro, and A. G. Gonçalves，“金属-的表型检测β-lactamases在铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌与巴西Maranhão州São Luis的住院患者隔离，”Brasileira de Medicina热带医学俱乐部第46卷，第46期4, pp. 506-509, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
25. r。h。阳光，m.o。Wright, L. L. Maragakis等人，“多重耐药不动杆菌感染死亡率和住院时间新发传染病，第13卷，第2期1，页97-103,2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
26. S. H. Kumar, A. S. De, S. M. Baveja, M. A. Gore，“金属流行率和危险因素β内酰胺酶生产铜绿假单胞菌和不动杆菌三级护理医院烧伤和外科病房的物种实验室医生杂志，第4卷，第4期。1, pp. 39-42, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
27. G. Mahajan, S. Sheemar, S. Chopra, J. Kaur, D. Chowdhary，和S. K. Makhija，“碳青霉烯酶在临床分离株中的耐药和表型检测鲍曼不动杆菌”,印度医学科学杂志，卷。65，不。1，pp。18-25，2011年。视图:出版商的网站|谷歌学者
28. N. Jaggi, P. Sissodia和L. Sharma，鲍曼不动杆菌三级护理医院的分离株、抗菌素耐药性和临床意义微生物学与传染病杂志，第2卷，第2期2，页57-63,2012。视图:谷歌学者

版权

版权所有©2016 Muneeza Anwar等人。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。